Acteozidul ca opțiune terapeutică potențială pentru carcinomul hepatocelular primar: un studiu preclinic

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Di Ma, Juan Wang, Lu Liu, Meiqi Chen și Zhiyong Wang

Abstract

Context: Carcinomul hepatocelular (HCC) este o tumoare malignă comună cu caracteristici de prognostic prost, morbiditate ridicată și mortalitate la nivel mondial. În special, doar câteva opțiuni de tratament sistemic sunt disponibile pentru pacienții cu HCC avansat și includ sorafenib și regimul de atezolizumab plus bevacizumab descris recent ca posibile tratamente de primă linie. Propunem aici actozidă, o glicozidă feniletanoidă distribuită pe scară largă în multe plante medicinale, ca un potențial candidat împotriva HCC avansat.

Metode: Proliferarea celulară, formarea coloniilor și migrarea au fost analizate în cele trei linii de celule HCC umane BEL7404, HLF și JHH-7. Analiza angiogenezei a fost efectuată folosind HUVES. Modelul de șoareci nuzi cu xenogrefă BEL7404 sau JHH-7 a fost stabilit pentru a analiza posibilele efecte antitumorale ale acteozidei. qRT-PCR și Western blotting au fost folosite pentru a dezvălui potențialele mecanisme antitumorale ale actozidei.

Rezultate:Acteozid din cistanchea inhibat proliferarea celulară, formarea de colonii și migrarea în toate cele trei linii de celule HCC umane BEL7404, HLF și JHH-7. Interzicerea angiogenezei de către actozidă a fost evidențiată de inhibarea formării tubului și a migrării celulare a HUVEC. Combinația de actozidă și sorafenib a produs o inhibare mai puternică a formării coloniilor celulare și a migrării celulelor HCC, precum și a angiogenezei HUVEC. Eficacitatea antitumorală in vivo a actozidei a fost demonstrată în continuare în modelul de șoareci nuzi cu xenogrefă BEL7404 sau JHH-7, cu o îmbunătățire atunci când este combinat cu sorafenib în inhibarea creșterii xenogrefei JHH{-7. Tratamentul suplimentar al celulelor JHH-7 cu acteozidă a evidențiat o creștere a nivelului proteinei supresoare tumorale p53, precum și o scădere a nivelului genei peptidazei asociate kalikreinei (KLK1, 2, 4, 9 și 10), fără a fi semnificativă. modificări ale restului genelor KLK1–15.

Concluzii:Acteozid din cistancheexercită un efect antitumoral posibil prin reglarea în sus a nivelurilor p53, precum și prin inhibarea expresiei KLK și a angiogenezei. Acteozidul ar putea fi util ca adjuvant în tratamentul HCC avansat în clinică.

Cuvinte cheie: Acteozidă, carcinom hepatocelular, Sorafenib, Xenogrefă, p53, Kallikrein

fundal

Carcinomul hepatocelular (HCC) este o tumoare malignă comună cu caracteristici de prognostic prost și morbiditate și mortalitate ridicată la nivel mondial [1, 2]. Au fost identificați diverși factori care contribuie la apariția și progresia HCC, inclusiv infecția cu virusul hepatitei B sau C, inactivarea genelor supresoare tumorale, cum ar fi p53, activarea anormală a oncogenelor precum K-ras și unele molecule de semnalizare. cum ar fi PI3K, ERK/MAPK și Wnt/-catenina, precum și evaziunea sistemului imunitar al gazdei [3, 4]. Pentru managementul HCC, rezecția, transplantul hepatic și ablația cu radiofrecvență sunt opțiuni pentru pacienții cu HCC în stadiu incipient, dar cu rate ridicate de recidivă și metastaze [3, 5, 6]. În plus, doar câteva opțiuni de tratament sistemic sunt disponibile pentru pacienții cu HCC avansat și includ sorafenib și regimul de atezolizumab plus bevacizumab descris recent ca posibile tratamente de primă linie [7]. În acest context, este de importanță și interes fie să se dezvolte noi agenți care vizează mai multe ținte moleculare, fie să se stabilească o nouă strategie, cum ar fi aplicarea terapiei combinate în tratamentul HCC avansat.

Acteozid din cistancheeste un glicozid feniletanoid distribuit pe scară largă în multe plante medicinale, inclusiv Ligustrum purpurascens [8], Rehmannia glutinosa [9] și Ligustrum purpurascens [10]. Dovezile crescânde au arătat că actozidul poate exercita diverse activități biologice, inclusiv activitatea sa antitumorală. De exemplu, actozidul a arătat efecte antiproliferative puternice asupra celulelor canceroase de prostată [11]. Livrarea intraperitoneală a actozidei a suprimat creșterea tumorii într-un model de șoarece cu melanom, posibil prin inhibarea proteinei kinazei C [12]. În plus, actozidul a potențat sensibilizarea celulelor cancerului colorectal la 5- Fluorouracil prin direcționarea semnalizării PI3K/Akt [13]. Datele noastre anterioare au arătat, de asemenea, inhibarea melanogenezei de către actozidă în celulele melanomului B16 [14]. În ciuda acestui fapt, sunt disponibile puține informații cu privire la posibila eficacitate a actozidei în tratamentul HCC și la mecanismele potențiale subiacente.

