Partea întâi Polarizarea microgliei M1 reprimată prin acteozidă prin calea de semnalizare NF-κB inhibată și recuperarea funcției mitocondriilor mediată de AMPK

pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

PARTEA 1 Cum Cistanche Acteoside îmbunătățește vitalitatea celulelor creierului și ameliorează boala Alzheimer?

Click pentru produse Cistanches

Universitatea farmaceutică Ying-Qi Li China

Universitatea farmaceutică Yi Chen China

Universitatea farmaceutică Si-Qi Jiang China

Universitatea Farmaceutică Yuan-Yuan Shi China

Universitatea farmaceutică Xiao-Li Jiang China

Shan-Shan Wu China Pharmaceutical University

Universitatea Farmaceutică Ping Zhou China

Universitatea farmaceutică Hui-Ying Wang China

Universitatea Farmaceutică Ping Li China

Cuvinte cheie de cercetare: acteozid, celule BV-2, metabolism, ARN-seq, mitocondrii, neuroinflamație

Abstract

Context: boala Alzheimer (AD) este cel mai frecvent tip de demență. In timp ceacteozid(ACT), un compusizolatdinCistanche tubulosa, posedăproprietăți neuroprotectoare. Cu toate acestea, mecanismul de bază în reglarea polarizării microgliei rămâne prost definit. Metode: Aici, modelul AD indus de AlCl3-la larvele de zebră a fost aplicat pentru a descoperi eficacitatea terapeutică a ACT. Celulele BV-2 au fost folosite pentru a demonstra rolul ACT asupra polarizării microgliei. Secvența ARN, HPLC-Q-TOF-MS, western blot și andocarea moleculară au fost combinate pentru a-și confirma mecanismul.

Rezultate: ACT a ameliorat semnificativ diskinezia experimentală și tulburările sistemului nervos la zebra. Ulterior, a suprimat polarizarea M1 și a promovat fenotipul M2 în celulele BV-2 induse de LPS. Am demonstrat pentru început că ACT a exercitat un impact transcriptomic profund, care a implicat reglarea căilor cheie de semnalizare în inflamație, biosinteza argininei, precum și biosinteza pantotenatului și CoA, corelând cu funcția mitocondriilor. Tratamentul ACT a redus polarizarea microgliei M1 prin inhibarea căii de semnalizare NF-κB. Și căile metabolice au fost confirmate în continuare de HPLC-Q-TOF-MS. În plus, ACT a rectificat ROS excesiv pentru a restabili funcția mitocondriilor prin reglarea PGC-1 și UCP-2 mediată de AMPK, în concordanță cu modificările metabolice. În mod intrigant, ACT se poate lega direct atât de NF-kB, cât și de AMPK, așa cum se dovedește prin andocare moleculară. Concluzii: Cercetarea a oferit un mecanism infuziv al ACT și a ilustrat o nouă perspectivă bazată pe disfuncția mitocondrială pentru a dezvălui legătura dintre metabolism și polarizarea microgliei.

fundal

Boala Alzheimer (AD) este o boală neurodegenerativă frecventă însoțită de tulburări cognitive și diskinezie[1]. Se caracterizează prin pierderi neuronale severe, plăci senile și încurcături neuro-brilare[2]. Patogenia AD este multidimensională și este legată de neuroinflamație. Neuroinflamația este determinată de activarea celulelor gliale, strâns legată de dezvoltarea AD[3, 4]. În timpul progresiei și exacerbarii neuroinflamației, microglia este considerată factorul cheie. Microglia sunt celulele imune primare din sistemul nervos central. Este strâns asociat cu o cascadă de procese, care conțin dezvoltarea creierului, menținerea unui mediu neutru, precum și răspunsul la răni și reparații[1]. Mai mult, microglia poate fi stimulată la un fenotip M1, iar expresia citokinelor proinflamatorii este crescută atunci când au apărut boli legate de neuroinflamație, cum ar fi AD[5]. Studiile demonstrează, de asemenea, că polarizarea la fenotipul M1 este adesea însoțită de tulburări metabolice[6], provocând dezechilibru al metabolismului energetic și disfuncție mitocondrială[7]. Aceste modificări adverse sunt derivate din neurodegenerare, chiar AD.

