O nouă strategie pentru screeningul componentelor active din Cistanche Tubulosa bazată pe analiza relației spectru-efect și pe farmacologia rețelei Ⅱ

3. Rezultate si discutii

3.1. Amprente HPLC

3.1.1. Validarea metodei

Validarea pentru metoda HPLC a arătat că abaterea standard relativă (RSD) pentru precizia, reproductibilitatea și stabilitatea metodei a fost mai mică de 2,85% pentru aria relativă a vârfului (n = 11) și 0,77% pentru timpul relativ de retenție (n = 11). Precizia aceleiași soluții de probă a apărut în intervalul de 0.05–{{10}},77 la sută pentru timpul relativ și 0,28– 2,70 procente pentru aria relativă a vârfurilor comune. Reproductibilitatea experimentului a fost în intervalul 0.{03–0,20% pentru timpul relativ și 0,23–2,59% pentru aria relativă a vârfurilor comune. Stabilitatea eșantionului a fost de 0,09–0,24% pentru timpul relativ de retenție și 0,75–2,85% pentru aria relativă a vârfurilor comune. Aceste rezultate au indicat că amprenta stabilită a fost satisfăcută. Relațiile liniare pentru acidul geniposidic,echinacozid, acteozid, tubulozid A, șiizoacteozidăsunt prezentate în tabelul S4. Valoarea lui R pătrat a fost 1.0000, indicând o bună liniaritate. Rezultatele recuperării probei au arătat că recuperările medii de acid geniposidic, echinacozid,acteozid, tubulozid A, șiizoacteozidăau fost 100,37 la sută , 103,59 la sută , 98,46 la sută , 100,81 la sută și 101,19 la sută , iar RSD pentru recuperările de probe a fost mai mică de 2,68 la sută .

Faceți clic aici pentru a obține mai multe detalii despre Cistanche Active Components

3.1.2. Zona de vârf (PA) și timpul relativ de retenție (RRT)

Amprentele de referință și amprentele digitale ale HM, WE și HR din 11 loturi de C. tubulosa sunt prezentate în Figura 2. Unsprezece vârfuri, care au prezentat o bună separare și rezoluție, au fost identificate ca vârfuri comune între HM, WE și HR. Cei cinci compuși standard au fost identificați ca acid geniposidic (A2),echinacozid(A8),acteozid (A9), tubulozidA (A10) șiizoacteozidă(A11). Compusul standard,echinacozid, care a fost prezent în toate cromatogramele (timp mediu de retenție 12.86 min) cu o zonă de vârf adecvată și o stabilitate bună, a fost selectat ca vârf de referință și utilizat pentru a calcula timpii de retenție relativi (RRT) ai celorlalți zece vârfuri comune. RRT-urile acestor forme diferite sunt în intervalul 0.16–1.51. PA și coeficientul de varianță (procent CV) ale acestor vârfuri comune sunt enumerate în tabelele S5–S7. Din date, valorile procentuale CV pentru PA sub diferite forme sunt de 25,78 la sută –142,02 la sută, 23,36 la sută –150,38 la sută și 28,91 la sută –112,78 la sută pentru HM, WE și, respectiv, HR. Aceste rezultate relevă diferențe semnificative în concentrația fiecăruiaCistanche tubulosacompuse între diferitele forme. Amprentele HM, WE și HR sunt prezentate în Figura 3.

Figura 2 Amprentele HPLC ale probelor standard

3.1.3. Conținutul HM, WE și HR

Cinci componente standard aleC. tubulosaau fost măsurate. Conținutul componentelor principale este prezentat în Tabelul 1. Comparația dintre HM, WE și HR este prezentată în Tabelul 2 și Figura 4. PhG-urile din C. tubulosa sunt biologic active, dar termosensibile. Componentele sensibile la căldură care se dizolvă în apă pot fi extrase eficient folosind o metodă rezonabilă. În general, Cistanche herba este extrasă cu apă și apoi evaporată într-o soluție concentrată pentru următoarea analiză chimică [26, 27, 30]. După extracție și concentrare s-a folosit tehnologia de uscare prin pulverizare și procedura a fost modificată față de articolul precedent. Apa a fost îndepărtată rapid din aburul lichid și apoi s-au obținut extracte uscate de materii prime din plante. În această etapă, adăugarea de maltodextrine este considerată un purtător comun pentru a spori dispersia și a prelungi timpul de depozitare. Printr-o serie de procese de fabricație, plantele din plante au fost apoi presate în granule de formulă cu aditivi. Această etapă de adăugare a excipienților nu a fost inclusă în experiment. În general, procesul nostru de producție include extracția, concentrarea și uscarea prin pulverizare, așa cum este descris în Secțiunea 2.2, în paralel cu un proces de producție de granule de formulă. Pentru a produce aceste semifabricate trebuie urmați cei trei pași de mai sus. Procedura de formare a WE implică concentrare și uscare prin pulverizare, care provoacă ușor pierderea componentelor termosensibile, dar HR-urile se obțin după extracția și uscarea HM-urilor. Ne întrebăm dacă este posibil ca componentele active să rămână în HR. Conform rezultatelor noastre, conținutul de verbascozid s-a redus semnificativ de la HM la WE și, respectiv, HR. Stabilitatea termică a verbascozidei este investigată prin monitorizarea modificărilor zonei vârfului prin HPLC în timpul procesului de încălzire. După încălzire timp de 4 ore, se lasă 41,6 la sută din verbascozidă. Indică faptul că verbascozidul este termosensibil [31]. Izoacteozidul, tubulozidul A și echinacozidul în WE au rămas stabile după proceduri complexe de procesare. În timpul procesului de uscare pe termen lung, acumularea de PhG a prezentat o scădere semnificativă, care ar putea fi atribuită degradării termice a acestor componente termosensibile [32]. În ceea ce privește celelalte componente țintă, HR și WE nu diferă semnificativ, cu excepția verbascozidei. Înțelegerea noastră asupra acestei diferențe ne va permite să dezvoltăm în viitor standarde de calitate mai bune pentru drojdiile din plante și să le transformăm în produse.