În studiul de față am arătat căActeozid din cistancheinhibă proliferarea celulară, formarea de colonii și migrarea în toate cele trei linii de celule HCC umane BEL7404, HLF și JHH7. Angiogeneza este, de asemenea, inhibată în urma tratamentului cu acteozidă, așa cum se arată prin inhibarea formării tubului și a migrării celulare a HUVEC. Eficacitatea antitumorală in vivo a actozidei este demonstrată în continuare în modelul de șoareci nuzi cu xenogrefă BEL7404 sau JHH-7, cu o îmbunătățire atunci când este combinat cu sorafenib în inhibarea creșterii xenogrefei JHH{-7. Efectele antitumorale ale actozidei ar putea fi atribuite reglării sale în sus a p53, precum și suprimării KLK și angiogenezei.

Metode

Cultură de celule

Liniile celulare de carcinom hepatocelular uman (HCC) BEL7404, HLF și JHH7 au fost obținute din American Type Culture Collection și au fost cultivate în mod obișnuit în mediu DMEM care conține 10% ser fetal bovin suplimentat cu 100 unități/ml penicilină G și 100 ug/ml streptomicina într-un incubator umidificat la 37 de grade cu 5% dioxid de carbon. Celulele endoteliale ale venei ombilicale umane (HUVEC) au fost izolate din venele cordonului ombilical uman (furnizate de ScienCell Research Laboratories, San Diego, SUA) și menținute într-un mediu de celule endoteliale așa cum a fost descris anterior [15].

ReactiviActeozid din cistanche (A01) a fost achiziționat de la Jiangsu Yongjian Medicine Technology Co., Ltd. (Taizhou, China; Lot nr. 100581; Puritate mai mare sau egală cu 99 la sută prin HPLC). Sorafenib a fost obținut de la Selleck Chemicals (Houston, SUA). Am dizolvat actozidul în soluție salină 0,9%. Soluția stoc de sorafenib a fost preparată în dimetil sulfoxid (DMSO; 10 mM), alicotată și depozitată la -20 de grade.

animale

În studiu au fost utilizați șoareci masculi BALB/c (Nu/Nu) (18-20 g, 6-8 săptămâni în momentul primirii) (Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd., Shanghai, China). Animalele au fost găzduite în cuști de polisulfonă ventilate individual, într-o cameră controlată cu temperatură și lumină (ciclu de întuneric de 12 ore de lumină- 12 ore, lumini aprinse la 7:00 dimineața) cu acces liber la hrană și apă . Toate protocoalele experimentale au fost aprobate de Comitetul Instituțional pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor și efectuate urmând liniile directoare ale Asociației Internaționale pentru Studiul Durerii privind utilizarea animalelor de laborator.

Testul de proliferare celulară Activitatea anti-proliferativă a fost realizată utilizând testul MTT. Pe scurt, celulele au fost placate la o densitate de 4–5 × 103 celule per godeu în plăci 96-godeuri. După ce au fost atașate peste noapte, celulele au fost tratate cu o serie de concentrații de actozidă. În urma tratamentelor medicamentoase la momentul indicat, celulele au fost incubate cu 3-(4,5- Dimetiltiazol{-2-il){-2,5-bromură de difeniltetrazoliu (MTT Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN, SUA. Concentrație finală: 5 ug/ml) timp de 3-4 ore la 37 de grade. Produsul formazan a fost dizolvat în DMSO pentru cuantificare la o lungime de undă de 570 nm.

Colony formation assay Cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells per well and allowed to attach to the bottom of the well overnight. Cells were then treated with indicated drugs at the given concentration. The culture medium was replaced every 3 days until colonies were visible on day 12 post-culturing. For colonies counting, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.1% crystal violet. Colonies>10 celule au fost numărate la microscop cu lumină (x 100 de mărire; Olympus, Tokyo, Japonia).

Test de vindecare a rănilor Celulele au fost însămânțate în plăci cu {{{0}}godeuri (1 × 105 celule per godeu) și cultivate la o confluență de 90%. Stratul de celule a fost zgâriat cu un vârf de pipetă steril de 200 ul pentru a produce un spațiu de rană. Migrarea celulelor în zona rănită a fost vizualizată la punctele de timp indicate (0, 10 și 24 de ore) la un microscop cu lumină inversată la o mărire de × 100. Fiecare experiment a fost efectuat în trei exemplare.

Testul formării tuburilor HUVEC-urile au fost cultivate așa cum s-a descris anterior [15]. Pe scurt, plăcile de 96-godeuri au fost acoperite cu Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, SUA) conform instrucțiunilor producătorului și apoi au fost înapoiate la incubator pentru a polimeriza timp de 30-40 de minute. HUVEC-urile au fost apoi însămânțate la o densitate de 2 × 105 celule/mL și tratate cu diferite medicamente date timp de 8 ore. Formarea tubului a fost fotografiată cu un microscop inversat la momentele de timp indicate și analizată folosind software-ul ImageJ.