Acteozid(ACT), o glicozidă feniletanoidă, este derivată în principal dinCistanchetubulosa. Dovezile tot mai mari au sugerat căACTposeda numeroase farmacologiceactivități, inclusiv efecte neuroprotective[8], antiinflamatorii[9] și antioxidante[10]. În special, s-a raportat că ACT îmbunătățește tulburările de învățare și memorie, precum și reglarea în creștere a metabolismului energetic la șobolanii induși de streptozotocină[11]. De asemenea, s-a sugerat să inhibe moartea celulelor apoptotice neuronale și deteriorarea mitocondrială la șoarecii experimentali cu encefalomielita autoimună [12]. Cu toate acestea, mai puține studii s-au concentrat asupra efectului ACT asupra polarizării microgliei M1/M2. În special, diferite mecanisme, cum ar fi repararea funcției mitocondriilor și reglarea metabolismului celular, nu au fost efectuate. În plus, mecanismul deACTa contribuit la polarizarea microgliei M1/M2 a rămas neexplorată. Prezentul raport a avut ca scop investigarea eficacității terapeutice a ACT, precum și mecanismul molecular de bază alACTînANUNȚ. Aici,ACTa arătat un efect de neuroprotecție semnificativ la larvele de pește zebra AD induse de AlCl3-. În plus, ACT a inhibat eficient polarizarea M1 și a promovat fenotipul M2 în celulele BV-2 induse de LPS. Secvențierea ARN (ARN-Seq) integrată cu metoda metabolomică pentru a înțelege mai bine mecanismul de bază al ACT în reglarea polarizării microgliei. A fost investigată diafonia dintre metabolism și polarizarea microgliei în ceea ce privește funcția mitocondrială. Acest studiu va oferi un nou respect pentru investigarea ulterioară a ACT ca un potențial agent terapeutic pentru tratarea AD.

Metode

Animale și grupare model

Zebra de tip sălbatic (tulpina AB, 4 luni) au fost alese în acest studiu (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Acestea au fost menținute sub un ciclu lumină/întuneric de 14/10 h la 28 de grade, urmând metoda anterioară[13]. Îngrășământul natural și embrionii dezvoltați în mod normal au fost generați și cultivați la 3 zile post-fertilizare (pdf) într-un incubator cu iluminare. Toate experimentele peștilor zebra au fost efectuate sub supravegherea Comitetului de etică a animalelor din China Pharmaceutical University. Larvele de pește zebra au fost împărțite în șase grupuri și tratate de la 3 pdf la 7 pdf: grup martor, grup model, grup model plus clorhidrat de donepezil (DPZ), grup model plus ACT. Grupul de control a fost menținut în mediu cu 0,2% DMSO și grupul model a fost tratat cu 150 μM AlCl3 (pH 5,8). Grupul model plus DPZ a fost co-tratat cu AlCl3 și 8 μM DPZ. Grupurile model plus ACT au fost co-tratate cu AlCl3 și diferite concentrații de ACT (200, 100, 50 μM). ACT (puritate HPLC mai mare sau egală cu 98 la sută) a fost obținut de la Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, China). AlCl3.6H2O și DPZ au fost achiziționate de la Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (Shanghai, China).

Analiza comportamentală Pagina 3/34Mișcările larvelor de pește zebra au fost înregistrate cu un analizor de comportament ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) la 28 de grade. Pe scurt, parametrii comportamentali și procesarea rezultatelor au fost în concordanță cu metoda pe care am stabilit-o mai devreme[13]. Aici, viteza medie (AS), schimbarea vitezei (ΔS), rata de recuperare a discineziei (DRR) și eficiența răspunsului (RE, procente) au fost selectate pentru a evalua recuperarea diskineziei la peștele zebra.

