O ștergere a cinci aminoacizi în NKCC2 a șoarecilor C57BL/6 afectează analiza fosforilării NKCC2, dar nu afectează funcția rinichilor

edmund.chen@wecistanche.com

INTRODUCERE

Membrul ascendent gros (TAL) al mamiferuluirinichieste crucial pentru controlul volumului lichidului extracelular, al concentrației urinare, al homeostaziei calciului (Ca 2 plus ) și magneziului (Mg 2 plus ), precum și al echilibrului pH-ului. 1 Principala cale de transport Na plus în TAL este cotransportatorul Na plus - K plus - 2Cl - (NKCC2), care este inhibat în mod specific de ansă-diuretice. 1 Cotransportul ionilor de Na plus, K plus și 2Cl− prin NKCC2 este electroneutr, dar depinde de secreția electrogenă de K plus prin intermediul apical. renalmedulara exterioară K plus canalul ROMK. 2 Interacțiunea dintre NKCC2 și ROMK creează un gradient electrochimic lumen pozitiv, care îmbunătățește reabsorbția Na plus și conduce transportul paracelular al Ca 2 plus și Mg 2 plus. 3 Semnificația NKCC2 pentru TAL șifunctia rinichiloreste exemplificat de sindromul Bartter de tip I, o tulburare genetică cauzată de mutații cu pierdere a funcției în NKCC2, care se manifestă curenalpierderea de sare și lichide, alcaloză metabolică hipokaliemică și hipercalciurie. 3

NKCC2 este membru al familiei 12 de purtători de substanțe dizolvate (Slc12) a proteinelor de transport membranar care include, de asemenea, NKCC1 exprimat în mod ubicuu și tubul contort distal (DCT) specific Na plus - Cl - cotransportor (NCC). 2 Activitatea NKCC2 se corelează pozitiv cu fosforilarea cotransportatorului la mai multe resturi de serină și treonină de pe coada N-terminală citoplasmatică. 4 Secvențele de aminoacizi din jurul acestor situsuri de fosforilare sunt foarte conservate și prezintă un grad ridicat de similitudine între NKCC2, NKCC1 și NCC. 2 Fosforilarea NKCC2 este stimulată de mai multe căi hormonale și non-hormonale. Hormoni precum arginina vasopresina (AVP) și angiotensina II (ANGII) stimulează NKCC2 prin producția crescută de AMPc și activarea proteinei kinazei A (PKA). 5 PKA se crede că fosforilează direct NKCC2 la Ser126, ceea ce sporește exocitoza veziculelor care conțin NKCC2 și, prin urmare, abundența transportorului în membrana plasmatică apicală. 6 De asemenea, modificările concentrațiilor intracelulare de clorură reglează fosforilarea NKCC2. O concentrație scăzută de Cl-tracelular stimulează kinazele fără lizin(K) WNK1 și WNK4 să fosforileze și să activeze kinazele din aval Ste20- legate de prolină alanin kinaza bogată (SPAK) sau kinaza 1 sensibilă la stresul oxidativ (OXSR1). ). 7- 9 După legarea la un motiv „RFxV” în NKCC2, aceste kinaze apoi fosforilează NKCC2 la două resturi de treonină (T96 și T101). 2 Defosforilarea acestor reziduuri este mediată de fosfatază calcineurină, subliniind faptul că NKCC2 este o țintă pentru mai multe căi de semnalizare. 10

Pentru a studia funcția NKCC2, mai multe grupuri, inclusiv a noastră, au dezvoltat anticorpi specifici fosfoformei împotriva Thr96 și/sau Thr101. 11- 17 Anticorpii au fost utilizați pentru a evalua fosforilarea NKCC2 în sistemele de expresie heterologe 7,11,17,18,19,20 și modele animale, inclusiv șobolani 10,21,22,23,24,25 și șoareci. 14,15,16,17,19,26,27 Cu toate acestea, când am folosit anticorpul nostru pT96/101 NKCC2, am obținut rezultate inconsistente în diferitele noastre modele de șoarece. Deși am detectat semnale pNKCC2 puternice în rinichi de la șoareci într-un fundal genetic de 129Sv, nu am obținut semnale pNKCC2 fiabile în rinichi de la șoareci C57BL/6, dar am observat o reactivitate încrucișată a anticorpilor pNKCC2 cu pNCC. Alte laboratoare, inclusiv cele de la JA McCormick și AA McDonough (comunicare personală) au făcut observații similare. 18,28,29 În plus, diferențe izbitoare de tulpină au fost descrise la șoareci pentrurenalfuncția 30 incluzând semnificativ mai scăzută Ca2 urinar plus excreție la C57BL/6 comparativ cu șoarecii 129Sv. 31 Prin urmare, am emis ipoteza că șoarecii C57BL/6 exprimă o variantă genetică a NKCC2 care influențează fosforilarea NKCC2 și posibilfunctia rinichilorcare explică diferențele de tulpină observate. Următorul studiu a fost conceput pentru a testa sistematic această ipoteză.

Cuvinte cheie:homeostazia ionică, rinichi, NKCC2, fosforilare, diferențe de tulpină

REZULTATE

2.1|Șoarecii C57BL/6 au o deleție de cinci aminoacizi în NKCC2 care interferează cu detectarea NKCC2 fosforilatÎn primul rând, am aliniat pentru mai multe specii secvențele de aminoacizi N-terminali publicate (ID-urile de transcripție în tabelul S1) ale NKCC2 și NCC (Figura 1A, B, respectiv) care corespund epitopilor recunoscuți de anticorpii anti-pNCC și anti-pNKCC. (Figura 1C). Alinierea a confirmat gradul ridicat de conservare a situsurilor de fosforilare ale NKCC2 și NCC 7, ceea ce explică probabil reactivitatea încrucișată a anticorpilor pNKCC2 și pNCC observați de noi și de alții. 18,28,29 În mod interesant și în concordanță cu ipoteza noastră, alinierea a relevat, de asemenea, o ștergere a cinci aminoacizi neapreciată până acum în secvența NKCC2 de la șoarecii C57BL/6 (ΔF97- T101) (Figura 1A) . Secvențierea ADN-ului din două colonii diferite de șoareci C57BL/6 păstrate la The Jackson Laboratory din SUA sau Janvier Labs din Franța a confirmat o ștergere de nucleotide în exonul 2 al C57BL/6 NKCC2 care corespunde ștergerii aminoacizilor menționate mai sus (Figura S1). ,Tabelul S2).