Analiza Western blot

Lizatele totale de celule au fost preparate cu tampon de analiză de radioimunoprecipitare (RIPA) (50 mM Tris HCI la pH 8.0, 150 mM NaCI, 1% NP40, 1% deoxicolat de sodiu, 0,1% SDS, 10 ug/ml leupeptină, 10 ug/ml aprotinină și 2 mM PMSF). Probele de proteine ​​cu cantități egale (20 ug/bandă) au fost separate pe gel SDS-PAGE și transferate pe membrane PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA). Membranele au fost incubate peste noapte cu anticorp p53 (Cell Signaling Technology, Boston, MA). Pentru controalele de încărcare, membranele au fost clătite cu un tampon de stripare și resondate cu anticorpul -actină (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Proteinele au fost detectate folosind un sistem de detectare ECL (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, SUA).

qRT-PCR

ARN-ul total a fost extras din liniile celulare folosind reactivul Trizol (Invitrogen, SUA) și a suferit o reacție în lanț de transcripție inversă-polimerază (RT-PCR) pentru a sintetiza ADNc folosind un kit disponibil comercial. qRT-PCR în timp real folosind 2xSYBR qPCR Supermix verde a fost efectuat pe o mașină Stratagene Mx3000P PRC (Agilent Technologies, SUA). Secvențele primerului au fost prezentate mai jos: sens 5′-CACCATGTGG TTCCTGGTTC-3′ și anti-sens 5′-CAAACAAGTT GTGGCGACCC-3′ pentru KLK1; sens 5′-GTGTACAGTC ATGGATGGGC-3′ și anti-sens 5′-CCCAGAATCA CCCCCACAAG-3′ pentru KLK2; sens 5′- CCACACCC GCTCTACGATATGA-3′ și anti-sens 5′-CCC AGA ATCACCCGAGCAG-3′ pentru KLK3; sens 5′-CGCACA CTGTTTCCAGAACTC-3′ și anti-sens 5′-GTTG CAGGAGTCCTTCTGGT{-3′ pentru KLK4; sens 5′-CCTG CACCCACATCTTTCTCT-3′ și anti-sens 5′- GGTAAGCATCCTCGCACCTT-3′ pentru KLK5; sens 5′- CTCTCTCCTGGGGACACAGA-3′ și anti-sens 5′- TCCGCCATGCACCAACTTAT{-3′ pentru KLK6; sens 5′- TTTTGGAGCCCAGCTGTGTG-3′ și anti-sens 5′- GTCACCATTGCAGGCGTTTT{-3′ pentru KLK7; sens 5′- CTGGGCAGGACACTCCAG-3′ și anti-sens 5′- ACACCGCCACAGAGTAGTTG-3′ pentru KLK8; sens 5′- GTAGGGGGTTCTCGTAGGGT-3′ și anti-sens 5′- CGGTGACGTCATAGAGACGG-3′ pentru KLK9; sens 5′-CAGGAGTGCCAGCCTCAC-3′ și anti-sens 5′- CTGGGGAGGAAGAGGATGGA-3′ pentru KLK10; sens 5′-CCCACCCCTTGGATTCTGTCT-3′ și anti-sens 5′-GTGAACTATGTAGCGGGGCT-3′ pentru KLK11; sens 5′-TGTTCTTGGTGAGTTCTCCCG-3′ și anti-sens 5′-GGATCCAGTCCACATACTTGC-3′ pentru KLK12; sens 5′-CCTGAACCACGACCATGACA-3′ și anti-sens 5′-GCAGGGTTTGGATGTAGCCT-3′ pentru KLK13; sens 5′-CCCAACTACAACTCCCGGAC-3′ și anti-sens 5′-CCTGAAGCAACTGCTCGTGA{-3′ pentru KLK14; sens 5′-AGTTGCTGGAAGGTGACGAG- 3′ și anti-sens 5′-TGGCTAACATCTGGGCCTTG- 3′ pentru KLK15; sens 5′-GACAGTCAGCCGCATCTT CT-3′ și anti-sens 5′- GCGCCCAATACGACCAAA TC{-3′ pentru GAPDH. Valorile pragului ciclului (Ct) ale fiecărei gene KLK au fost normalizate la cele ale GAPDH și analizate cu software-ul MxPro.