Determinarea activității acetilcolinesterazei (AChE) și colin acetiltransferazei (ChAT)

După tratamentul de la 3 pdf la 7 pdf, larvele de pește zebra au fost colectate pentru a măsura activitatea AChE și ChAT.

Pe baza protocolului producătorului, activitatea a fost detectată prin kiturile de test imunosorbent legat de enzime (ELISA) (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China). Și concentrațiile de proteine ​​din diferite probe au fost determinate prin metoda BCA

Culturi celulare și tratamente

Linia celulară BV-2 (linia celulară microglială murină imortalizată) a fost achiziționată de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, SUA). Au fost cultivate în DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, China). Mediul a fost suplimentat cu 10% FBS (Gibco, Grand Island, NY, SUA), 100 U/ml penicilină, precum și 100 mg/ml streptomicină, cu 95% aer/5% CO2 la 37 de grade. Celulele BV-2 au fost incubate cu ACT (50, 25, 12,5 μM) sau stimulate cu lipopolizaharidă (LPS, 1 ug/mL; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, SUA) timp de 24 de ore. În cele din urmă, toate celulele sau supernatantul au fost colectate pentru diferitele analize.

Test de viabilitate celulară

Testul Kit Counting Kit-8 (CCK{-8) (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) a fost utilizat pentru a evalua viabilitatea celulelor BV-2. Celulele au fost însămânțate într-o placă de 96-godeuri (1 × 104 celule/godeu, Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.). Pe scurt, mediul a fost îndepărtat la sfârșitul tratamentului și 100 μL de mediu fără ser care conține soluție de CCK-8 au fost adăugate în fiecare godeu timp de 2 ore la 37 de grade. Absorbanța a fost măsurată la 450 nm cu un cititor de microplăci (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, SUA). Viabilitatea celulară este exprimată ca procent din grupul de control. Experimentul a fost repetat de trei ori.

Analiza producției de oxid nitric (NO).

NO a fost determinat prin măsurarea nivelurilor de nitriți din supernatantul culturii BV-2 folosind reactivul Griess. Pe scurt, la sfârșitul tratamentului, mediul (100 μL) a fost transferat pe o nouă placă de 96-godeuri. Același volum de reactiv Griess a fost adăugat în fiecare godeu și a reacționat timp de 15 minute la întuneric. Absorbția la 540 nm a fost determinată de un cititor de microplăci.

Nivelurile de citokine inflamatorii din supernatant

Concentrațiile de TNF-, IL-1 și IL-10 în supernatantul celulelor BV-2 au fost determinate prin truse ELISA conform instrucțiunilor producătorului (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China). ).

Observarea morfologiei celulare

Pentru a determina efectul ACT asupra polarizării M1/M2 a celulei BV-2, celulele au fost placate într-un vas de 6-godeuri și observate la microscop inversat (Nikon ECLIPSE Ti2, Japonia).