Pentru a caracteriza impactul eliminarii celor cinci aminoacizi asupra imunodetecției NKCC2 total și fosforilat, am studiat sistematic rinichii șoarecilor C57BL/6 și 129Sv prin imunohistochimie și imunoblot. Imunofluorescența cu un anticorp împotriva NKCC2 total a arătat un semnal fluorescent puternic în membrana plasmatică apicală a TAL-urilor șoarecilor 129Sv și C57BL/6. Cu toate acestea, anticorpul nostru pT96/T101 NKCC2 dezvoltat anterior a arătat o etichetare apicală puternică a TAL-urilor numai la șoarecii 129Sv, în timp ce TAL-urile șoarecilor C57BL/6 au avut o imunocolorare foarte slabă (Figura 1D). În conformitate cu aceasta, analiza Western blot a relevat o bandă puternică pentru NKCC2 total la ambele tulpini de șoareci, în timp ce anticorpul pT96/T101 NKCC2 a detectat o bandă puternică la dimensiunea așteptată (170 kDa) numai la șoarecii 129Sv (Figura 1E). În schimb, rinichii șoarecilor C57BL/6 au dezvăluit o bandă la 130 kDa care corespunde mărimii așteptate a NCC (Figura 1E). Rezultate similare au fost obținute cu alți anticorpi utilizați anterior pentru a studia fosforilarea NKCC2 (Figura S2). Anticorpul pT212/T217 NKCC1 R5 11 a arătat în plus față de semnalul pNCC un semnal slab la dimensiunea așteptată pentru pNKCC2 (Figura S2). Banda imunoreactivă pentru pNKCC2 a devenit mai intensă când este proaspătărinichis-au folosit lizate. Utilizarea unui tampon de liză cu detergenți (tampon RIPA) nu s-a îmbunătățit, dar a diminuat intensitatea semnalului (Figura S3).

FIGURA 1 Anticorpul pT96/T101 NKCC2 nu detectează un semnal pNKCC2 vizibil la șoarecii C57BL/6. A, alinierea secvenței de aminoacizi NKCC2 a diferitelor specii și a celor două tulpini de șoarece 129Sv și C57BL/6. ID-urile secvenței NKCC2 pentru diferitele specii sunt listate în Tabelul S1. Regiunea foarte conservată care corespunde Thr96 murin la Thr101 murin este marcată cu gri. B, Alinierea secvenței de aminoacizi a NCC la diferite specii. ID-urile secvenței NCC pentru diferitele specii sunt listate în Tabelul S1. C, Lista epitopilor de anticorpi utilizați și publicati în mod obișnuit care recunosc pT53 sau pT58NCC, precum și pNKCC2 la locusul conservat din jurul Thr96 la Thr101. D, Imunocolorarea totală și pT96/T101 NKCC2 în crio-secțiuni consecutive de șoareci cu fundal 129Sv și C57BL/6. Bară de scară=50 µm. E, Imunoblot total și pT96/T101 NKCC2 de șoareci cu fundal 129Sv și C57BL/6. Valorile sunt medii ± SEM, n=5 șoareci per grup, săgețile verzi indică benzile specifice, în timp ce capetele săgeților roșii indică benzile nespecifice. Sunt incluși markeri de greutate moleculară. Benzile totale și pT96/T101 NKCC2 sunt de așteptat la 170 kDa. F, Immunoblots pentru total și pT96/T101 NKCC2, total și pT53 și pT58 NCC la șoarecii NCC WT și NCC knockout (KO) de diferite medii. Săgețile verzi indică benzile specifice, în timp ce capetele săgeților roșii indică benzile nespecifice. Sunt incluși markeri de greutate moleculară. Benzile totale și pT58 și pT53 NCC sunt de așteptat la 130 kDa, benzile totale și pT96/T101 NKCC2 sunt de așteptat la 170 kDa

Pentru a testa dacă anticorpul nostru pT96/T101 NKCC2 reacţionează într-adevăr cu NCC fosforilat la şoarecii C57BL/6, am testatrinichilizate de la șoareci de tip sălbatic 129Sv și C57BL/6 și șoareci knockout C57BL/6 NCC cu anticorpi împotriva NKCC2 total, pT96/T101 NKCC2, NCC total și NCC fosforilat (pT53 și pT58 NCC) (Figura 1F). Anticorpul pT96/T101 NKCC2 și anticorpii împotriva NCC total și pNCC nu au detectat benzi la 130- 170 kDa la șoarecii knockout C57BL/6 NCC (Figura 1F). Interesant, imunoblotul, precum și experimentele suplimentare de imunohistochimie (Figura S4) indică faptul că nu numai anticorpii pNKCC2 reacţionează încrucişat cu NCC la șoarecii C57BL/6, dar anticorpii noștri pNCC (pT53 NCC și pT58 NCC) reacţionează încrucişat cu NKCC2 în 129Sv. şoareci la concentraţiile utilizate.