Activitatea antitumorală in vivo a A01 singur sau în combinație cu sorafenib. Suspensiile de celule BEL74{04 au fost preparate (3 × 1{06 celule) și injectate subcutanat în flancul drept al şoareci nuzi atimici. La zece zile după inoculare, șoarecii purtători de tumoră (greutate corporală (g): 22–26; medie ± SEM: 23,8 ± 0,14) au fost examinați și selectați pentru randomizare în 7 grupuri de tratament după volumul tumorii ({{ {12}} mm3). Un total de 38 de șoareci au fost alocați la diferite grupuri de tratament (n=5 per grup, cu excepția grupului model (n=8)). Animalele au fost apoi tratate prin gavaj oral cu acteozid (A01; 12,5, 25 și 50 mg/kg), sorafenib singur (50 mg/kg) sau în combinație cu A01 (50 mg/kg) o dată pe zi timp de 14 zile. Mai mult, o doză de 20 mg/kg A01 a fost de asemenea administrată intravenos. Dozele au fost selectate pe baza studiilor anterioare și a datelor noastre preliminare [15]. Creșterea tumorii a fost monitorizată la fiecare 3 sau 4 zile folosind un șubler electronic, cu volumul calculat ca 0,5xlungimexlățime (mm3). În plus, a fost inclus un experiment paralel folosind inocularea JHH-7. La șapte zile după inoculare, șoarecii purtători de tumoră (greutate corporală (g): 20–26; medie ± SEM: 24,0 ± 0,20) au fost selectați și selectați pentru randomizare în grupuri de tratament în conformitate cu volumul tumorii (80-130 mm3 ). Un total de 23 de șoareci au fost alocați la 4 grupuri de tratament (n=5 per grup, cu excepția grupului model (n=8)). Animalele au primit apoi A01 (20 mg/kg, iv), sorafenib singur (50 mg/kg, ig) sau combinat cu A01 (20 mg/kg, iv) o dată pe zi timp de 14 zile consecutive. Toți șoarecii au fost anesteziați cu hidrat de clor (350 mg/kg) și sacrificați prin dislocarea gâtului la sfârșitul perioadei de observație. Și masa tumorală a fost îndepărtată și fotografiată cu o cameră digitală.

analize statistice

Toate datele sunt exprimate ca medie ± abatere standard (SD). Dacă nu se specifică altfel, analizele statistice au fost efectuate utilizând analiza varianței (ANOVA) urmată de un test Tukey posthoc. Valorile volumului tumorii sunt prezentate ca medie ± eroarea standard a mediei (SEM). ANOVA bidirecțională urmată de teste Tukey a fost utilizată pentru a analiza datele privind volumul tumorii. Pentru analizele statistice a fost folosit software-ul GraphPad Prism. O valoare de p < 0.05="" a="" fost="" considerată="" semnificativă="">

Rezultate

Efectele A01 asupra proliferării și formării coloniilor de HCC in vitro

Cele trei linii celulare HCC (BEL7404, HLF și JHH7) au fost utilizate pentru testul de proliferare celulară. După cum se arată în Fig. 1, testul MTT a arătat că A01 a inhibat proliferarea tuturor celor trei celule HCC. Pentru a întreba în continuare dacă activitatea antiproliferativă a A01 se datorează capacității sale de a inhiba clonogenitatea celulară, a fost efectuat testul de formare a coloniilor. A01 la 100 μM a arătat o inhibare puternică a formării coloniilor în celulele BEL7404 (Fig. 2a și b). Atunci când este combinat cu sorafenib (2 μM), potența de inhibiție a fost mai puternică decât cea a A01 sau a sorafenibului singur. Rezultate similare au fost observate și în celelalte două celule HCC, HLF și JHH-7 (Fig. 2c și d).

Efectele A01 în monoterapie sau în combinație cu sorafenib asupra migrației celulare a HCC in vitro

În continuare, am evaluat migrarea celulelor utilizând testul plăgii zgârieturi. După cum se arată în Fig. 3, combinația de A01 (100 sau 500 μM) și sorafenib (10 μM) a prevenit în mod semnificativ vindecarea rănilor în toate cele trei celule HCC, în comparație cu grupul de control. Pentru celulele BEL7404, atât A01 (100 sau 500 μM) cât și sorafenib (10 μM) au produs doar o tendință de prevenire a vindecării rănilor fără semnificație statistică (Fig. 3a și d). Pentru celulele HLF, A01 la 500 μM și sorafenib la 10 μM au inhibat vindecarea rănilor. În special, A01 (500 μM) combinat cu sorafenib (10 μM) a produs o inhibare mai puternică a vindecării rănilor decât sorafenib în monoterapie (Fig. 3b și e). Pentru celulele JHH, vindecarea rănilor a fost împiedicată de A01 (500 μM) și sorafenib (10 μM). Combinația de A01 (100 μM) și sorafenib (10 μM) a produs o inhibare mai puternică a vindecării rănilor decât A01 (100 μM) sau sorafenib (10 μM) în monoterapie. Mai mult, A01 la 500 μM combinat cu sorafenib (10 μM) a arătat o inhibare mai puternică a vindecării rănilor decât A01 (500 μM) sau sorafenib (10 μM) singur (Fig. 3c și f).

Efectele A01 în monoterapie sau în combinație cu sorafenib asupra angiogenezei in vitro

Angiogeneza este strâns asociată cu creșterea, progresia și metastaza tumorii [16] și, prin urmare, este considerată una dintre țintele de intervenție pentru tratamentul cancerului. Am efectuat mai întâi un test de formare a tubului pentru a analiza potențiala angiogeneză in vitro. După cum se arată în Fig. 4, tratamentul timp de 3 ore cu sorafenib în monoterapie (10 μM) sau combinația de A01 (100 și 500 μM) și sorafenib (10 μM) a început să prezinte efecte inhibitoare asupra formării structurilor asemănătoare vaselor, adică alungirea și alinierea HUVEC-urilor (Fig. 4a și c). După tratament timp de 8 ore, A01 (100 și 500 μM), sorafenib (10 μM), precum și combinația de A01 și sorafenib au inhibat în mod semnificativ formarea structurilor asemănătoare vaselor, cu inhibare mai puternică prin combinația de A01 și sorafenib decât A01 sau sorafenib singur (Fig. 4a și c). În plus, migrarea celulară a HUVEC-urilor este un pas cheie pentru formarea de noi vase în timpul angiogenezei și, prin urmare, este investigată. După cum se arată în Fig. 4b și d, A01 (500 μM), sorafenib (10 μM), precum și combinația de A01 (100 și 500 μM) și sorafenib (10 μM), toate au inhibat semnificativ migrația celulară a HUVEC-urilor. A01 (500 μM) combinat cu sorafenib (10 μM) a produs o inhibare mai puternică decât A01 (500 μM) sau sorafenib (10 μM) în monoterapie.