Tabelul 1 Conținutul a 11 loturi de C. tubulosa

Tabelul 2 Comparația conținutului componentelor principale (n = 11).

,

Figura 4 Determinarea conținutului a cinci componente din forme diferite (n = 11). , ns: nu este semnificativ.

3.1.4. Analiza similitudinii amprentelor digitale

Au fost evaluate asemănările dintre cele trei grupuri de C. tubulosa. Valorile similarității materialului din plante-extract de apă, materialului din plante-reziduuri din plante și extractului de apă-reziduuri din plante au fost în intervalele 0,943–0,994, 0,847–{ {9}}.995 și, respectiv, 0.938–1.000 (Tabelul 3).

Tabelul 3 Asemănări ale HM-WE, HM-HR și WE-HR pentru 11 loturi de C. tubulosa.

3.2. Rezultatele testului de activitate antioxidantă

Activitățile antioxidante ale diferitelor forme de C. tubulosa au fost determinate utilizând testele DPPH, , și capacitatea de captare, iar rezultatele relevante sunt prezentate în Figura 5. În tabelul S8, intervalele pentru DPPH și rezultatele testelor de capacitate de captare au fost { {2}}.04–37,80, 0,98–843,90 și 0,32–27,65 mg/mL pentru cele trei forme diferite dintre cele 11 loturi de C. tubulosa. În trei teste de activitate antioxidantă, HM și WE au prezentat activitate de inhibare strânsă, în timp ce HR au arătat cea mai slabă inhibare.

S-a descoperit că WE uscate prin pulverizare prezintă activități semnificative chiar și la concentrații scăzute. Un raport anterior a indicat că Vernonia amygdalina WE uscată prin pulverizare a atins 50 procente de inhibare a captării la 0,17 mg/mL [33]. Aplicarea timpilor lungi de extracție și a temperaturilor ridicate este o sabie cu două tăișuri. Pe de o parte, creșterea timpului de extracție și a temperaturii de intrare pentru uscare prin pulverizare îmbunătățește randamentul și eficiența. În plus, extractele realizează o activitate antioxidantă puternică și concentrații mai mari de componente biologice decât acele plante [34]. Pe de altă parte, aerul de intrare excesiv de fierbinte degradează compușii bioactivi. Astfel de temperaturi ridicate la intrarea aerului au dus la pierderi ale activității antioxidante a extractului Bidens pilosa și au fost atribuite scăderii compușilor fenolici [35]. Rezultatele prezente sunt în concordanță cu raportul menționat anterior. De exemplu, WE din S6 a prezentat abilități mai slabe de inhibiție a radicalilor decât HM și HR. În plus, HR în S5 a prezentat abilități mai puternice de captare a anionilor DPPH și superoxid decât HM și WE. Structura PhG constă din legături glicozidice și grupări acetil care sunt hidrolizate cu ușurință sub acțiune enzimatică sau descompuse la temperaturi ridicate. Aceste reacții pot explica scăderea unor componente principale în timpul producției la scară largă. Cu toate acestea, hidroliza sau izomerizarea anumitor componente ar putea accelera sinteza altor componente. Astfel de transformări sunt frecvente la procesarea ierburilor Cistanches [36–38]. PhGs fiind solubili în apă implică faptul că majoritatea componentelor biologice pot fi utilizate prin extracția cu apă. Afirmația că majoritatea componentelor active rămân în WE a persistat de zeci de ani, așa că pare rezonabil să presupunem că materialele reziduale umede pot fi aruncate după extracție. Cu toate acestea, este incorect să privim HR-urile de C. tubulosa ca deșeuri. Cercetătorii subliniază că PhG-urile sunt instabile și sunt susceptibile la degradarea enzimatică sau hidrolitică [39]. Reacțiile de hidroliză sau izomerizare care contribuie la scăderea ingredientelor biologice din fitomedicamente în timpul procesării ar putea, în același timp, să prezinte noi oportunități de exploatare a HR. Prin conversia metodelor tradiționale de extracție, reziduurile medicinale pot fi dezvoltate și utilizate mai eficient. Hidroliza enzimatică a fost efectuată pentru a converti reziduul de ginseng Panax în monozaharuri. Randamentele de polizaharide și ginsenozide au crescut, cum ar fi zahăr, acid succinic, polizaharide de ginseng și ginsenozide [40]. Reziduurile de Sophora flavescens sunt reextrase prin unde ultrasonice cu acetat de etil [41]. Tehnologiile actualizate pentru utilizarea reziduurilor de plante sunt rezumate de Huang et al. [42].