Determinarea metabolismului celular prin analiza HPLC-Q-TOF-MS

Celulele BV{{0}} au fost însămânțate într-un vas de 6-godeuri separat (n=6/grup). După tratament, mediul a fost îndepărtat, iar celulele au fost spălate de trei ori cu PBS rece. Apoi imediat expus la azot lichid pentru a suprima metabolismul celular. Celulele au fost recoltate cu 80 procente de metanol rece (1 mL/godeu) și suspensia a fost transferată într-un tub Eppendorf de 2 mL. Pentru a facilita precipitarea proteinelor, agitați puternic timp de 1 minut și centrifugați la 13,000 rpm timp de 15 minute la 4 grade. Suspensia celulară a fost transferată într-un tub Eppendorf nou de 2 ml și uscată sub un curent de azot și depozitată la -80 grade până la analiză. Reziduul uscat a fost reconstituit în 15{{40}} μL de acetonitril 25% prerăcit. Pentru a asigura stabilitatea și acuratețea analizei secvenței, volume egale (10 μL) din fiecare probă de celule au fost combinate ca probe de control al calității (QC). În timpul detectării metaboliților, aceste probe au fost injectate la fiecare șase probe de celule pentru a le confirma stabilitatea. O alicotă de 1 μL a fost injectată pentru HPLC-Q-TOF-MS. Analiza HPLC-Q-TOF-MS a fost efectuată pe sistemul HPLC Agilent 1290 conectat cu spectrometrul de masă Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA). Separarea a fost efectuată pe o coloană ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1×100 mm, 1,7 μm). Faza mobilă a fost compusă din 0,1 procente acid formic-apă (v/v; A) și acetonitril (B). Debitul a fost stabilit la 0,4 mL/min cu următoarea condiţie de eluare a gradientului optim: 0 până la 2 min, 5 procente B; 2 până la 20 min, 5% până la 95% B (mod ioni pozitivi); 0 până la 2 min, 5 procente B; 2 până la 20 min, 5% până la 95% B (mod ioni negativi). Parametrii de funcționare ai spectrometrului de masă au fost stabiliți după cum urmează: temperatura gazului, 320 de grade; gaz de uscare, 10 L/min; nebulizator, 35 psi; VCap, 4000 V; fragment, 120 V. Datele brute au fost operate sub MassHunter Workstation Software versiunea B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA). Datele brute au fost preprocesate de platforma XCMS. Analiza componentelor principale (PCA) și analiza discriminantă parțială a celor mai mici pătrate (PLS-DA) a datelor normalizate au fost efectuate cu MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). În combinație cu literatura de specialitate, metaboliții diferențiali (VIP > 1, testul T P < 0,05)="" au="" fost="" identificați="" pe="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" în="" cele="" din="" urmă,="" analiza="" căii="" a="" fost="" efectuată="" cu="">

Măsurarea potențialului membranei mitocondriale (MMP)

MMP a fost detectat folosind o sondă fluorescentă JC-1 (Beyotime, China) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Pe scurt, celulele din diferite grupuri au fost clătite cu PBS și incubate cu soluție de colorare JC-1 timp de 20 de minute la 37 de grade. După colorare, celulele au fost spălate de două ori folosind tampon de colorare. Apoi, semnalele fluorescente au fost detectate prin citometrie în flux (BD Accuri C6).

Măsurarea adenozinei 5’-trifosfat mitocondrial (ATP)

Concentrația de ATP în mitocondrii a fost detectată printr-un kit de testare ATP (Beyotime, China) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Pe scurt, mediul de cultură al celulelor BV-2 din diferite grupuri a fost aruncat, iar celulele au fost omogenizate cu tampon de liză pe gheață. Supernatantul obținut după centrifugare (12,000 g, 5 min) a fost utilizat pentru a determina concentrația de ATP. Luminescența (reacție §uoresceină catalizată de luciferază) a fost detectată de EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).

Măsurarea nivelului speciilor reactive de oxigen intracelulare (ROS).

Kitul de testare ROS (Beyotime, China) a fost folosit pentru a măsura nivelul ROS. Celulele din diferite grupuri au fost incubate cu DCFH-DA (10 μM) timp de 20 de minute la 37 de grade. După încărcarea sondei, celulele au fost spălate de trei ori cu DMEM. Apoi, semnalele §uorescente au fost detectate prin citometrie în flux (BD Accuri C6)

Microscopia electronică cu transmisie (TEM)

Celulele BV-2 au fost însămânțate într-un vas de 6-godeuri. Mediul a fost îndepărtat și 1 mL de 2,5% glutaraldehidă a fost adăugat rapid în fiecare godeu. Apoi celulele au fost transferate într-un tub Eppendorf de 1,5 ml și centrifugate la 1000 rpm timp de 3 minute. Celulele au fost fixate peste noapte cu glutaraldehidă nouă 2,5% la 4 grade. După ¦xare, deshidratare și încorporare, celulele au fost observate cu un microscop electronic cu transmisie HT7800 (Hitachi, Tokyo, Japonia).