Efectele A01 singur sau în combinație cu sorafenib asupra creșterii tumorii in vivo a xenogrefelor BEL7404 și JHH-7 HCC

Pentru a evalua în continuare eficacitatea A01 singur sau combinat cu sorafenib asupra creșterii tumorii in vivo a HCC, am stabilit un model de șoarece nud de xenogrefă subcutanată folosind BEL7404 sau JHH-7 celule. După cum se arată în Fig. 5, volumul tumorii a fost mult scăzut după tratamentul cu A01 (25 și 50 mg/kg, prin gavaj oral; 2{0 mg/kg, prin vena cozii; toate p < 0,01="" față="" de="" grupul="" model)="" sau="" sorafenib="" (50="" mg/kg,="" prin="" gavaj="" oral;="" p="">< 0,01="" față="" de="" grupul="" model)="" singur="" (fig.="" 5a="" și="" b).="" combinația="" de="" a01="" (50="" mg/kg)="" și="" sorafenib="" (50="" mg/kg)="" a="" arătat="" o="" inhibare="" mai="" puternică="" a="" creșterii="" tumorii="" în="" comparație="" cu="" sorafenib="" în="" monoterapie="" (p="">< 0,01),="" dar="" a="" produs="" un="" efect="" similar="" cu="" cel="" a01="" singur="" (fig.="" 5a="" și="" c.="" ).="" apoi="" am="" folosit="" modelul="" de="" șoareci="" nuzi="" cu="" xenogrefă="" jhh-7="" pentru="" a="" testa="" în="" continuare="" posibilele="" eficacități="" antitumorale="" ale="" a01.="" după="" cum="" se="" arată="" în="" fig.="" 6,="" tratamentul="" cu="" a01="" (20="" mg/kg,="" iv)="" sau="" sorafenib="" (50="" mg/kg,="" ig)="" a="" produs="" o="" inhibare="" semnificativă="" a="" creșterii="" tumorii="" a="" xenogrefei="" jhh-7="" (p="">< 0,01="" față="" de="" grupul="" model).="" ),="" cu="" inhibare="" mai="" mare,="" atunci="" când="" sunt="" combinate="" împreună="" (fig.="" 6a="" și="" b;="" p="">< 0,01="" vs="" a01="" sau="" grupul="" sorafenib="">

Posibilă modulare a peptidazei înrudite cu kalikreină și p53 de cătreActeozid din cistanche

Peptidaza legată de kalikreină (KLK) a fost sugerată ca un biomarker al cancerului în diagnosticul și prognosticul diferitelor tipuri de cancer, inclusiv carcinomul hepatocelular datorită expresiei dereglate [17-19]. În acest scenariu, am detectat expresia genică a KLK1–15 în linia celulară HCC JHH-7. După cum se arată în Fig. 7, tratamentul cu acteozidă a produs o inhibare semnificativă a nivelurilor de ARNm KLK1, 2, 4, 9 și 10 (Fig. 7a-e), fără modificări semnificative ale restului KLK1-15 (datele nu sunt prezentate). ). În plus, am detectat și nivelul proteinei supresoare tumorale p53 și am evidențiat o creștere prin tratamentul cu actozidă (Fig. 7f).

Discuţie

Managementul HCC avansat a fost de mult timp insolubil din cauza incapacității de diagnostic în stadiile incipiente și a chimiorezistenței tumorii [5, 6]. Sorafenib, inhibitorul multikinazei raportat că inhibă proliferarea celulară și angiogeneza, împreună cu un alt inhibitor oral de multikinază lenvatinib a devenit tratamentul standard al HCC avansat [3, 5, 20, 21]. Cu toate acestea, ratele generale de supraviețuire sunt modeste în lumina ratelor scăzute de răspuns și a inadecvării în mediile clinice [3, 22]. Un studiu recent a arătat că atezolizumab plus bevacizumab au produs rezultate clinice mai bune decât sorafenib la pacienții cu CHC nerezecabil, făcând această combinație o posibilă nouă opțiune de tratament de primă linie pentru CHC avansat [7]. În acest context, am identificat că glicozida feniletanoid,Acteozid din cistanchea inhibat proliferarea celulară, formarea de colonii și migrarea în cele trei linii de celule HCC umane BEL7404, HLF și JHH-7, precum și a interzis angiogeneza HUVEC. Combinația de actozidă și sorafenib a produs o inhibare mai puternică a formării coloniilor celulare și a migrării celulelor HCC, precum și a angiogenezei HUVEC. Acteoside a prezentat eficacitatea antitumorală în modelul de șoareci nuzi cu xenogrefă BEL7404 sau JHH-7, cu o îmbunătățire atunci când este combinat cu sorafenib în inhibarea creșterii xenogrefei JHH{-7. Analize ulterioare au relevat o creștere a p53, precum și o scădere a unor gene KLK. În consecință, ar trebui luată în considerare posibila utilizare a actozidei ca adjuvant în tratamentul HCC avansat în clinică.