Excreția urinară de calciu și magneziu diferă între șoarecii 129Sv și C57BL/6

Pentru a determina dacă ștergerea (F97- T101) în NKCC2 se poate asocia cu diferențe fiziologice între șoarecii 129Sv și C57BL/6, am comparat aportul de apă, nivelurile de ioni din plasmă și excreția de lichid urinar și de ioni între cele două tulpini de șoarece. După cum este rezumat în Tabelul 1, majoritatea parametrilor evaluați nu au diferit între tulpini. Cu toate acestea, șoarecii C57BL/6 au prezentat o excreție urinară mai mică de Ca2 plus și mai mare excreție urinară de Mg2 plus decât șoarecii 129Sv. Nivelurile plasmatice de Ca 2 plus și Mg 2 plus au fost similare pentru ambele grupuri, ceea ce sugerează că șoarecii erau într-o stare de echilibru la care un echilibru homeostatic al reabsorbției intestinale, mobilizării țesuturilor (de exemplu din os) șirenals-a ajuns la excreția ionilor de Ca 2 plus și Mg 2 plus. Pentru a testa dacă ratele diferite de excreție urinară de Ca 2 plus și Mg 2 plus rezultă din diferențele în absorbția intestinală a acestor ioni, am comparat aportul zilnic de alimente, debitul fecal și excreția fecală de Ca 2 plus și Mg 2 plus pentru cei doi. tulpini de șoarece. Așa cum se arată în Figura S5, aportul de hrană și cantitatea de Ca 2 fecal plus eliberat au fost similare, dar excreția zilnică de Mg 2 plus fecal a fost mai mică la șoarecii C57BL/6 decât la șoarecii 129Sv, sugerând că șoarecii C57BL/6 au o reabsorbție intestinală mai mare de Mg 2 plus. decât șoarecii 129Sv. În concordanță cu această ipoteză, șoarecii C57BL/6 au avut o expresie colonică mai puternică a canalului de magneziu TRPM6 (Figura S6), precum și o tendință la niveluri mai mari de Mg 2 plus plasmatic în comparație cu șoarecii 129Sv, deși diferențele nu au atins semnificație statistică. Pentru a evalua posibila contribuție a osului, am analizat prin micro-CT densitatea minerală osoasă în ambele tulpini. Similar cu rapoartele anterioare, 32 de șoareci C57BL/6 au avut o densitate minerală osoasă destul de scăzută (Figura S7), ceea ce poate explica de ce acești șoareci tind să conserve Ca 2 plus ioni printr-o cantitate redusă.renalCa 2 plus excreție. În concordanță cu o rată de reabsorbție de Ca 2 tubulară îmbunătățită, rinichii șoarecilor C57BL/6

au exprimat mai mult canal TRPV5 Ca 2 plus la niveluri de proteine ​​decât rinichii șoarecilor 129Sv (Figura 2). Șoarecii C57BL/6 au avut, de asemenea, o expresie a ARNm și a proteinei NCC semnificativ mai mare decât șoarecii 129Sv (Figura 2A). De asemenea, abundența proteică a NKCC2 total, NCC total și fosforilat și a total - ENaC a fost mai mare la șoarecii C57BL/6 decât la șoarecii 129Sv (Figura 2B, C). Abundența formelor clivate proteolitic și, prin urmare, active de - și - ENaC nu au fost diferite, sugerând cărenalActivitatea ENaC a fost similară pentru ambele tulpini (Figura 2B, C).

Nu există dovezi pentru o funcție alterată a membrelor ascendente groase la șoarecii C57BL/6 în comparație cu șoarecii 129Sv

Abundența mai mare de NKCC2 total, NCC total și NCC fosforilat în rinichii șoarecilor C57BL/6 poate fi un răspuns compensator pentru fosforilarea redusă a NKCC2. Pentru a testa dacă activitatea NKCC2 și NCC diferă între tulpinile de șoarece, am efectuat un test de bumetanide și, respectiv, tiazidă. O singură injecție de bumetanidă sau hidroclorotiazidă a provocat o natriureză puternică, care a fost mai pronunțată pentru bumetanidă decât pentru hidroclorotiazidă. Cu toate acestea, răspunsurile diuretice au fost complet similare la ambele tulpini, sugerând că activitățile funcționale ale NKCC2 și NCC nu au fost diferite între șoarecii C57BL/6 și 129Sv (Figura 3A-D). Aparent, abundența proteinelor și nivelurile de fosforilare nu se potrivesc neapărat cu activitățile funcționale alerenalproteine ​​de transport ionic, așa cum au subliniat recent și Hunter și colaboratorii. 33 Pentru a evalua în continuare funcția TAL, am efectuat un test de restricție de apă în care șoarecii au avut timp de 24 de ore acces la hrana umedă, dar nu la apă de la robinet. În aceste condiții, ambele tulpini de șoarece au crescut osmolaritatea urinei la valori similare (Tabelul 1). În plus, șoarecii C57BL/6 și șoarecii 129Sv au prezentat aceeași excreție urinară a uromodulinei (proteina Tamm-Horsfall) (Tabelul 1), care este produsă și excretată în urină în funcție de activitatea funcțională a celulelor TAL. 3

Încrucișarea șoarecilor 129Sv și C57BL/6 sugerează că ștergerea celor cinci aminoacizi din NKCC2 nu segrega un fenotip specific

Datele prezentate sugerează că diferențele de tulpină în excrețiile de ioni urinari șirenalabundența de proteine ​​nu este legată de ștergerea celor cinci aminoacizi din C57BL/6 NKCC2, dar este legată de alte diferențe genetice dintre cele două tulpini de șoarece. Pentru a testa acest lucru în continuare, am încrucișat șoareci 129Sv și C57BL/6 cu generația F2 în care diferențele genetice ale tulpinilor (inclusiv cele din NKCC2) ar trebui să fie aleatoriu

distribuite șoarecilor. Apoi am comparat șoarecii F2 care erau fie homozigoți pentru NKCC2 de lungime completă (f/f), homozigoți pentru ștergerea NKCC2 (Δ/Δ), fie heterozigoți pentru ștergerea NKCC2 (f/Δ). Cu excepția modelelor diferite așteptate de legare a anticorpilor specifici fosfoformei împotriva NKCC2 și NCC (și a unei diferențe neclare a expresiei ROMK la ARNm, dar nu la nivelul proteinei), niciuna dintre diferențele identificate anterior între cele două tulpini nu a fost evidentă în șoarecii f/f, Δ/Δ sau f/Δ din generația F2 (Figura 4 și Tabelul 2). În special, nu au existat diferențe în excreția urinară de Ca 2 plus sau Mg 2 plus, precum și nicio diferență în nivelurile plasmatice de Ca 2 plus sau Mg 2 plus, ceea ce sugerează că diferențele de tulpină între șoarecii 129Sv și C57BL/6 sunt independente de eliminarea celor cinci aminoacizi din NKCC2.