ARN-seq și analiza datelor bioinformatice

ARN total din celulele BV-2 (n=3/grup) au fost extrase folosind reactiv Trizol (Vazyme Biotech, China) conform instrucțiunilor producătorului de reactiv. Toate probele analitice au fost trimise la Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) pentru efectuarea testului secvenței ARN. Datele au fost analizate pe platforma online gratuită a Majorbio Cloud Platform. Parametrii pentru analiza expresiei diferenţiale au fostP-ajustați <0.05 și |log2FC|Mai mare sau egal cu1. Datele originale ale secvenței au fost trimise în baza de date a Arhivei de citire a secvenței (SRA) NCBI.

Reacție cantitativă în lanț a polimerazei în timp real (qRT-PCR)

ARN-ul total al celulelor BV-2 din fiecare grup a fost recoltat folosind un reactiv de izolare ARN-easyTM de 500 μL (Vazyme Biotech, China) și a fost efectuată o reacție de transcripție inversă cu FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, China) . Reacțiile au fost efectuate conform protocolului producătorului. ADNc a fost supus testelor qRT-PCR cu primeri specifici și TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, China). Primerii sunt enumerați în Tabelul S1 (a se vedea fișierul suplimentar 1) și -actina a fost utilizată ca control intern. Pentru analiza cantitativă a fost utilizată metoda 2-ΔΔCT.

Analiza Western blot

Celulele BV-2 au fost lizate prin tampon de liză RIPA (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, China) care conține 1% cocktail de inhibitor de protează (Thermo Fisher) pentru a obține proteina totală. S-a efectuat un SDS-PAGE de 10% pentru a separa proteinele, care au fost transferate pe membranele NC. După blocarea cu 5% lapte degresat/BSA timp de 2 ore, membranele au fost incubate cu AMPK (Proteintech), p-AMPK (A¨nity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-κB (Proteintech), Anticorpi p-NF-kB (ABclonal) sau GAPDH (ABclonal) în 5% TBST la 4 grade peste noapte. Membranele au fost incubate cu un anticorp secundar conjugat cu peroxidază de hrean (ABclonal) timp de 1 oră la temperatura camerei. Pentru vizualizare și cuantificare au fost utilizate substratul ECL Western blotting (Tanon, China), sistemul de imagistică Gel (Tanon, China) și software-ul ImageJ.

Andocare moleculară

Analizele de andocare moleculară au fost efectuate folosind software-ul Autodock (versiunea 4.2). Afinitatea dintre ACT și proteine ​​a fost observată de software-ul AutodockTools. Structurile proteice tridimensionale (3D) ale AMPK (PDB ID: 5g5j) și NF-kB (PDB ID: 4q3j) au fost preluate din Protein Data Bank

analize statistice

Toate datele sunt exprimate ca medie ± abaterea standard (SD). Diferențele dintre diferitele grupuri au fost analizate prin analiza unidirecțională a varianței (ANOVA), urmată de multiplu Tukey.

Rezultate

ACT a atenuat diskinezia și a îmbunătățit funcția sistemului colinergic la larvele de pește-zebra

Modelul AD indus de AlCl3-la larvele de pește zebra a fost folosit pentru a demonstra efectul ACT asupra AD. În primul rând, a fost observată mișcarea larvelor de pește zebra în ciclurile de lumină/întuneric și au fost înregistrate traseele lor de înot (Fig. 1a, 1b). Au fost calculate AS și ΔS ale mișcării peștilor zebra induse de AlCl3 în timpul corespunzător după administrare. Rezultatele au arătat că diferite doze de ACT au crescut efectiv AS și ΔS ale peștelui zebra (Fig. 1c). DRR și RE au descoperit o comparație mai intuitivă a ACT și DPZ (Fig. 1d). În consecință, ACT a atenuat diskinezia, prezentând efecte similare ca DPZ. În general, este de acord că sistemul colinergic joacă un rol important în procesele de învățare și memorie. Astfel, activitățile AChE și ChAT au fost utilizate pentru a dezvălui efectul ACT. Expunerea la AlCl3 la peștele-zebră cu alterare colinergică a creierului (Fig. 1e). A fost remarcabil faptul că tratamentul cu ACT a suprimat activitatea AChE. În plus, activitatea ChAT a prezentat o scădere după tratamentul ACT. Pe scurt, ACT a arătat un impact profund asupra funcției sistemului colinergic la larvele de pește zebra AD induse de AlCl3-.