Pe baza rezultatelor PLSR și BCA, primele cinci vârfuri de diferite forme au fost verificate folosind testele DPPH, anion superoxid și radicali hidroxil pentru a identifica cele mai importante vârfuri. Rezultatele sunt ilustrate în diagrama Venn (Figura 7). A2, A6, A8 și A10 sunt vârfurile comune care sunt împărtășite de HM, WE și HR (Figurile 7(a) și 7(c)) în testele de captare a anionului superoxid și a radicalilor hidroxil, în timp ce HM, WE și HR nu are vârfuri ale testului DPPH. Între timp, modelele BCA arată că A1, A2, A3 și A6 sunt vârfurile comune împărtășite de HM, WE și HR (Figurile 7(d)–7(f)). În special, suprapunerile din diagrama Venn indică faptul că modelul BCA pare mai potrivit decât modelul PLSR, primul prezentând mai multă repetiție. Coeficienții modelului BCA și valorile IC50 a capacității antioxidante au fost analizate prin RDA. După cum RDA prezentat în Figura 8, A1, A3 și A6 din HM și HR sunt legate pozitiv de indicii antioxidanti, cu excepția faptului că A3 este legat negativ de capacitatea de captare a radicalilor hidroxil. A1 și A6 din WE au corelații puternice cu DPPH și anionul superoxid. Picurile A6 observate din diferitele forme prezintă cea mai puternică legătură cu DPPH, anionul superoxid și radicalii hidroxil. A1 și A3 prezintă, de asemenea, o legătură similară.

Figura 7

Diagramele Venn ale modelului PLSR și BCA: (a) Testul DPPH. (b) test de captare. (c) testul de captare a fost analizat prin modelul PLSR. (d) Testul DPPH. (e) test de captare. (f) testul de captare a fost analizat prin modelul BCA. Secțiunea suprapusă a fost ciobul de vârfuri comune de HM, WE și HR.

3.4. Analiza bazată pe farmacologie de rețea

3.4.1. Construcția rețelei CT

Un total de 4359 de ținte legate de activitatea antioxidantă au fost obținute din baza de date GeneCards și baza de date OMIM. În același timp, componentele active au fost verificate din baza de date TCMSP și din baza de date SwissTargetPrediction. Apoi, 198 de ținte au fost colectate și standardizate prin baza de date UniPort. Au existat 159 de gene țintă împărtășite de componente active și boli legate de antioxidanți (vezi Figura S1). Rețeaua CT a fost construită pentru a ilustra corelația dintre compuși și țintele cheie ale genelor (Figura 9).

Figura 9 Rețeaua CT. Rețeaua a arătat corelația dintre componentele active și țintele cheie ale genelor.

3.4.2. Construirea rețelei PPI și screening-ul țintelor cheie

PPI a fost vizualizat folosind baza de date STRING (Figura 10). Rețeaua includea 159 de noduri și 2528 de margini. În întreaga rețea de interacțiune, componentele de conectare sau nodurile cu mai multe puncte țintă pot fi componenta cheie sau gena țintă care joacă un rol antioxidant în C. tubulosa. Rezultatele au fost descărcate și introduse în Cytoscape pentru vizualizare. Cu cât valoarea DC este mai mare, cu atât culoarea este mai închisă și cu cât valoarea scorului combinat este mai mare, cu atât marginea este mai groasă. Am descoperit că RAC-alfa serină/treonin-protein kinaza (AKT1), interlukin-6 (IL6), factorul de necroză tumorală (TNF) și factorul de creștere a endoteliului vascular A (VEGFA) au fost localizate central (Figura 11), indicând faptul că acestea erau ținte cheie atunci când componentele active exercitau un efect antioxidant. Se raportează că echinacozidul reduce disfuncția mitocondrială prin reglarea protein kinazelor activate de mitogen (MAPK) și AKT și a formelor lor fosforilate [43]. Cercetătorii au speculat că efectul antidiabetic al glicozidelor C. tubulosa s-ar putea datora activității antioxidante a PhG prin reglarea în jos a citokinelor proinflamatorii, cum ar fi IL-6 și TNF- [44]. În plus, echinacozidul ar putea afecta creșterea celulelor canceroase ovariane prin reglarea în jos a expresiei VEGFA pentru a inhiba angiogeneza [45], care este strâns corelată cu sistemul ROS pentru ca ROS induce expresia semnalizării VEGF [46].