Un nou anticorp pT96 NKCC2 detectează pNKCC2 în ambele tulpini

Deoarece ștergerea celor cinci aminoacizi din NKCC2 împiedică detectarea fiabilă a fosforilării NKCC2 la șoarecii C57BL/6 atunci când se folosesc anticorpi disponibili, am generat un nou anticorp îndreptat împotriva fosfositului T96 la șoarecii C57BL/6. Iepurii au fost imunizați cu o fosfopeptidă care corespundea secvenței de aminoacizi a C57BL/6 NKCC2 din jurul lui T96 (YYLQ(p)TMDA). Antiserurile au fost purificate prin afinitate și caracterizate prin imunoblotting și imunohistochimie (Figura 5). Anticorpul a detectat o singură bandă la dimensiunea așteptată de 170 kDa în rinichi de 129Sv, C57BL/6 de tip sălbatic și C57BL/6 NCC.

șoareci (Figura 5A). Banda a fost clar diferită de cea detectată pentru NCC la 130 kDa. Defosforilarea 129Svrinichiprobele cu fosfatază alcalină a intestinului de vițel (CIAP) au eradicat complet semnalul obținut cu noul anticorp pT96 NKCC2, în timp ce semnalul cu anticorpul NKCC2 non-fosfoform-specific a fost vizibil în probele de control și defosforilate (Figura 5B). Interesant, fosforilarea NKCC2 a fost, de asemenea, eliminată în mare măsură cândrinichilizatele au fost incubate la 37 de grade timp de 1 oră fără CIAP (probabil din cauza activității fosfatazei alcaline endogene din tubii proximali). Experimentele de defosforilare folosind lambda fosfatază pe secțiuni consecutive de rinichi cu parafină ale șoarecilor C57BL/6 au confirmat în continuare că noul anticorp recunoaște doar NKCC2 fosforilat (Figura 5C). Mai mult, imunofluorescența pe criosecții consecutive a demonstrat că noul anticorp colorează doar membrana plasmatică apicală a TAL-urilor pozitive NKCC2-, dar nu și a DCT-urilor pozitive NCC la șoarecii 129Sv și C57BL/6 (Figura 5D), sugerând că noul Anticorpul pNKCC2 nu reacționează încrucișat cu pNCC. Această concluzie a fost, de asemenea, confirmată utilizând lizate de celule din celulele MDCKI care exprimă NKCC2 uman (hNKCC2) și NCC uman (hNCC). Imunobloturile de imunoprecipitări (IP) și lizate de celule întregi au demonstrat că noul anticorp pT96 NKCC2 recunoaște NKCC2 uman, dar nu NCC uman (Figura S8A). Interesant, deși noul anticorp a fost crescut împotriva pNKCC2 al șoarecilor C57BL/6, noul anticorp a detectat fosforilarea NKCC2 în mod echivalent în rinichii ambelor tulpini de șoarece atât prin imunohistochimie (Figura 6A) cât și prin imunoblot (Figura 6B).

Noul anticorp pT96 NKCC2 permite analiza fosforilării NKCC2 reglate

Fosforilarea și, prin urmare, activitatea NKCC2 și NCC sunt reglate de concentrațiile ionilor extracelulari. Un [Cl - ] ex scăzut crește fosforilarea NKCC2 la Thr96 și Thr101 și a NCC la Thr53 și Thr58 prin activarea căii WNK/SPAK/OSR1. 7,8,18,29,35 De asemenea, un [K plus] mare scade rapid fosforilarea NCC, dar se crede că are un efect mic sau deloc asupra fosforilării NKCC2. 12,36,37,38 Pentru a testa dacă anticorpul pT96 NKCC2 nou dezvoltat este capabil să detecteze acest tip de reglare diferențială a fosforilării NKCC2,rinichifelii de șoareci C57BL/6 au fost expuse ex vivo la 110 sau 5 mM [Cl - ] ex și, respectiv, la 3 sau 10 mM [K plus] ex. După cum era de așteptat, ex-ul scăzut [Cl - ] a crescut puternic fosforilarea NCC și NKCC2 (Figura 7A, B), în timp ce [K plus ] ex a scăzut doar fosforilarea NCC, dar nu a modificat fosforilarea NKCC2 (Figura 7C, D). La fel, noul anticorp detectat la fel de bine modificat

FIGURA 4 Nu există modificări semnificative în expresia ARNm și proteinei majorerenaltransportoare de ioni și canale din generația F2 încrucișată. A, Graficul cu bare a nivelurilor relative de expresie a ARNm în cele trei grupuri de șoareci. Toate valorile au fost normalizate la șoareci f/f. Valorile sunt medii ± SEM. B, Abundența de proteine ​​la șoarecerinichilizate de la animale din generația F2. Cele trei grupuri corespund NKCC2 de lungime completă (f/f), NKCC2 homozigot pentru deleție (Δ/Δ) sau NKCC2 heterozigot pentru ștergere (f/Δ/). Sunt incluși markeri de greutate moleculară. NKCC2 și pNKCC2 sunt așteptate la 170 kDa, NCC și pNCC la 130 kDa, TRPM6 la 260 kDa, - ENaC la 95 kDa și 34 kDa (clivat), - ENaC la 100 kDa, - ENaC la 100 kDa și 85 kDa (cleaved) , ROMK la 55 kDa (glicozilat matur), 43 kDa (glicozilat miez) și 34 kDa (neglicozilat). Săgețile verzi indică benzile specifice, în timp ce capetele săgeților roșii indică benzile nespecifice. C, Analiza densitometrică a abundenței proteinelor comparând șoarecii f/f și Δ/Δ. Intensitățile benzilor de la șoarecii Δ/Δ sunt normalizate la cele de la f/f. (Valorile sunt medii ± SEM; n=5 șoareci/grup; *P < .05,="" †="" p="">< .01,="" ‡="" p=""><>