Creșterea dovezilor a arătat efectele antitumorale aleActeozid din cistancheîn diferite celule tumorale, cum ar fi celulele de melanom B16, celulele de glioblastom, celulele canceroase colorectale, celulele de carcinom bucal cu celule scuamoase, celulele canceroase de prostată și celulele de adenocarcinom mamar uman [11–13, 23–25] sau la animalele purtătoare de tumori [12]. În ciuda acestui fapt, puține studii s-au concentrat asupra efectelor actozidei asupra HCC in vitro sau in vivo, cu excepția unui studiu care a folosit dietilnitrozamină ca agent cancerigen pentru a induce hepatocarcinogeneza la șobolani și care dezvăluie chimioprevenția prin acteozidă [26]. În studiul actual, am arătat inhibarea de către acteozide a proliferării celulare, a formării de colonii și a migrării în liniile de celule HCC, precum și creșterea tumorii la șoarecii care poartă xenogrefe de linie celulară HCC, demonstrând astfel în mod direct efectele antitumorale ale acteozidei în HCC. Mai mult, combinația de actozidă și sorafenib a produs efecte antitumorale și mai puternice. În combinație cu dovezile conform cărora actozidul este protector împotriva leziunilor hepatice [27–29] fără efecte toxice la animale și fără mutagenitate [30], pare a fi fezabil pentru aplicarea viitoare a terapiei combinate de acteozid și sorafenib la pacienții cu stadiu avansat. HCC în clinică.

Familia kalikreinei umane cuprinde 15 serin proteaze asemănătoare tripsinei sau chimotripsinei secretate omoloage, cu un singur lanț (KLK1-15) și a fost implicată în reglarea creșterii tumorii, progresiei neoplazice, angiogenezei și metastazelor [18, 31]. În special, KLKs a fost sugerat ca un biomarker al cancerului în diagnosticul și prognosticul diferitelor tipuri de cancer, inclusiv carcinomul hepatocelular datorită expresiei sale dereglate [17-19]. De exemplu, KLK1 este propus ca biomarker al cancerului gastric datorită creșterii nivelurilor KLK1 în neoplasmul gastric și prevenirea creșterii tumorii în cancerul gastric prin inhibarea activității KLK1 cu proteina de legare a calicreinei (KBP) [32]. În acest scenariu, am observat o inhibare semnificativă a nivelurilor de ARNm KLK de către actozidă (KLK1, 2, 4, 9 și 10). Aplicarea KBP, care se leagă în mod specific de kalikreina tisulară și inhibă activitatea kalikreinei, a fost raportată că suprimă creșterea HCC la șoareci, posibil prin activitatea sa anti-angiogenă [33], sugerând posibila implicare a KLK în progresia HCC. În plus, proteina supresoare tumorală p53 este capabilă să inducă senescența, apoptoza, precum și oprirea ciclului celular. Expresia crescută a p53 conferă chimiosensibilitate sporită celulelor canceroase [34]. În acest sens, rezultatele noastre occidentale au arătat o creștere a nivelurilor p53 în urma tratamentului cu acteozid. Luate împreună, este rezonabil să deducem că actozidul exercită efecte antitumorale asupra HCC, posibil prin reglarea sa în sus a p53, precum și prin inhibarea KLK și a angiogenezei.

Trebuie remarcat faptul că ținta moleculară directă către careActeozid din cistanchear putea lega direct este încă neclar. Datele noastre preliminare folosind andocare moleculară au evidențiat legarea directă a actozidei cu kalikreina (datele nu sunt prezentate). Ar fi necesare experimente suplimentare pentru a clarifica această presupunere. În plus, în ceea ce privește dozele de acteozidă utilizate pentru testarea celulară în studiu de 10–5{0 ori mai mari decât cea de sorafenib (10 μM), în primul rând am ales acele doze de acteozidă în conformitate cu relația doză-răspuns în testul MTT. În al doilea rând, dozele pe care le-am folosit (100, 500 μM) au fost comparabile cu studiile anterioare [35], în care actozidul (100 μM) a inhibat proliferarea celulară a celulelor cancerului colorectal. În sfârșit, în ciuda dozei mai mari în testul celular, actozidul a produs o inhibare pronunțată a creșterii tumorii în modelul de șoareci nuzi cu xenogrefă HCC în studiul nostru (25 și 50 mg/kg), efectele fiind similare cu sorafenib (50 mg/kg). Pentru sorafenib, a fost utilizat în studiul nostru la doza de 10 μM la nivel celular. Această doză este comparabilă cu studiile anterioare în care sa constatat că sorafenib inhibă viabilitatea celulelor cu un IC50 de 4,0–6,5 μM în liniile celulare HCC ale celulelor PLC/PRF/5 și HepG2. În schimb, doza de sorafenib utilizată pentru a suprima creșterea xenogrefelor HCC la șoarecii femele SCID a fost de 30 mg/kg (po prin gavaj) [36]. În clinică, doza recomandată de sorafenib pentru pacient este de 400 mg pe dată (2*0,2 g), de două ori pe zi (800 mg pe zi în total). Această doză de sorafenib utilizată în clinică este în contrast cu cea utilizată în analiza celulară (valoarea IC50 în nivel μM), posibil datorită absorbabilității sale slabe în condiții in vivo. Pentru actozidă, pe baza dozei sale la șoareci (50 mg/kg, ig), doza sa echivalentă pentru oameni (60 kg BW) este de aproximativ 250 mg. Această doză este comparabilă cu cea a sorafenibului utilizat în clinică și ar trebui să fie acceptabilă pentru pacienți.

