Un Dab1-// homozigot este o posibilă cauză nouă a anomaliilor congenitale autosomale recesive ale șoarecilor, rinichii și tractul urinar

edmund.chen@wecistanche.com

Introducere

Șoarecii mutanți Yotari, obținuți prin achiziționarea spontană a unei mutații în gena Dab1, prezintă anomalii histologice în sistemul nervos central [1,2], foarte asemănătoare cu cele ale șoarecilor reeler (reelin//), sugerând că reelin și DAB1 aparțin aceeași cale de semnalizare [1–4]. S-a raportat că aberațiile din calea reelin/DAB1 sunt asociate cu diferite tulburări psihiatrice [5-7]. Interesant este că, pe lângă sistemul nervos central, prezența proteinelor DAB1 și reelin a fost confirmată și în sistemul nervos periferic și în unele țesuturi extraneurale. Prezența DAB1 a fost găsită în podocite de șoarece [8] și fetale umanerinichi[9] în timp ce expresia reelinei a fost raportată în timpul dezvoltării fetale la șoarece și la om, precum și în unele celule endoteliale de-a lungul vaselor de sânge la șoarecele adult [9-11]. Calea canonică reelin/DAB1 poate declanșa proteine ​​distincte în aval, inclusiv receptorii NOTCH2, care joacă roluri critice în deciziile privind soarta celulelor și diferențierea în timpulrinichidezvoltare [12–14]. Receptorii NOTCH2 sunt necesari pentru a forma tubii proximali și podocite [13], dar odată ce maturarea nefronului este atinsă, această cale este în mare parte redusă la tăcere [15]. În condiţii de acutăboli de rinichi,Expresia crescută a NOTCH2 poate contribui potențial la regenerare, în timp ce expresia susținută este asociată cauzal cu fibroza interstițială și glomeruloscleroza [15]. Reglarea în jos a semnalizării NOTCH poate diminua foarte mult autofagia și poate cauza afectarea diferențierii podocitelor în timpul dezvoltării [16].

În consecință, podocitele disfuncționale joacă un rol crucial în boala glomerulară, în special în sindromul nefrotic idiopatic uman [17,18] și în sindromul nefrotic cu modificări minime (MCNS) [19]. Prin urmare, autofagia menține homeostazia celulară în condiții fiziologice normale, în timp ce în condiții patologice, poate progresa în moarte autofagică [20]. Un biomarker de autofagie utilizat pe scară largă este LC3B, o proteină structurală a membranelor autofagozomale [21]. Diafonia complexă între autofagie și apoptoză contribuie, de asemenea, la menținerea echilibrului homeostatic ca răspuns la micromediul celulei. Este bine cunoscut faptul că evenimentele apoptotice cresc în număr în timpulrinichidezvoltare [22] și se diminuează mult odată cu terminarea maturării, cu excepția condițiilor deleziuni renale[23]. Fără îndoială, apoptoza este un mecanism complex reglat prin interacțiunea mai multor căi, dar în cea mai mare parte se termină cu activarea caspazei 3 (CASP3), a cărei activare este unul dintre markerii cei mai des utilizați pentru detectarea apoptozei [23].

În acest raport, ne-am propus să analizăm modul în care influențează tăcere funcțională a genei Dab1rinichimorfologia și expresia și localizarea reelinei, NOTCH2, LC3B și proteinelor CASP3 scindate la șoarecii postnatalirinichi. Presupunem că aceste proteine ​​sunt exprimate în șoarecele postnatalrinichi,iar interacțiunea lor funcțională contribuie la menținerea structurii și funcției lor. În plus, deoarece prezența DAB1 a fost confirmată în timpul fetalului umanrinichi[9], s-ar putea presupune că inactivarea sa poate provoca tulburări într-un spectru larg de anomalii congenitale alerinichisi tractului urinar (CAKUT).