ACT a suprimat polarizarea M1 și a promovat polarizarea M2 în celulele BV-2 induse de LPS

Au fost studiate efectele ACT asupra polarizării microglieiin vitrofolosind celule microgliale BV-2. LPS a scăzut semnificativ viabilitatea celulelor BV-2 după ce a fost tratată 24 de ore. Din fericire, ACT a crescut viabilitatea celulară a celulelor BV-2 induse de LPS (Fig. 2a). În plus, a fost observată morfologia celulelor BV-2. După 24 de ore de stimulare LPS, a arătat că celulele BV-2 au suferit o stare de polarizare M1. Și modificările morfologice au fost prevenite prin co-tratamentul ACT (Fig. 2b). Mai mult, rezultatele au indicat că, spre deosebire de celulele BV-2 stimulate de LPS, celulele BV{-2 tratate concomitent cu ACT au prezentat TNF- suprimat semnificativ (Fig. 2c), IL-1 ( Fig. 2d) și expresii NO (Fig. 2f) în supernatantul celular. Acestea sunt citokine proinflamatorii clasice ca indicatori ai polarizării microgliei M1. Similar cu rezultatele ELISA, rezultatele qPCR au descoperit că expresiile ARNm de TNF-, oxid nitric sintază (iNOS), IL-1 și CD86 au fost semnificative.cantly inhibat de tratamentul ACT în comparație cu grupul LPS (Fig. 3a). Mai mult, am măsurat nivelurile de polarizare a microgliei M2 prin ELISA (Fig. 2e) și qPCR (Fig. 3b), ale căror rezultate au indicat că ACT a crescut semnificativ nivelurile de expresie ale markerului M2 microglia (IL-10, CD206). , TGF- și Arg-1). Luate împreună, aceste rezultate au arătat că ACT a suprimat polarizarea microglia M1 și a promovat fenotipul M2.

Polarizarea M1/M2 a reglat ACT prin inhibarea căii de semnalizare NF-κB în celulele BV-2 induse de LPS

Analiza transcriptomică a fost efectuată de ARN-seq pentru a înțelege mecanismul ACT în celulele BV-2 de la un nivel general. PCA a ilustrat că grupurile de control, LPS și ACT ar putea fi bine distinse (Fig. 4a). A dezvăluit 899 de gene exprimate diferențial (DEG) între grupul de control și grupul LPS, în timp ce 49 DEG au fost între grupul LPS și grupul ACT (Fig. 4b). În mod constant, analiza de îmbogățire Gene Ontology (GO) (Fig. 4c) și analiza de îmbogățire Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (Fig. 4d) au descoperit că efectul ACT a fost implicat în calea de semnalizare NF-κB. Setul de gene asociate cu calea de semnalizare NF-κB a fost confirmat în continuare și homeostazia lor a fost cu siguranță afectată de LPS. După cum era de așteptat, ACT le-a afectat în mod semnificativ expresiile (Fig. 4e). O cale de semnalizare NF-kB este o cale clasică de reglare a progresiei inflamației, ducând în cele din urmă la eliberarea de factori pro-inflamatori. Pentru a obține suport mecanicist, o proteină cheie a căii de semnalizare NF-κB a fost evaluată prin analiza Western blot. Stimularea LPS a condus la activarea NF-kB, asociată cu promovarea polarizării M1. În conformitate cu analiza ARN-seq, ACT a inhibat fosforilarea NF-kB stimulată de LPS (Fig. 4f). Prin urmare, ACT a atenuat polarizarea M1 indusă de LPS prin calea de semnalizare NF-κB în celulele BV-2.