Fosforilarea NKCC2 care a fost provocată în celulele MDCKI care exprimă NKCC2 uman (hNKCC2) sau NKCC2 de șoarece (mNKCC2(C57BL/6)) prin condiții hipotonice de clorură extracelulară scăzută (Figura S8B). Înrinichifelii incubate la 5 mM [Cl - ] ex , de asemenea, anticorpii anti-șoarece pT96/T101 NKCC2 39 descriși anterior și anti-pT212/T217 NKCC1 R5 11 umani detectează semnale slabe pentru NKCC2 și NCC, care devin mai evidente atunci când sunt încărcate mai multe proteine ​​și imunoblot-urile sunt fotografiate la setări îmbunătățite (Figura S9).

DISCUŢIE

Șoarecii C57BL/6 și 129Sv sunt două dintre cele mai frecvent utilizate tulpini de șoareci pentru cercetarea biomedicală. Genomul șoarecilor C57BL/6 a fost primul care a fost secvențiat pentru șoarecele 40 și de atunci a servit ca genom de referință pentru analiza variațiilor genetice și fenotipice între tulpinile de șoarece. 41- 44 Pentrurinichicercetare, o diferență esențială între șoarecii C57BL/6 și 129Sv se referă la exprimarea genei reninei. La fel ca și oamenii, șoarecii C57BL/6 găzduiesc o singură genă renină, în timp ce șoarecii 129Sv posedă două copii, ceea ce poate explica susceptibilitatea mai mare a acestei tulpini de șoareci la hipertensiune arterială 45,46 și leziuni hipertensive. 47 Cu acest studiu, adăugăm o altă diferență genetică importantă care trebuie luată în considerare. Descriem o ștergere neapreciată până acum a cinci aminoacizi în NKCC2 (ΔF97- T101), prezentă la C57BL/6, dar nu la șoarecii 129Sv, care interferează cu detectarea fosforilării NKCC2 cu majoritatea anticorpilor disponibili anterior, dar nu este semnificativ. impactfunctia rinichilor.

Siturile de fosforilare NKCC2 N-terminale de șoarece T96 și T101 sunt foarte conservate între specii și între NKCC2, NKCC1 și NCC (Figura 1). 48 Prin urmare, nu este surprinzător faptul că anticorpii direcționați împotriva acestor situsuri de fosforilare reacţionează încrucişat cu ceilalţi cotransportatori. Studiile anterioare au raportat că anticorpii împotriva NCC fosforilat detectează, de asemenea, NKCC fosforilat2 7,18,28,29 și că un anticorp pNKCC1 permite analiza nivelurilor de fosforilare atât ale NKCC1, cât și ale NKCC2. 11 În concordanță cu aceasta, am observat reactivitate încrucișată a anticorpilor noștri pNCC (pT53 și pT58) cu NKCC2 fosforilat și a anticorpului nostru pT96/pT101 NKCC2 cu NCC fosforilat. Cu toate acestea, reactivitatea încrucișată a anticorpilor pNCC cu NKCC2 a fost observată numai la rinichii șoarecilor 129Sv, dar nu și la rinichii șoarecilor C57BL/6. În schimb, anticorpul nostru dezvoltat anterior la NKCC2 pT96/pT101 nu a arătat niciun semnal sau, în cel mai bun caz, un semnal foarte slab pentru pNKCC2 în rinichii șoarecilor C57BL/6 și a detectat în principal NCC fosforilat la această tulpină. Acum, legăm aceste observații confuze cu o ștergere a cinci aminoacizi în NKCC2 a șoarecilor C57BL6 (ΔF97- T101). Reglarea fosforilării NKCC2 a fost studiată

s-a folosit în diferite contexte experimentale și pentru diverși stimuli, inclusiv vasopresină, 14,21,24,25,49 uromodulină 19,20,50 și inhibitori ai calcineurinei. 10,26 În timp ce majoritatea studiilor au fost efectuate în sisteme de expresie heterologe 10,19,20,25,50 sau la șobolani 10,24 și șoareci 19,26 care exprimă NKCC2 de lungime completă, unele studii au fost efectuate și la șoareci C57BL/6. 7,18,27,28,29,51 După cum raportăm aici, șoarecii C57BL/6 exprimă o variantă NKCC2 cu o ștergere a cinci aminoacizi care interferează cu detectarea corectă a fosforilării NKCC2 și care prezintă riscul ca standardul pT96/T101 NKCC2 anticorpii și anticorpul R5 anti fosfo-NKCC1 reacţionează încrucişat cu NCC fosforilat cel puțin în condițiile folosite în munca noastră. Nu este posibil să se judece impactul acestei reacții încrucișate asupra concluziilor experimentale anterioare, dar conform observațiilor noastre, datele de la șoarecii C57BL/6 ar trebui revizuite și interpretate cu prudență. În ciuda faptului că ștergerea celor cinci aminoacizi a avut un impact puternic asupra detectării fosforilării NKCC2, nu avem dovezi că ștergerea afectează în mod semnificativ activitatea funcțională a cotransportatorului. Șoarecii C57BL/6 au avut într-adevăr o excreție urinară de Mg 2 plus excreție urinară mai mare și Ca 2 urinară plus excreție 31 mai mică decât șoarecii 129Sv, dar am constatat că aceste diferențe probabil nu sunt legate de un transport paracelular alterat al acestor cationi de-a lungul TAL, dar sunt rezultatul unei creșteri a absorbției de Mg2 dependent de TRPM6- plus absorbția în intestin și a unei creșteri a Ca2 dependent de TRPV5- plus reabsorbție în DCT2 și CNT. Acesta din urmă determină un echilibru pozitiv de Ca 2 plus care poate ajuta la creșterea densității minerale osoase scăzute a șoarecilor C57BL/6. Constatarea că șoarecii C57BL/6 și 129Sv arată același lucrurenalrăspunsurile la diureticele de ansă și tiazidice și la restricția de apă sugerează în continuare că ștergerea celor cinci aminoacizi din NKCC2 nu afectează semnificativ funcția TAL. Cel mai important, șoarecii din generația F2 de șoareci încrucișați C57BL/6 și 129Sv au acelașirenalfenotip independent de dacă șoarecii exprimă lungimea completă (f/f) NKCC2 sau NKCC2