Cuvinte cheie:yotari; funcția rinichilor; dezvoltarea rinichilor postnatale; colorare prin imunofluorescență; microscopia electronică cu transmisie

CISTANCHE VA ÎMBUNĂTĂȚI FUNCȚIA RINICHII/RENALE

Materiale și metode

Colectie de mostreCa mutanți convenționali nuli Dab1, am folosit șoareci yotari (Dab1/) descriși anterior de Howell și colab. [24]. Primerii PCR utilizați pentru genotiparea șoarecilor au fost yotari: GCC CTTCAGCATCACCATGCT și CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, locus Dab1 de tip sălbatic: GCCCTTCAGCATCACCATGCT și CCTTGTTTCTTTGCTTTAA-GGCTGT [5]. Șoarecii C57BL/6 N au fost crescuți și găzduiți în grup în cuști standard de policarbonat (inclusiv cel puțin unul din fiecare genotip) cu acces ad libitum la hrană și apă într-o cameră cu temperatură controlată (23 ± 2 ◦ C) cu o lumină de 12 ore/ ciclu întuneric. În zilele postnatale 4, 11 și 14 (P4, P11 și P14), șoarecii au fost anesteziați profund cu pentobarbital și perfuzați transcardial timp de 10 min cu soluție salină tampon fosfat (PBS, pH 7,2) și 4% paraformaldehidă (PFA). ) în 0,1 M PBS.Rinichiau fost îndepărtate și fixate cu 4% PFA în 0.1 M PBS peste noapte pentru analize histologice convenționale (colorare cu hematoxilină-eozină (H&E), imunohistochimică și imunoffluorescență) și într-un amestec de 2% PFA plus 2,5% glutaraldehidă (GA). pentru examinarea cu microscopul electronic. După fixare, țesutul a fost pregătit pentru examinarea histologică ulterioară, așa cum am descris anterior [25,26].

Imunoffluorescență și colorare cu imunoperoxidazăDupă deparafinizare și rehidratare, secțiunile au fost încălzite timp de 20 min în tampon citrat 0,01 M (pH 6,0) într-un vaporizator de apă și, după aceea, s-au răcit la temperatura camerei. Tampon de blocare (ab 64226, Abcam, Cambridge, Marea Britanie) a fost aplicat timp de 30 de minute pentru a exclude colorarea nespecifică. Secțiunile au fost apoi incubate într-o cameră de umiditate peste noapte cu anticorpi primari (Tabelul 1). După spălarea în PBS, anticorpii secundari (Tabelul 1) au fost aplicați timp de o oră și spălați din nou în PBS. Apoi, nucleele au fost colorate cu 4060 -diamidino-2-fenilindol (DAPI) timp de 2 minute, spălate în PBS și acoperite cu lamela. Am efectuat testul de preadsorbție astfel încât fiecare anticorp primar să fie utilizat cu peptida corespunzătoare și să le aplicăm combinația pe secțiuni. Rezultatele nu au arătat nicio colorare cu anticorpi. În plus, au fost efectuate controale cu omiterea anticorpului primar pentru a determina nivelurile de legare nespecifică a anticorpilor secundari.

Pentru colorarea cu imunoperoxidază, anti-CASP3 policlonal de iepure (diluții 1:100, ab13847, Abcam, Cambridge, UK) a fost aplicat ca anticorp primar timp de o oră într-o cameră de umiditate după tratamentul secțiunii cu 0,1 procent H2O2. După spălarea în PBS, detectarea secundară a fost efectuată utilizând legătura și streptavidin peroxidaza, fiecare timp de cincisprezece minute (DakoCytomation, CA 93013 USA, LOT 03477) și diaminobenzidină (Dako, CA 93013 USA, LOT 10051369), controlate cu atenție pentru a evita supraîncărcarea. Nucleii au fost colorați cu hematoxilină, clătiți cu apă de la robinet timp de 10 minute, deshidratați pentru scurt timp în serii crescătoare de soluții de etanol și acoperiți cu lamela.

Pregătirea țesuturilor pentru microscopul electronic cu transmisie (TEM)După fixarea cu un amestec de 2% PFA și 2,5% GA în 0.1 M PBS timp de 2 ore, probele au fost spălate cu PBS și postfijate într-o soluție apoasă de 2% tetroxid de osmiu timp de 2 ore. Toate probele au fost spălate de două ori în PBS, deshidratate în grade crescătoare de etanol și încorporate în Epon 812 (TAAB Laboratories Equipment, Reading, Marea Britanie). Secțiunile în serie (70 nm în grosime) au fost tăiate pe un ultramicrotom Ultracut UCT (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania) și colorate cu 1% acetat de uranil și citrat de plumb.