Figura 10 Rețeaua PPI.

3.4.3. Analiza îmbogățirii și stabilirea rețelei CTP

Compușii potențiali antioxidanti au acționat asupra numeroaselor funcții biologice, inclusiv BP, CC și MF. În Figura 12(a), sunt prezentate primele 10 căi. Țintele prezise din rețeaua PPI au răspuns în principal la multe procese biologice, cum ar fi compuși organici ciclici, stimul xenobiotic, substanțe anorganice, niveluri de oxigen și reglarea pozitivă a mișcării componentelor celulare. Analiza componentelor celulare a arătat că genele au fost în principal legate de pluta membranară, matricea extracelulară, lumenul granulelor secretoare, complexul de reglare a transcripției și partea apicală a celulei. Aceste ținte sunt, de asemenea, implicate în multe funcții moleculare, inclusiv legarea factorului de transcripție de legare la ADN, activitatea de homodimerizare a proteinei, legarea specifică domeniului proteic și legarea receptorului de citokine.

Figura 12 Analiza îmbogățirii: (a) Analiza îmbogățirii GO. (b) Analiza îmbogățirii KEGG.

Pentru a investiga funcțiile biologice ale acestor noduri majore, a fost efectuată o analiză de îmbogățire a căilor. Din rezultatele îmbogățirii KEGG, a fost desenată o diagramă cu bule pentru a arăta primele 20 de căi. Cu cât locul era mai mare, cu atât mai multe gene au fost incluse în cale. După cum se arată în Figura 12 (b), căile cheie ale C. tubulosa au fost legate de căile în cancer, lipide și ateroscleroză, calea de semnalizare AGE-RAGE în complicațiile diabetului, carcinogeneza chimică - activarea receptorului și calea de semnalizare MAPK. Au fost investigate efectele C. tubulosa asupra apoptozei și homeostaziei redox celulare. Datele sugerează că C. tubulosa poate fi un candidat promițător pentru terapia anti-cancer de colon [47]. Extractul de C. deserticola se găsește la persoanele în vârstă [48].

Figura 13 ilustrează corelația dintre căi și țintele aferente acestora și relația dintre genele țintă care se suprapun și componentele biologic active ale C. tubulosa. A fost generată o vedere globală a rețelei CTP, care a constat din 12 ingrediente, 159 ținte și 20 de căi. Cele mai multe dintre ținte au fost împărtășite de compușii activi candidați. Aceste ingrediente active candidate cu grade ridicate de interconectare au fost responsabile pentru interconectarea ridicată a rețelei CTP, în special quercetina (gradul = 131). Majoritatea țintelor, cum ar fi AKT1, IL6, TNF și VEGFA, au fost mapate la căile KEGG asociate cu căile în cancer.

Figura 13 Rețeaua CTP.

4. Concluzii

În acest studiu, am analizat în primul rând situații complexe atunci când am luat în considerare relațiile spectru-efect între HM, WE și HR aleC. tubulosa. Amprentele HPLC șiteste antioxidanteau fost utilizate pentru a identifica diferențele dintre Hs, WE și HR deC. tubulosa. Conform amprentelor HPLC, 11 vârfuri au fost comune între cele 11 loturi de Hs, WE și HR. acid genipozidic,echinacozid, verbascozid, tubulozid A, șiizoacteozidăau fost identificate printre aceste vârfuri. Conținutul acestor cinci componente a fost determinat. În plus, efectele antioxidante aleC. tubulosaHs, WE și HR au variat datorită modificărilor compozițiilor chimice cauzate de condițiile complexe de fabricație. Pe baza modelelor statistice diversificate, studiul relației spectru-efect a indicat că vârful A6 ar putea fi componenta cea mai decisivă dintre cele trei forme deC. tubulosa. Studiul sa bazat pe farmacologia de rețea pentru a explora mecanismele potențiale aleC. tubulosapeantioxidareprin screening-ul compușilor, predicția țintelor cheie, construirea de rețele și efectuarea analizei de îmbogățire. Rezultatele noastre oferă o bază teoretică pentru reciclarea reziduurilor din plante și potențialulC. tubulosaîn tratamentul deboli legate de antioxidanti.