homozigot (Δ/Δ) pentru deleție. Aceste observații la șoareci sunt în concordanță cu datele funcționale anterioare din sistemele de expresie heterologe. În timp ce mutațiile reziduurilor individuale în NKCC1 (T217 la om, T211 la șoarece) sau NCC (T60 la om, T58 la șoarece) elimină activitatea acestor cotransportatori, mutațiile reziduului corespunzător în NKCC2 (T105 la om, T101 la șoarece). ) au un efect destul de mic sau chiar deloc asupra liniei de bază și au stimulat activitatea NKCC2. 35,52,53 Chiar și atunci când ambele reziduuri de treonină din NKCC2 sunt mutate în alanină, activitatea funcțională a NKCC2 atinge încă ~ 70% din activitatea maximă, 35 sugerând că fosforilarea acestor situsuri este indicativă, dar nu esențială pentru activitatea NKCC2.

Locurile de fosforilare sunt adesea omoloage între proteine. Prin urmare, problema reactivității încrucișate a anticorpilor specifici fosfoformei nu este unică pentru anticorpii direcționați împotriva NCC, NKCC2 și NKCC1 fosforilați, dar a fost raportată și pentru alte proteine, cum ar fi kinazele dependente de ciclină 1 și 2 54 și extracelulare. kinazele 1 și 2 reglate de semnal. 55 În mod constant, ori de câte ori sunt utilizați anticorpi specifici stării de fosforilare, sunt necesare controale experimentale riguroase pentru a confirma specificitatea semnalelor detectate. Aceasta poate include (a) confirmarea faptului că anticorpul folosit detectează proteina la greutatea moleculară așteptată (imunoblotting) și/sau la localizarea celulară și subcelulară așteptată (imunofluorescență), (b) verificarea faptului că anticorpul interacționează în mod specific cu epitopul fosforilat prin folosind teste de competiție cu peptidele fosforilate și nefosforilate și (c) demonstrarea faptului că

anticorpul este fosfoform specific prin compararea probelor de țesut fosforilat și defosforilat. Aceste controale ar putea fi completate de controale genetice care includ testarea țesuturilor de la animale knockout și/sau celule care exprimă heterolog proteina de interes. În studiul de față, am folosit abordările menționate mai sus pentru a caracteriza în detaliu un nou anticorp pT96 NKCC2 care detectează NKCC2 fosforilat înrinichiprobe de la șoareci C57BL/6 și 129Sv la fel de bine. Anticorpul este specific fosfoformei și nu prezintă reactivitate încrucișată aparentă cu NCC fosforilat în niciuna dintre condițiile testate. Folosind acest anticorp am confirmat că concentrațiile scăzute de clorură extracelulară cresc fosforilarea NKCC2 la acest loc, 7,8 în timp ce concentrațiile modificate de potasiu extracelular nu au un rol regulator semnificativ. 24 În concluzie, munca noastră dezvăluie o diferență critică de tulpină în secvența de aminoacizi a NKCC2 de șoarece care are un impact asupra detectării și, prin urmare, asupra analizei fosforilării și reglării NKCC2. Un anticorp pT96 NKCC2 nou dezvoltat ocolește această avertizare tehnică și permite o detectare fiabilă a fosforilării modificate a NKCC2, independent de fundalul genetic al modelelor de șoarece. Mai mult, studiul nostru subliniază din nou că diferențele genetice de fond trebuie luate în considerare atunci când se analizează modelele de șoarece.

MATERIALE ȘI METODE

animale,Șoarecii de sex masculin potriviți cu vârsta (6- 8 săptămâni) au fost fie dintre tulpinile consangvinizate 129S6/SvEvTac, C57BL/6J, denumite în continuare 129Sv și C57BL/6, fie o tulpină hibridă mixtă 129S/B6 în generația F2. Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu legile elvețiene privind bunăstarea animalelor și au fost aprobate de administrația veterinară a Cantonului Zurich, Elveția (Licențe: 141/2014, 185/2017 și 135/2018). Șoarecii au fost genotipați pentru ștergerea a 15 baze utilizând PCR standard cu primeri furnizați în Tabelul S3. NKCC2 de lungime completă (f/f) are un produs PCR așteptat de 87 bp, în timp ce secvența NKCC2 ștearsă (Δ/Δ) este așteptată la 70 bp.

Prelucrarea țesuturilorȘoarecii au fost anesteziați cu o combinație de izofluran (2 procente - 4 procente, 0,5 l/min; Provet; CH) și Temgesic (Buprenorfină; 0.{05- 0). 4 mg/kg greutate corporală; Indivor; CH). Pentru analiza biochimică, șoarecii au fost anesteziați și perfuzați prin ventriculul stâng al inimii cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). Rinichii și colonul distal au fost recoltați, congelați rapid în azot lichid și depozitați la -80 grade până la procesarea ulterioară. Pentru imunohistochimie, rinichii au fost fixați utilizând paraformaldehidă (PFA) 3 procente în tampon fosfat 0.1 M (pH 7.4, 30{0 mOsm) prin perfuzia retrogradă a șoarecelui profund anesteziat prin aorta abdominală urmată de o clătire scurtă cu 0,1 M tampon fosfat (0,2 M NaH2PO4xH2O, 0,2M NaH2PO4x2H20, 0,1 M CaCl2). Ulterior, rinichii au fost îndepărtați, tăiați în bucăți și congelați în propan lichid și păstrați la -80 de grade.