Achiziția și analiza datelorAnaliza a fost efectuată cu un microscop cu epifluorescență (Olympus BX51, Tokyo, Japonia) echipat cu o cameră digitală DP71 (Olympus), un microscop electronic cu transmisie JEM 1400 (JEOL, Tokyo, Japonia) operat la 80 kV și fotografiat cu o încărcare JEOL- sistem de cameră cu dispozitiv cuplat (CCD) (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA, SUA) și, în sfârșit, un microscop cu câmp luminos (BX40, Olympus, Tokyo, Japonia). Toate imaginile analizate au fost procesate cu software-ul ImageJ și Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA, SUA). Pe grup examinat, am folosit trei până la patru animale. Toate colectaterinichiau fost tăiate la secțiuni groase de 5 µm și maximrinichi length determined by using these samples was reported. Mean proximal convoluted tubules (PCT), distal convoluted tubules (DCT) and glomeruli diameters were determined by averaging 100 structure diameters per analyzed sample. As nephron segments have irregular shapes, we took the largest diameter of every examined segment as representative. The staining intensity was semiquantitatively evaluated at four degrees: the absence of any reactivity (( ), mild reactivity (+), moderate reactivity (++), and strong reactivity (+++) (Table 2). The number of DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, and cleaved CASP3 immunoreactive cells was counted and expressed as a percentage of total cells. For each sample, we analyzed twenty PCT, DCT, and G at ×40 objective magnifification. We averaged the number of positive cells per group. Any level of nuclear, cytoplasmic, or membrane staining was regarded as positive. Three investigators analyzed the images independently. Interrater agreement was tested with interclass correlation analysis, which yielded a coeffificient >0.75, indicând un acord excelent [27].

Analize statisticeA fost efectuat un test t cu două cozi pentru a analiza diferențele în diametrul mediu dintre PCT, DCT și G ale animalelor de tip sălbatic și yotari. Diametrul a fost prezentat ca medie ± abatere standard (SD). Nivelul de semnificație a fost stabilit la p < 0.05.="" un="" test="" anova="" bidirecțional="" urmat="" de="" testul="" de="" comparație="" multiplă="" al="" lui="" tukey="" a="" fost="" utilizat="" pentru="" a="" examina="" diferențele="" în="" procentul="" de="" celule="" pozitive="" dintre="" pct,="" dct="" și="" glomeruli="" la="" toate="" momentele.="" procentul="" de="" celule="" pozitive="" a="" fost="" exprimat="" ca="" medie="" ±="" eroarea="" standard="" a="" mediei="" (sem).="" nivelul="" de="" semnificație="" a="" fost="" stabilit="" la="" p="">< 0,05.="" analiza="" a="" fost="" efectuată="" în="" software-ul="" graphpad="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">

Rezultate

Colorarea cu hematoxilină-eozină (H&E) și măsurarea diametrului rinichilorColorația H&E a secțiunilor medii sagitale alerinichila toate punctele de timp examinate evidențiază micilerinichifenotipul șoarecilor yotari în comparație cu cel sălbatic (Figura 1a). La 4P în medierinichidiametrul animalelor yotari a fost în jur de 55 µm decât în ​​jur de 75 µm. În plus, această diferență a fost vizibilă în momente ulterioare din cauza creșterii mai lente arinichiin yotari fata de cresterea progresiva arinichila animalele de tip sălbatic. Pentru a determina dacă reducerea totalărinichidimensiunea a fost cauzată de o scădere a dimensiunii segmentului de nefron, am făcut media diametrului PCT, DCT și G per grup. Într-adevăr, a existat o scădere a diametrului mediu G, PCT și DCT în grupul yotari în comparație cu tipul sălbatic (Figura 1b, p < 0.05).="" în="" plus,="" colorarea="" h&e="" a="" scos="" la="" iveală="" cortexul="" mai="" subțire="">renalextensia pelvisului la animalele yotari și DCT ușor dilatat difuz la 14P. Structura de bază și modelul maturizării glomerulare sunt aceleași în ambele grupuri de animale examinate.

Analiză histologică descriptivă pe baza microfotografiilor TEMPe microfotografii obținute prin TEM, glomerulii șoarecilor de tip sălbatic au arătat aspectul tipic al tuturor părților barierei de fifiltrare, care au fost în mod normal dezvoltate și recunoscute (Figura 2a). Podocitele, procesele și pediculii podocitelor, fantele de fifiltrare, membranele bazale glomerulare și lumenul capilar cu endoteliul fenestrat au fost ușor de distins (Figura 2a). Pe de altă parte, în glomerulii șoarecilor yotari, s-a putut observa lezarea progresivă a podocitelor cu ștergerea procesului piciorului și lipsa fantelor de fifiltrare (Figura 2b-d). Aceste modificări ultrastructurale au fost observate în toaterinichia examinat și a implicat majoritatea glomerulilor examinați. Nu s-au observat anomalii în PCT sau DCT ale șoarecilor yotari decât animalele de tip sălbatic (Figura 2e-h). În PCT, interfețele celulare au fost definite prost din cauza neregularității membranelor celulare și a interdigitării celulelor cu vecinii lor. Citoplasma era abundentă, conținând nuclei bine distinși, mitocondrii alungite, pliuri bazale și multe gropi tubulare între microvilozități, care formau o margine de perie la nivelul membranei apicale. Mărirea mai mare a dezvăluit suprafața apicală a celulelor epiteliale PCT care conține microvilozități lungi pentru a forma marginea periei și joncțiuni strânse între marginile celulelor luminale ale celulelor epiteliale tubulare învecinate (Figura 2e, f). Pe de altă parte, suprafața apicală a celulelor epiteliale DCT conținea puține microviloli scurte și numeroase vezicule (Figura 2g, h).