ACT a afectat biosinteza argininei, precum și biosinteza pantotenatului și CoA în celulele BV-2 induse de LPS

ARN-seq a demonstrat că căile afectate de ACT au inclus și biosinteza argininei (Arg), precum și biosinteza pantotenatului și CoA (Fig. 4d). Și s-a sugerat că stimularea LPS cauzează tulburări ale metabolismului celulelor BV-2 asociate cu polarizarea M1[14]. Astfel, un metabolom celular nețintit prin HPLC-Q-TOF-MS a fost utilizat pentru a identifica efectul ACT asupra metabolismului celular. PCA (Fig. 5a) și PLS-DA (Fig. 5b) au ilustrat că grupurile de control, LPS și ACT ar putea fi bine distinse pe baza metaboliților intracelulari. Nivelurile diferiților metaboliți din celulele BV-2 induse de LPS au fost modificate după tratamentul ACT (Fig. 5c). Comparativ cu grupul de control, au existat 11 metaboliți modificați semnificativ în grupul LPS (Tabelul S2, vezi articolul 2 suplimentar). În timp ce 14 metaboliți au fost modificați în mod distinct după tratamentul ACT (Tabelul S3, a se vedea articolul 3 suplimentar), implicând 11 căi metabolice (Fig. 5d). Efectul ACT a constat în principal în reglarea metabolismului aminoacizilor (biosinteza fenilalaninei, tirozină și triptofan, metabolismul D-glutamină și D-glutamat, biosinteza Arg, metabolismul fenilalaninei), metabolismul nucleotidelor (metabolismul purinelor, metabolismul pirimidinei), metabolismul energetic (azot). metabolismul), precum și metabolismul cofactorilor și vitaminelor (pantotenat și biosinteza CoA). Interesant, căile metabolice obținute de metabolom au fost în concordanță cu ARN-seq, inclusiv biosinteza Arg, precum și biosinteza pantotenat și CoA. Cele de mai sus au arătat că ACT ar putea regla biosinteza Arg, precum și biosinteza pantotenatului și CoA în celulele BV-2 stimulate de LPS.

Disfuncție mitocondrială Bv-2 indusă de Lps atenuată

Mitocondriile sunt în centrul căilor metabolice. Dovezile evoluează că mitocondriile sunt jucători cheie în polarizarea microglială M1/M2. Cercetările anterioare au demonstrat că LPS ar putea cauza disfuncție mitocondrială. O prezentare generală a stării mitocondriilor în morfologie și distribuție celulară a fost judecată de TEM. După stimularea LPS, celulele BV-2 au prezentat condensare a cromatinei nucleului, citoplasmă scăzută, precum și mai puține mitocondrii (Fig. 6a). În plus, cristele mitocondriale ale grupului LPS au fost dezordonate sau chiar au dispărut, prezentând cristoliză parțială, dimensiune redusă și morfologie de formă rotundă. Interesant, tratamentul ACT ar putea atenua modificările morfologice induse de LPS în mitocondrii. Pe rând, am examinat funcția mitocondrială a celulelor BV-2 tratate cu LPS, inclusiv MMP și producția de ATP mitocondrial. Producția de MMP (Fig. 6b, 6c) și ATP în mitocondrii (Fig. 6d) au fost îmbunătățite semnificativ în celulele tratate cu ACT, comparativ cu cele din grupul LPS. Disfuncția mitocondrială poate fi legată de nivelul crescut de ROS în celulă. Analiza citometriei în flux a arătat că conținutul ROS era supraîncărcat în grupul LPS (Fig. 6e, 6f). Din fericire, ACT a eliminat ROS excesiv. Acesta sugerează că ACT poate restabili funcția mitocondriilor prin curățarea ROS.