Studii cuști metaboliceDupă adaptarea la cuștile metabolice (Techniplast), șoarecii au fost ținuți în cuștile metabolice timp de patru zile consecutive cu acces gratuit la apă de la robinet și mâncare standard de laborator (Ssniff, Spezialdiäten GmbH). Greutatea corporală, aportul de alimente și apă au fost înregistrate zilnic și au fost colectate urină și fecale timp de 24 de ore.

Protocol de restricție de apăȘoarecii au fost ținuți timp de 24 de ore în cuști metabolice (Techniplast) fără acces la apă de la robinet. Pulbere standard de mâncare de laborator (Ssniff, Spezialdiäten GmbH) a fost amestecată cu apă 1:1, au fost colectate și analizate urină de 24 de ore și fecale. După 24 de ore, șoarecii au fost puși înapoi în cuști normale (T 2L (IVC), LASC, UZH).

Măsurătorile biochimiceConcentrațiile urinare de Na plus, K plus, Ca2 plus au fost analizate prin fotometrie cu flacără (EFOX 5053, Eppendorf). Concentrațiile urinare și plasmatice de Mg 2 plus au fost măsurate la Centrul de Fiziologie Integrativă a Rozătorilor din Zurich cu un sistem(e) SYNCHRON LX®, UniCel® DxC 800 Synchron® Clinical System și Synchron® System Multi Calibrator. Creatinina urinară a fost măsurată prin metoda Jaffe. Concentrațiile de gaze din sânge și de ioni au fost măsurate în sânge integral heparinizat folosind analizorul de gaze din sânge ABL825Flex (radiometru) imediat după recoltarea sângelui din vena cavă. Nivelurile plasmatice de aldosteron și concentrația urinară de uromodulină (UMOD) au fost măsurate cu truse ELISA disponibile comercial (kit Aldosterone ELISA de la Cayman; #501090 și, respectiv, kit Mouse Uromodulin ELISA de la Abcam; respectiv ab245726).

Reacție cantitativă în lanț a polimerazei în timp real (RT-qPCR)

ARN-ul a fost izolat din rinichi și colonul distal folosind kitul de izolare a ARN total SV (PROMEGA). Concentrații egale de ARN izolat (250 ng în 129Sv față de C57BL/6 sau 500 ng în f/f, A/A și f/A) au fost transcrise invers în ADNc cu kitul GoScript™ Reverse Transcriptase (PROMEGA). ADNc-urile generate au fost diluate în continuare cu apă fără ADNază/ARNază (1:5). Primerii au fost proiectați pentru cuantificarea totală a Slc12a1, Slc12a3, Trpm6, Trpv5, Scnn1a, Scnn1b, Scnn1g și Kcnj1 (Tabelul S3). Analiza PCR cantitativă a fost efectuată folosind LightCycler® 480 (Roche) pentru a măsura nivelurile de expresie ale genelor de interes. Expresia relativă a genei a fost calculată utilizând metoda delta Ct folosind -actina ca genă de referință.

Analiza Western blotRinichii au fost omogenizați într-un tampon de liză fără detergent (DFLB) care conține manitol 200 mM, HEPES [4- (2- hidroxiletil)- 1piperazinetansulfonic acizi] 80 mM, hidroxid de potasiu 41 mM, inhibitori de protează (Complete Ultra, Roche) și inhibitori de fosfatază (PhosSTOP, Roche) folosind 32 Magna Lyser Green Beads (Roche) într-un omogenizator de țesut Precellys 24 (Bertin Instruments, Montignyle-). Bretonneux). Granulele au fost sedimentate prin centrifugare timp de 10 minute (1987 rcf) și supernatantul care conținea proteina a fost depozitat în alicote de unică folosință la -80 de grade. Pentru Western blot, 50 ug de proteină au fost denaturate în tampon Laemmli, separate prin SDS-PAGE folosind geluri de 8% - 12% și ulterior transferate pe membrane de nitroceluloză. Locurile de legare nespecifice au fost blocate folosind 1x Odyssey Blocking Solution (Li- COR Biosciences) înainte ca membranele să fie incubate cu anticorpi primari (Tabelul S4) diluați în 0,2x Odyssey Blocking Solution la 4 grade timp de 12 ore. După spălarea în PBS- 0,1 la sută Tween, membranele au fost incubate cu anticorpi secundari (capră-anti-iepure IRDye 800 sau capră-anti-șoarece IR colorant 680, 1:10'{000, LI - COR Biosciences) diluat în tampon de blocare a cazeiinei 0,1x (Sigma). Benzile detectate au fost vizualizate cu sistemul de imagistică în infraroșu Odyssey (Li- COR Biosciences). Pentru a asigura o încărcare egală cu proteine, membranele au fost fie co-colorate cu un anticorp împotriva actinei, fie proteina totală a fost colorată folosind REVERT Total Protein Stain (Li- COR Biosciences) înainte de detectarea anticorpilor. Benzile imunoreactive au fost cuantificate în Fiji (ImageJ) și normalizate față de semnalul de actină sau, respectiv, colorarea proteinei totale REVERT.

ImunohistochimieSecțiunile de criostat (grosime 4 µm) au fost blocate pentru legarea anticorpilor nespecifici cu ser normal de capră 10% și apoi incubate cu anticorpi primari (Tabelul S4)

peste noapte la 4 grade. După spălarea cu 1X PBS, lamele au fost incubate cu anticorpi secundari (Cy3 – IgG conjugat de capră-anti-iepure, numărul de produs 111- 165- 144, 1:1000 și FITC – IgG conjugat de capră-anti-șoarece , numărul de produs 115- 095- 068, respectiv 1:100, ambele de la Jackson Immuno Research Laboratories) timp de 2 ore la temperatura camerei. Toți anticorpii au fost diluați în 1% BSA/1xPBS. Nucleii celulari au fost colorați cu DAPI (4′,6- Diamidino{- 2- fentilindol, Sigma-Aldrich, Co.) într-o concentrație de 0,1 µg/mL. Imaginile au fost efectuate folosind un microscop cu fluorescență Leica DM6000 B (Leica Microsystems, 35578) cu o cameră digitală monocromă cu fluorescență Leica DFC350 FX (Leica Microsystems, 35578). Imaginile au fost procesate în Fiji (ImageJ).