Figura 2. Microfotografii cu microscopul electronic cu transmisie (TEM) de tip sălbatic și yotaririnichi.Glomerulii animalelor de tip sălbatic (a) au prezentat o barieră de fifiltrare dezvoltată normal cu endoteliu fenestrat (E) al capilarului (C), membrana bazală (BM), podocite (P) cu pediculi (PE) și fante de fifiltrare (FS). ). Înrinichia animalelor yotari, s-au observat ștergerea pediculilor și lipsa fantelor de fifiltrare (asteriscuri, b–d). Nu s-au observat anomalii în tubii contorți proximali (PCT) sau în tubii contorți distali (DCT) ai șoarecilor yotari în comparație cu animalele de tip sălbatic (e-h). În PCT, citoplasma a fost abundentă, conținând nuclei bine distinși (N), mitocondrii alungite (M), pliuri bazale (BI) și multe gropi tubulare (TP) între microvilozități, care formau o margine de perie (BB) la nivelul membrana apicala (e,f). Mărirea mai mare a dezvăluit suprafața apicală a celulelor epiteliale PCT care conține microvilozități lungi pentru a forma marginea periei și joncțiuni strânse (TJ) între marginile celulelor luminale ale celulelor epiteliale tubulare învecinate (e,f). Pe de altă parte, suprafața apicală a celulelor epiteliale DCT conține puține microvilozități scurte și numeroase vezicule (g,h). Bara de scară în imagini (a–d) și inserții (e–h) este de 1 µm; bara de scară în imagini (e–h) este de 2 µm.

Localizarea și Colocalizarea Reelin și DAB1Reelin a fost slab exprimat cu reactivitate ușoară până la moderată (Tabelul 2) în glomeruli și DCT ale tuturor animalelor examinate la toate momentele observate (p <{1}}.05, figura="" 3a).="" numai="" în="" pct="" al="" șoarecilor="" yotari="" a="" fost="" procentul="" de="" celule="" pozitive="" semnificativ="" mai="" mare="" decât="" animalele="" de="" tip="" sălbatic="" (p="">< 0,05,="" figura="" 3a).="" în="" celulele="" glomerulare,="" localizarea="" colorării="" a="" fost="" perinucleară,="" în="" timp="" ce="" în="" pct="" și="" dct,="" a="" fost="" împrăștiată="" în="" citoplasmă="" (figura="" a,="">

figura 4. Colorarea prin imunofluorescență a yotarii postnatalerinichicu marker reelin (a) și colorare cu imunofluorescență dublă de tip sălbatic postnatalrinichicu markere DAB1 și reelin (b). (a, b) Colorarea ADN-ului nuclear DAPI a fuzionat cu DAB1, iar imunofluorescența reelină este prezentată în paralel (combinare). Punctele de timp observate au fost P4, P11, P14. Exprimarea markerilor examinați în glomeruli (G), tubulii contorți proximali (PCT) și tubulii contorți distali (DCT) este marcată cu săgeți, în timp ce asteriscurile indică expresia reelinei în matricea extracelulară (a). Inserțiile arată cea mai proeminentă expresie din imagine. Colorația nucleară DAPI a evidențiat o colocalizare slabă a DAB1 și a reelinei, mai ales în DCT (cap săgeată). Bara de scară este de 20 µm și se referă la toate imaginile.