Concluzii În concluzie,Acteozid din cistancheeste capabil să exercite un efect antitumoral în liniile de celule HCC și la șoarecii nuzi care poartă xenogrefe de linie celulară HCC, efecte posibil prin creșterea nivelului p53, precum și prin interzicerea KLK și angiogeneza. Acteozidul ar putea fi util ca adjuvant în tratamentul HCC avansat în clinică.

Referințe

1 Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimations of incident and mortality worldwide for 36 cancers in 185 states. CA Cancer J Clin. 2018;68(6):394–424..

2. Llovet JM, Zucman-Rossi J, Pikarsky E, Sangro B, Schwartz M, Sherman M, Gores G. Carcinom hepatocelular. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16018.

3. Sim HW, Knox J. Carcinomul hepatocelular în era imunoterapiei. Curr Probl Cancer. 2018;42(1):40–8. 4. Jiang Y, Han QJ, Zhang J. Carcinom hepatocelular: mecanisme de progresie și imunoterapie. World J Gastroenterol. 2019;25(25):3151– 67.

5. Forner A, Da Fonseca LG, Diaz-Gonzalez A, Sanduzzi-Zamparelli M, Reig M, Bruix J. Controversies in the management of hepatocellular carcinom. JHEP Rep. 2019;1(1):17–29.

6. Hartke J, Johnson M, Ghabril M. Diagnosticul și tratamentul carcinomului hepatocelular. Semin Diagn Pathol. 2017;34(2):153–9.

7. Finn RS, Qin S, Ikeda M, Galle PR, Ducreux M, Kim TY, Kudo M, Breder V, Merle P, Kaseb AO și colab. Atezolizumab plus Bevacizumab în carcinomul hepatocelular nerezecabil. N Engl J Med. 2020;382(20):1894–905.

8. He ZD, Ueda S, Akaji M, Fujita T, Inoue K, Yang CR. Glicozide monoterpenoide și feniletanoide din Ligustrum peduncular. Fitochimie. 1994;36(3):709–16.

9. Li H, Chou GX, Wang ZT, Hu ZB. Determinarea HPLC aacteozidîn Radix Rehmanniae. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2006;31(10):822–4.

10. Wong IY, He ZD, Huang Y, Chen ZY. Activitățile antioxidante ale glicozidelor feniletanoide din Ligustrum purpurascens. J Agric Food Chim. 2001;49(6):3113–9.

11. Mulani SK, Guh JH, Mong KK. O strategie generală de sinteză și proprietățile anti-proliferare pe liniile celulare de cancer de prostată pentru glicozide feniletanoide naturale. Org Biomol Chim. 2014;12(18):2926–37.

12. Cheimonidi C, Samara P, Polychronopoulos P, Tsakiri EN, Nikou T, Myrianthopoulos V, Sakellaropoulos T, Zoumpourlis V, Mikros E, Papassideri I, et al. Citotoxicitatea selectivă a substanței plantelor actozide împotriva celulelor tumorale și a perspectivelor sale mecanice. Redox Biol. 2018;16:169–78.

13. Attia YM, El-Kersh DM, Wagdy HA, Elmazar MM. Verbascozidă: identificarea, cuantificarea și sensibilizarea potențială a celulelor canceroase colorectale la 5-FU prin țintirea căii PI3K/AKT. Sci Rep. 2018;8(1):16939.

14. Liu S, Zhao Z, Huo Z, Xu Z, Zhong Y, Wang X, Yang Y, Wang Z. Extractul apos de flori Osmanthus fragrans și actozidul său îmbogățit inhibă melanogeneza și pigmentarea indusă de ultraviolete. Nat Prod Commun. 2018;13(5):575–80.

15. Wang J, Ma S, Chen X, Zhang S, Wang Z, Mei Q. Noul inhibitor PI3K S1 face sinergie cu sorafenib în celulele canceroase pulmonare non-mici care implică semnalizarea Akt-S6. Investig noi medicamente. 2019;37(5):828–36.

16. Hanahan D, Weinberg RA. Semnele distinctive ale cancerului: următoarea generație. Celulă. 2011;144(5):646–74. 17. Emami N, Diamandis EP. Utilitatea peptidazelor legate de kalikreină (KLK) ca biomarkeri ai cancerului. Clin Chem. 2008;54(10):1600–7.