Generarea de anticorpi pT96 NKCC2 de iepure-anti-șoarece purificat prin afinitateProducția de anticorpi a fost efectuată de serviciul de anticorpi Pineda (Berlin, Germania). Iepurii au fost imunizați cu o fosfopeptidă care cuprinde aminoacizii 105- 114 din secvența NKCC2 de șoarece C57BL/6 (NH2- YYLQ(p) TMDAV-COOH). Fracția IgG monospecifică a fost purificată prin afinitate față de fosfopeptidă și ulterior preabsorbită cu defosfopeptidă rezultând o fracție de anticorp specifică fosfoformei. Specificitatea anticorpilor acestei fracțiuni a fost testată prin imunohistochimie și analiză Western blot (Figura 5 și Figura S4).

Tratamentul cu fosfatazăLizatele de proteine ​​au fost incubate timp de 1 oră la 37 de grade cu fosfatază alcalină intestinală de vițel (CIAP) (1 U/1 µg proteină) pentru a induce hidroliza grupărilor 5′-fosfat ale proteinelor fosforilate, care a inhibat legarea specifică a pT96. Anticorp NKCC2 la proteinele de pe membrana Western blot de nitroceluloză (Figura 5B). Au fost utilizați rinichi arhivați încorporați în parafină de la șoareci C57BL6. Tratamentul secțiunilor folosind fosfatază alcalină intestinală de vițel (Sigma Aldrich) a fost efectuat așa cum s-a descris mai devreme, cu modificări minore. 56 După blocarea grupărilor de aldehidă liberă, secțiunile au fost clătite de cinci ori în tampon de fosfatază alcalină (100 mm Tris, 50 µm CaCl2, 0,1 mm MgCl2, 8,4 µm leupeptin, 4 mm Pefablock, pH 9,0). Ulterior, secțiunile au fost incubate în tampon de fosfatază alcalină cu sau fără fosfatază alcalină intestinală de vițel (~130 unități/mL) într-un incubator la 35 de grade timp de 2 ore. Imunohistochimia și microscopia cu lumină au fost ulterior efectuate conform detaliilor. 57

Alinierea secvenței de aminoaciziSecvențele de aminoacizi pentru diferite specii și tulpini de șoarece au fost obținute din baza de date deschisă „Ensembl Genome Browser” (www.ensem bl.org, Institutul Sanger). 42 Sursele ID-urilor de transcriere sunt enumerate în Tabelul S1. Secvențele au fost aliniate folosind Qiagen © CLC Main Workbench 20.

Felii de rinichiRinichifelii de șoareci C57BL/6 au fost utilizate pentru experimente ex vivo așa cum s-a descris anterior. 12 Pe scurt, șoarecii au fost ținuți peste noapte cu acces liber la apă pentru a evita orice efecte potențiale ale aportului alimentar de ioni asupra nivelurilor de fosforilare ale NKCC2 și NCC. Rinichii au fost îndepărtați de la animalele anesteziate, tăiați în felii groase de 280 µm folosind un microslicer vibrant (Vibratome, Microm; Thermo Scientific) și plasați într-o soluție Ringer (în mM): 98,5 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1 Na2 HPO4, 2,5 CaCl2, 1,8 MgCl2 şi 25 glucoză timp de 30 de minute la 30,5 grade cu barbotare constantă cu 95% O2 şi 5% CO2. Ulterior, soluția Ringer a fost înlocuită cu soluții similare, dar cu concentrații diferite de Cl − (5 mM pentru Cl − scăzut, 110 mM pentru Cl normal − ) și K plus (3 mM pentru K plus normal, 10 mM pentru K plus ridicat) pentru încă 30 de minute. În cele din urmă, feliile au fost congelate rapid în azot lichid.

StatisticiTestul t al lui Student nepereche și testul lui Welch în cazul variațiilor inegale au fost utilizate pentru a compara două grupuri (GraphPad Prism, Versiunea 8.0.2). Pentru comparație multiplă, a fost efectuată ANOVA unidirecțională sau bidirecțională, urmată de post-testul de comparație multiplă al lui Tukey (GraphPad Prism, Versiunea 8.0.2). Datele sunt afișate ca mijloace ± SEM (în tabele și figuri). Diferențele au fost considerate a fi semnificative când P <>

MULȚUMIRI  Autorii îi mulțumesc Dr. Gary Shull (Universitatea din Cincinnati, Cincinnait, OH) pentru că a furnizat șoareci NCC-KO, Dr. Biff Forbush (Yale School of Medicine, New Haven, CT) pentru anticorpul său „R5” pNKCC1 și Dr. Henrik Dimke ( University of Southern Denmark, Odense, Danemarca) pentru anticorpul său total monoclonal NCC de șoarece. Autorii le mulțumesc, de asemenea, Monique Carrell și Inger Merete Paulsen pentru asistența tehnică și Dr. Eszter Banki pentru furnizarearinichimostre. Măsurătorile densității minerale osoase și o parte din analiza urinei și a plasmei au fost efectuate de Dr. Petra Seebeck și, respectiv, Nadine Nägele (Zurich Integrative Rodent Physiology, Universitatea din Zurich). Foarte apreciată a fost contribuția foarte utilă a Dr Alicia McDonough (Universitatea din California de Sud) și a Dr. Olivier Devuyst (Universitatea din Zurich).

CONFLICT DE INTERESE Grupul JL primește drepturi de autor pentru anticorpii licențiați împotriva NCC și Nedd fosforilat4- 2 de la Milipore și, respectiv, Abcam. Ambii anticorpi nu au fost utilizați în studiul curent. Mai mult, JL a primit în 2019 un onorariu de la VIFOR pentru o prezentare orală la un simpozion organizat de VIFOR.