Nu a existat aproape nicio reactivitate imună a DAB1 în glomeruli și PCT ale animalelor de tip sălbatic la P4, în timp ce procentul de celule pozitive cu reactivitate ușoară (Tabelul 2) a crescut semnificativ la P11 și P14 (p < 0.05,="" figura="" 3b).="" în="" dct,="" dab1="" a="" fost="" exprimat="" mai="" ales="" în="" părțile="" apicale="" și="" laterale="" ale="" membranelor="" celulare="" (figura="" 4b)="" cu="" reactivitate="" puternică="" (tabelul="" 2).="" procentul="" de="" celule="" pozitive="" a="" fost="" semnificativ="" mai="" mare="" decât="" în="" ​​structurile="" anterioare,="" în="" jur="" de="" 60="" la="" sută="" (figura="" 3b),="" în="" special="" în="" macula="" densa="" (figura="" 4b).="" nu="" a="" existat="" aproape="" nicio="" colocalizare="" a="" dab1="" și="" reelin,="" cu="" excepția="" dct="" a="" animalelor="" de="" tip="" sălbatic="" la="" p14="" (vârful="" săgeții,="" figura="" 4b).="" biomolecule="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" din="" 14="" figura="" 4.="" colorarea="" prin="" imunoflfluorescență="" a="" yotarii="">rinichicu marker reelin (a) și colorare cu imunoffluorescență dublă de tip sălbatic postnatalrinichicu markere DAB1 și reelin (b). (a, b) Colorarea ADN-ului nuclear DAPI a fuzionat cu DAB1, iar imunofluorescența reelină este prezentată în paralel (combinare). Punctele de timp observate au fost P4, P11, P14. Exprimarea markerilor examinați în glomeruli (G), tubulii contorți proximali (PCT) și tubulii contorți distali (DCT) este marcată cu săgeți, în timp ce asteriscurile indică expresia reelinei în matricea extracelulară (a). Inserțiile arată cea mai proeminentă expresie din imagine. Colorația nucleară DAPI a evidențiat o colocalizare slabă a DAB1 și a reelinei, mai ales în DCT (cap săgeată). Bara de scară este de 20 µm și se referă la toate imaginile. Nu a existat aproape nicio reactivitate imună a DAB1 în glomeruli și PCT ale animalelor de tip sălbatic la P4, în timp ce procentul de celule pozitive cu reactivitate ușoară (Tabelul 2) a crescut semnificativ la P11 și P14 (p < 0,05,="" figura="" 3b).="" în="" dct,="" dab1="" a="" fost="" exprimat="" mai="" ales="" în="" părțile="" apicale="" și="" laterale="" ale="" membranelor="" celulare="" (figura="" 4b)="" cu="" reactivitate="" puternică="" (tabelul="" 2).="" procentul="" de="" celule="" pozitive="" a="" fost="" semnificativ="" mai="" mare="" decât="" în="" ​​structurile="" anterioare,="" în="" jur="" de="" 60="" la="" sută="" (figura="" 3b),="" în="" special="" în="" macula="" densa="" (figura="" 4b).="" nu="" a="" existat="" aproape="" nicio="" colocalizare="" a="" dab1="" și="" reelin,="" cu="" excepția="" dct="" a="" animalelor="" de="" tip="" sălbatic="" la="" p14="" (vârful="" săgeții,="" figura="">