ACT a restabilit funcția mitocondriilor prin reglarea în sus a PGC-1 și UCP-2

Coactivatorul receptorului activat proliferativ peroxizomal-1 (PGC-1) joacă un rol important în biogeneza mitocondrială[15]. Stimularea LPS a scăzut expresia PGC-1, prezentând disfuncția mitocondriilor. În mod remarcabil, ARNm-ul genei PGC-1 și expresia proteinei au fost inversate semnificativ prin tratamentul ACT în celulele BV-2 tratate cu LPS (Fig. 7a). Proteina de decuplare mitocondrială-2 (UCP-2) era, de asemenea, cunoscută că reglează funcțiile mitocondriale. Ca proteină în aval a PGC-1, poate controla depolarizarea MMP indusă de LPS și producția de ROS. Rapoarte recente indică faptul că este esențial pentru procesul de activare microglială, cu reglarea opusă a polarizării M1 și M2.[16]. Rezultatele Western blot au arătat că nivelul proteinei UCP-2 a scăzut după stimularea LPS. Tratamentul concomitent cu LPS și ACT ar putea supraregla expresia UCP-2 în comparație cu tratamentul cu LPS. Nivelul de expresie ARNm al UCP-2 a arătat, de asemenea, modificări similare (Fig. 7b). Luate împreună, ACT a restabilit funcția mitocondriilor prin reglarea în sus a PGC-1 și UCP-2.

ACT a reprimat polarizarea microglia M1 prin recuperarea funcției mitocondriale prin activarea AMPK

Protein kinaza activată de AMP (AMPK), ca senzor cheie de energie celulară, joacă un rol important în menținerea echilibrului metabolismului celular. În același timp, PGC-1 este o proteină în aval de AMPK. Rezultatele au descoperit că LPS a inhibat activarea AMPK, rezultând tulburări ale metabolismului celular și disfuncție mitocondrială. Este de remarcat faptul că ACT ar putea crește în funcție de doză expresia proteinei p-AMPK (Fig. 8a). Se sugerează că ACT ar putea crește expresia PGC-1 și poate restabili funcția mitocondrială prin activarea căii de semnalizare AMPK. În acest studiu, pentru a investiga dacă activarea AMPK a contribuit la efectul de reglare al ACT asupra polarizării M1/M2, a fost folosit compusul C (CC) pentru a inhiba efectul AMPK. Spre deosebire de nivelul redus de NO din grupul de tratament cu ACT, CC a blocat parțial efectul ACT asupra nivelului de NO (Fig. 8d). Pe baza acestor rezultate, ACT ar putea regla polarizarea M1/M2 a celulelor BV-2 prin activarea AMPK.

ACT se leagă și a inhibat NF-kB, precum și AMPK activat

S-a aplicat andocarea moleculară pentru a confirma dacă ACT se leagă de proteinele NF-kB și AMPK. Descoperirile au demonstrat că energia de legare a ACT și NF-kB a fost de -8,4 kcal/mol, care a ACT și AMPK a fost de -10,8 kcal/mol. Unități semnificative au verificat că ACT este direct legat de NF-kB și AMPK (Fig. 9). Ulterior, posibilele moduri de legare și interacțiuni din buzunarul de aminoacizi au fost explorate în continuare, inclusiv Phe A146, Pro A147, Asn A240, Leu A236, Arg A232, His A183, Arg A239, Glu A179, Cys A149 și Tyr A227 din NF. -κB (Fig. 9c), precum și Phe A213, Gly A481, Ala A370, Leu A482, Arg A212, Ile A369, Arg A106, Phe A215, Phe A108, Thr A309, Ser A119 și Thr A224 din AMPK (Fig. .9f). Aceste rezultate au indicat că ACT ar putea afecta direct NF-kB și AMPK pentru a atenua polarizarea microglia BV-2 M1 și pentru a promova fenotipul M2.