18. Tailor PD, Kodeboyina SK, Bai S, Patel N, Sharma S, Ratnani A, Copland JA, She JX, Sharma A. Diagnostic and prognostic biomarker potential of kallikrein family genes in different cancer types. Oncotarget. 2018;9(25): 17876–88.

19. Kontos CK, Mavridis K, Talieri M, Scorilas A. Kallikrein-related peptidases (KLKs) in gastrointestinal cancer: mecanicistic and clinical aspects. Tromb Haemost. 2013;110(3):450–7.

20. Cheng AL, Kang YK, Chen Z, Tsao CJ, Qin S, Kim JS, Luo R, Feng J, Ye S, Yang TS și colab. Eficacitatea și siguranța sorafenibului la pacienții din regiunea Asia-Pacific cu carcinom hepatocelular avansat: un studiu de fază III randomizat, dublu-orb, controlat cu placebo. Lancet Oncol. 2009;10(1):25–34. 21. Llovet JM, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Gane E, Blanc JF, de Oliveira AC, Santoro A, Raoul JL, Forner A, et al. Sorafenib în carcinomul hepatocelular avansat. N Engl J Med. 2008;359(4):378–90.

22. Cântec MJ. Chimioterapia cu perfuzie a arterei hepatice pentru carcinomul hepatocelular avansat. World J Gastroenterol. 2015;21(13):3843–9.

23. Liao YF, Rao YK, Tzeng YM. Extractul apos de anisomele India și compusul său purificat exercită activitate anti-metastatică prin inhibarea activării MMP-9 dependente de NF kappaB/AP-1-în celulele MCF-7 ale cancerului de sân uman. Food Chem Toxicol. 2012;50(8):2930–6.

24. Zhang Y, Yuan Y, Wu H, Xie Z, Wu Y, Song X, Wang J, Shu W, Xu J, Liu B și colab. Efectul verbascozidei asupra apoptozei și metastazelor în carcinomul bucal cu celule scuamoase uman. Int J Cancer. 2018;143(4):980–91.

25. Hwang TW, Kim DH, Kim DB, Jang TW, Kim GH, Moon M, Yoon KA, Choi DE, Park JH, Kim JJ. Efectul anticancerigen sinergic al chimioterapiei cu glioblastom pe bază de actozidă și temozolomidă. Int J Mol Med. 2019; 43(3):1478–86.

26. Peerzada KJ, Faridi AH, Sharma L, Bhardwaj SC, Satti NK, Shashi B, Tasduq SA. Acteozidul mediază chemoprevenția carcinogenezei hepatice experimentale prin stresul oxidativ și apoptoza reglate STAT-3. Environ Toxicol. 2016;31(7):782–98.

27. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Metabolites of dietary Acteoside: profiles, isolation, identification, and Hepatoprotective capacities. J Agric Food Chim. 2018;66(11):2660–8.

28. Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Namba T, Kadota S. Acteozidul inhibă apoptoza în leziunile hepatice induse de D-galactozamină și lipopolizaharide. Life Sci. 1999;65(4):421–30.

29. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z, Huang Y. Efectul protector al acteozidei asupra leziunilor hepatice imunologice induse de Bacilul Calmette Guerin plus lipopolizaharidă. Planta Med. 2009;75(14):1463–9.

30. Lu B, Li M, Zhou F, Huang W, Jiang Y, Mao S, Zhao Y, Lou T. Extractul bogat în glicozide feniletanoid din floare parfumată Osmanthus: studii de toxicitate acută și subcronică. J Etnofarmacol. 2016;187:205–12.

31. Diamandis EP, Yousef GM. Kalikreinele din țesut uman: o familie de noi biomarkeri ai cancerului. Clin Chem. 2002;48(8):1198–205.

32. Sawant S, Snyman C, Bhoola K. Compararea expresiei kalikreinei tisulare și a receptorilor de kinin în ulcere gastrice și neoplasme. Int Imunofarmacol. 2001;1(12):2063–80.

33. Lu L, Yang Z, Zhu B, Fang S, Yang X, Cai W, Li C, Ma JX, Gao G. Proteina Kallikreinbinding suprimă creșterea carcinomului hepatocelular prin activitate antiangiogenă. Cancer Lett. 2007;257(1):97–106.

34. Guntur VP, Waldrep JC, Guo JJ, Selting K, Dhand R. Creșterea proteinei p53 sensibilizează cancerul pulmonar cu celule non-mici la paclitaxel și cisplatină in vitro. Anticancer Res. 2010;30(9):3557–64.

35. Zhou L, Feng Y, Jin Y, Liu X, Sui H, Chai N, Chen X, Liu N, Ji Q, Wang Y, Li Q. Verbascozidul promovează apoptoza prin reglarea semnalizării HIPK2-p53 la om cancer colorectal. BMC Cancer. 2014;14:747.

36. Liu L, Cao Y, Chen C, Zhang X, McNabola A, Wilkie D, Wilhelm S, Lynch M, Carter C. Sorafenib blochează calea RAF/MEK/ERK, inhibă angiogeneza tumorii și induce apoptoza celulelor tumorale în hepatocelulare carcinom model PLC/PRF/5. Cancer Res. 2006;66:11851–8.