Modele de expresie spațială și temporală ale NOTCH2 și LC3BProcentul de celule NOTCH{{0}}pozitive a fost mai mic de 20 procente în glomerulii ambelor genotipuri de animale la toate momentele observate. Numai la P14 procentul de celule pozitive a fost semnificativ mai mare în glomerulii animalelor yotari decât animalele de tip sălbatic (p < 0,05,="" figura="" 3c).="" intensitatea="" colorării="" a="" fost="" ușoară="" până="" la="" moderată="" (tabelul="" 2),="" localizată="" în="" cea="" mai="" mare="" parte="" perinuclear="" (figura="" 5a–f).="" în="" pct="" și="" dct="" ale="" ambelor="" genotipuri="" de="" animale,="" procentul="" de="" celule="" pozitive="" a="" crescut="" în="" timp.="" la="" p14,="" procentul="" de="" celule="" pozitive="" a="" fost="" semnificativ="" mai="" mare="" în="" pct="" și="" dct="" ale="" animalelor="" yotari="" decât="" pct="" și="" dct="" ale="" animalelor="" de="" tip="" sălbatic="" (p="">< 0,05,="" figura="" 3c).="" intensitatea="" semnalului="" la="" toate="" momentele="" observate="" a="" fost="" ușoară="" până="" la="" moderată="" (tabelul="" 2)="" și="" împrăștiată="" în="" citoplasmă="" (figura="" 5a-f).="" figura="" 5.="" colorarea="" prin="" imunofluorescență="" a="" tipului="" sălbatic="" postnatal="" și="">rinichicu markeri NOTCH2 și LC3B și colorare cu imunoperoxidază cu marker de caspază clivată3 (CASP3). (a–f) Colorarea ADN-ului nuclear DAPI este îmbinată cu NOTCH2 și LC3B. Punctele de timp observate au fost P4, P11, P14. Exprimarea markerilor NOTCH2 și LC3B în glomeruli (G), tubulii contorți proximali (PCT) și tubulii contorți distali (DCT) este marcată cu săgeți. Reactivitatea LC3B deosebit de puternică poate fi observată în capsula Bowman de glomeruli în descompunere (asterisc, e). Inserțiile arată cea mai proeminentă expresie din imagine. CASP3 a fost slab exprimat în toate punctele de timp observate. Singura expresie semnificativă a fost în glomerulii șoarecilor yotari de pe P14 (săgeți). Bara de scară este de 20 µm și se referă la toate imaginile. Biomoleculele 2021, 11, 609 9 din 14 3.4. Modele de expresie spațială și temporală ale NOTCH2 și LC3B Procentul de celule NOTCH2-pozitive a fost mai mic de 20% în glomerulii ambelor genotipuri de animale la toate momentele observate. Doar la P14 procentul de celule pozitive a fost semnificativ mai mare în glomerulii animalelor yotari decât animalele de tip sălbatic (p < 0,05,="" figura="" 3c).="" intensitatea="" colorării="" a="" fost="" ușoară="" până="" la="" moderată="" (tabelul="" 2),="" localizată="" în="" cea="" mai="" mare="" parte="" perinuclear="" (figura="" 5a–f).="" în="" pct="" și="" dct="" ale="" ambelor="" genotipuri="" de="" animale,="" procentul="" de="" celule="" pozitive="" a="" crescut="" în="" timp.="" la="" p14,="" procentul="" de="" celule="" pozitive="" a="" fost="" semnificativ="" mai="" mare="" în="" pct="" și="" dct="" ale="" animalelor="" yotari="" decât="" pct="" și="" dct="" ale="" animalelor="" de="" tip="" sălbatic="" (p="">< 0,05,="" figura="" 3c).="" intensitatea="" semnalului="" la="" toate="" momentele="" observate="" a="" fost="" ușoară="" până="" la="" moderată="" (tabelul="" 2)="" și="" împrăștiată="" în="" citoplasmă="" (figura="">

Figura 5. Colorarea prin imunoflfluorescență a tipului sălbatic postnatal și yotaririnichicu markeri NOTCH2 și LC3B și colorare cu imunoperoxidază cu marker de caspază clivată3 (CASP3). (a–f) Colorarea ADN-ului nuclear DAPI este îmbinată cu NOTCH2 și LC3B. Punctele de timp observate au fost P4, P11, P14. Exprimarea markerilor NOTCH2 și LC3B în glomeruli (G), tubulii contorți proximali (PCT) și tubulii contorți distali (DCT) este marcată cu săgeți. Reactivitatea LC3B deosebit de puternică poate fi observată în capsula Bowman de glomeruli în descompunere (asterisc, e). Inserțiile arată cea mai proeminentă expresie din imagine. CASP3 a fost slab exprimat în toate punctele de timp observate. Singura expresie semnificativă a fost în glomerulii șoarecilor yotari de pe P14 (săgeți). Bara de scară este de 20 µm și se referă la toate imaginile.

În glomeruli și DCT ale ambelor genotipuri de animale, procentul de celule pozitive LC3B a crescut în timp (p < 0.05,="" figura="" 3d).="" la="" p11="" și="" p14,="" procentul="" de="" celule="" pozitive="" a="" fost="" semnificativ="" mai="" mare="" în="" glomerulii="" animalelor="" yotari="" decât="" în="" ​​glomerulii="" animalelor="" de="" tip="" sălbatic="" (p=""><0.05, figura="" 3d).="" în="" glomerulii="" animalelor="" yotari,="" intensitatea="" colorării="" a="" fost="" în="" mare="" parte="" moderată="" până="" la="" puternică="" (tabelul="" 2)="" localizată="" în="" spațiul="" perinuclear="" și="" nuclear="" (figura="" 5a–f),="" la="" toate="" momentele="" observate,="" în="" timp="" ce="" la="" glomerulii="" șoarecilor="" de="" tip="" sălbatic,="" intensitatea="" a="" fost="" în="" mare="" parte="" moderată="" (tabelul="" 2).="" pct="" al="" animalelor="" yotari="" și="" de="" tip="" sălbatic="" a="" conținut="" aproximativ="" 20%="" din="" celule="" pozitive="" la="" toate="" momentele="" observate="" (p="">< 0,05,="" figura="">

Expresie CASP-3 scindatăNu a existat aproape nicio expresie a CASP-3 activat înrinichia animalelor de tip sălbatic la toate momentele de timp observate. În PCT și DCT ale șoarecilor yotari, mai multe celule individuale au fost CASP-3-pozitive (Figura 3e). Numai în glomerulii rinichilor yotari la P14 (Figura 5e), procentul de celule pozitive a crescut semnificativ în comparație curinichide șoareci de tip sălbatic (p <0.05, Figura 3e).

Discuţie

Rinichimorfogeneza și dezvoltarea sunt procese complexe coordonate precis prin interacțiunea unui număr mare de gene. Anomalii congenitale alerinichiși tractul urinar (CAKUT) sunt cel mai frecvent defect congenital care constituie 23% din toate aceste defecte și reprezintă principala cauză a stadiului terminal.boala renalala copii [28,29]. Tulburările cu o singură genă pot fi sursa primară a CAKUT și, până în prezent, o mutație a mai mult de 20 de gene a fost identificată drept cauza CAKUT [30]. După cum munca noastră anterioară a arătat o expresie excelentă a DAB1 în timpul fetalului uman normalrinichidezvoltare [9], am presupus că DAB1 ar putea juca un rol semnificativ în timpul mamiferelorrinichidezvoltare. Pentru a ne demonstra ipoteza, am investigatrinichimorfologia și modelele de expresie ale proteinelor reelin, NOTCH2, LC3B și CASP3 activate la șoarecii knockout Dab1.

CISTANCHE VA Ameliora DURILE DE RINCHI/RENALI

Secționarea prin șoareci yotaririnichia dezvăluit un cortex mai subțire și o medie semnificativ mai micărinichiși diametrele PCT, DCT și G în comparație cu animalele de tip sălbatic. Scăderea înrinichidimensiunea cauzată de dotarea insuficientă a nefronului este cunoscută carenalhipoplazia, una dintre cele mai frecvente tulburări CAKUT, care predispune hipertensiunea la adult și boala cronică de rinichi [31]. În plus, microfotografiile capturate cu TEM au dezvăluit că șoarecii yotari au prezentat leziuni proeminente ale podocitelor cu ștergerea procesului piciorului și lipsa fantelor de fifiltrare. După leziune, podocitele suferă un proces de ștergere în care își pierd structura, ceea ce duce la o reducere a funcției de barieră de fifiltrare [32]. Toate formele de sindrom nefrotic, precum și glomeruloscleroza segmentară focală (FSGS), sunt caracterizate prin defecte ale structurii sau funcției podocitelor [33].

Studiul nostru actual a arătat cea mai mare expresie a DAB1 la părțile apicale și laterale ale membranelor celulare ale DCT, în timp ce REELIN a fost împrăștiat în cea mai mare parte în citoplasma PCT. La momentele investigate, nu au fost observate modificări morfologice la tubulii șoarecilor yotari, dar sunt necesare investigații suplimentare pentru a elucida rolul DAB1 în compartimentele tubulointerstițiale. A existat o colocalizare ocazională a proteinelor DAB1 și REELIN, mai ales în DCT. Aceste descoperiri urmează lucrările noastre anterioare referitoare la expresia acestor două proteine ​​în timpul fetalului umanrinichidezvoltare [9]. Acest lucru poate sugera că DAB1 și reelin au roluri similare la om și la șoarecerinichiprin activarea unora dintre căile din aval, cum ar fi cascadele de semnalizare Crk, MAPK și PI3K/Akt/mTOR [34–36]. Datele noastre au arătat, de asemenea, o expresie crescută a reelinei în glomerulii șoarecilor yotari. Interesant, un studiu anterior a arătat că fosforilarea DAB1 și expresia crescută a reelinei în glomeruli sunt însoțite de hipertensiune arterială, proteinurie și leziuni ale podocitelor la șobolanii infuzați cu Ang II [10].

În plus, colorarea prin imunofluorescență a relevat o expresie crescută a receptorilor NOTCH2 în glomerulii șoarecilor P14 yotari. Este binecunoscut faptul că expresia NOTCH2 este reglată în jos odată ce maturizarea nefronului este atinsă, cu excepția condițiilor deleziuni renale,cum ar fi nefropatia diabetică și FSGS [15,37]. Șoarecii cu sindrom nefrotic indus de adriamicină au prezentat, de asemenea, o expresie crescută a NOTCH2 activat, care ameliorează fibroza [38]. La momentele investigate, nu am observat creșterea fibrozei, dar rămâne de elucidat rolul exact al NOTCH2 exprimat în yotari postnatale.rinichi.Ar fi necesară o observație suplimentară pentru a stabili dacă modificările fifibrotice apar în etapele ulterioare. Cu toate acestea, există deja unele descoperiri care sugerează că efectul pe termen scurt al activării crescute a NOTCH2 este asociat cu un puternic beneficiu de supraviețuire pentru podocitele lezate, care se pierde în modelele pe termen lung, cum ar fi nefropatia diabetică [39].

Expresia mai mare a LC3B în glomerulii șoarecilor yotari P11 și P14 a reflectat probabil o acumulare a autofagozomilor în podocite. Pentru a arăta clar că autofagia a fost accelerată. Este necesar să se analizeze raportul dintre expresiile proteinei LC{3-II și LC{3-I. În condiții normale, autofagia este necesară pentru normalfunctia rinichilor[40], în special în podocite. Datorită capacității sale limitate de diviziune și înlocuire celulară, ele prezintă un nivel bazal ridicat de autofagie [41]. În ciuda acestor constatări, creșterea exprimării LC3B a fost raportată în mai multe boli glomerulare [42–44], în principal în asociere cu ștergerea procesului piciorului și dezvoltarea sindromului nefrotic, așa cum s-a observat la șoarecii knockout condiționati ai receptorului de prorenină [45,46]. Toate aceste studii sugerează un rol protector al autofagiei îmbunătățite în condiții patologice, susținut în continuare de descoperirile nefropatiei induse de adriamicină, în care autofagia este activată pentru a proteja împotriva leziunii podocitelor [43], precum și în boala glomerulară dependentă de vârstă, unde întârzie. declinul funcţional progresiv alfunctia rinichilor[40]. Analiza omuluirinichibiopsiile au arătat, de asemenea, dovezi ale creșterii autofagiei în asociere cu ștergerea procesului piciorului în mai multe boli glomerulare, inclusiv sindromul nefrotic cu modificări minime (MCNS), care este una dintre cele mai frecvente cauze ale sindromului nefrotic idiopatic [19]. În condiţiile nefropatiei diabetice şi acute induse de lipopolizaharideleziuni renale,îmbunătățirea autofagiei cu unele terapii prin inhibarea căii PI3K/AKT/mTOR ameliorează funcția rinichilor [47,48]. Toate aceste descoperiri implică faptul că autofagia are un rol citoprotector indispensabil pentru adaptarea la stresleziuni renale, iar modularea sa ar putea fi o strategie terapeutică promițătoare, deși, în anumite circumstanțe, autofagia poate fi, de asemenea, dăunătoare și poate progresa în moartea celulelor.

CISTANCHE VA AMUNĂȚI INSUFICIENȚA RENALĂ/RENALĂ

Cu excepția creșterii autofagiei, un nivel crescut de apoptoză a putut fi observat și în glomerulii șoarecilor P14 yotari. Autofagia previne de obicei apoptoza, dar în circumstanțe patologice specifice, poate avea și un efect opus asupra supraviețuirii celulare prin creșterea și promovarea apoptozei [42]. După naștere, apoptoza înrinichieste mult diminuat, cu excepţia condiţiilor deleziuni renale,cum ar fi sindromul nefrotic idiopatic unde contribuie la dezvoltarea bolii [23]. potenţială cauză nouă a anomaliilor congenitale autozomale recesive alerinichisi tractului urinar. Cu toate acestea, rolul principal al DAB1 în timpulrinichidezvoltarea rămâne neclară. În plus, acești șoareci au prezentat anomalii ale procesului piciorului și un nivel crescut de reelină, NOTCH2, LC3B și proteine ​​clivate CASP3 în glomeruli, care pot duce la leziuni glomerulare, cum ar fi sindromul nefrotic, care, în corelație cu hipoplazia, poate fi o cauză potențială a decesului. a acestor animale în perioada de înțărcare. Pentru a confirma această ipoteză, este necesar să se furnizeze informații suplimentare privind tensiunea arterială și alți parametri clinico-laboratori, cum ar fi nivelurile de creatinine serice, albumină și proteine.