Oligoglicozide feniletanoide acilate cu activitate hepatoprotectoare din planta de deșert Cistanche Tubulosa

pentru mai multe informații:Ali.ma@wecistanche.com

Toshio Morikawa și colab

Abstract

Extractul metanolic din tulpini proaspete deCistanche tubulosa(Orobanchaceae) s-a dovedit că prezintă efecte hepatoprotectoare împotriva leziunilor hepatice induse de D-galactozamină (D-GalN)/lipopolizaharidă (LPS) la șoareci. Din extras, trei noifeniletanoidoligoglicozide, kancanozide H1 (1), H2 (2) și I (3), au fost izolate împreună cu 16glicozide feniletanoide(4–19) și două oligozaharuri acilate (20,21). Structurile lui 1-3 au fost determinate pe baza proprietăților spectroscopice, precum și a dovezilor chimice. Dintre izolate, echinacozida (4, IC50=10,2 lM), actozidă (5, 4,6 lM), izoacteozidă (6,5,3 lM), 20-acetillacteozidă (8, 4,8 lM) și tubulozidă A (10, 8,6 lM) a inhibat moartea hepatocitelor indusă de D-GalN. Aceste cinci izolate, 4 (31,1 lM), 5 (17,8 lM), 6 (22,7 lM), 8 (25,7 lM) și 10 (23,2 lM) și cistantubulozida B1 (11, 21,4 lM) au redus de asemenea TNF-a- citotoxicitate indusă în celulele L929. În plus, constituenții principali (4–6) au prezentat efecte hepatoprotectoare in vivo la doze de 25–100 mg/kg, PO.

Click pentru efecte secundare cistanche și produse Cistanche

1. Introducere

Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) este o plantă parazită perenă care crește pe rădăcinile speciilor Salvadora sau Calotropis și este distribuită în Africa de Nord, Arabia și țările asiatice.2 Tulpini deCistanche tubulosaprecum și salsa de asistență și deserticola de Cistanche au fost utilizate în mod tradițional pentru tratamentul impotenței, sterilității, lumbago și slăbiciunii corporale, precum și ca agent de promovare a circulației sanguine.2,3 Anterior, mai multefeniletanoids, iridoidele, monoterpenele și lignanii au fost izolate din China și PakistanCistanche tubulosa.2,4–9 În cursul studiilor noastre de caracterizare asupra constituenților bioactivi din acest medicament natural, am raportat anterior că cinci iridoizi, kancanozide A–D și kankanol, o monoterpenglicozidă, kankanozidă E, douăfeniletanoiddin extractul metanolic de tulpini uscate deCistanche tubulosa.10,11 În plus, extractul metanolic și mai multe izolate, cum ar fi echinacozida (4), acteozida (5), cistanozida F (20), 21 și kankanozida F s-au dovedit a prezenta efecte vasorelaxante, adică efecte inhibitoare împotriva contracțiilor induse. de noradrenalina în aorta toracică izolată de șobolan.11 În studiile noastre continue asupra constituenților din plantă, un extract metanolic din tulpini proaspete deCistanche tubuli a fosts-a constatat că arată un efect protector asupra leziunilor hepatice induse de D-galactozamină (D-GalN)/lipopolizaharidă (LPS) la șoareci. Din extractul metanolic, am izolat trei noifeniletanoidoligoglicozide denumite kancanozide H1 (1), H2 (2) și I (3) împreună cu 16 glicozide feniletanoide (4-19) și două oligozaharuri acilate (20, 21). Această lucrare tratează izolarea și elucidarea structurală a acestor noifeniletanoidoligoglicozide (1–3). Sunt discutate și cerințele structurale ale glicozidelor feniletanoide pentru activitatea hepatoprotectoare (Fig. 1).

2. Rezultate și discuții

2.1. Efectul protector al extractului metanolic din tulpini deCistanche tubulosaasupra leziunilor hepatice induse de D-GalN/LPS la șoareci

Tulpini proaspete deCistanche tubulosa(cultivate în Urumqi, provincia Xinjiang, China) au fost extrase cu metanol sub reflux, obținând un extract metanolic (8,36 la sută din tulpinile proaspete). După cum se arată în Tabelul 1, la doze de 250-500 mg/kg, PO, extractele metanolice au arătat un efect inhibitor asupra creșterii aspartat amino transaminazei serice (sAST) și alanin aminotransaminazei (sALT), markeri ai leziunii hepatice, induse de D- GalN/LPS la șoareci.

2.2. Componente chimice din tulpini aleCistanche tubulosa

Un extract metanolic din tulpinile proaspete aleCistanche tubulosaa fost supus cromatografiei pe coloană Diaion HP-20 (H2O?MeOH) pentru a da fracții eluate cu H2O și MeOH (5,63 la sută și, respectiv, 2,73 la sută). Fracția eluată cu MeOH a fost supusă la cromatografii pe coloană SiO2 și ODS și în final HPLC pentru a furniza trei noifeniletanoidoligoglicozide, kancanozide H1 (1, 0.0{008 procente ), H2 (2, 0,0001 procente ) și I (3, 0,0007 procente ) împreună cu 16glicozide feniletanoide, echinacozidă 2,11 (4, 0,45 la sută ), actozidă 2,11 (5, 0,28 la sută ), izoacteozidă 2,11 (6, 0.0 41 la sută ), cis-acteozidă12,13 (7, 0.0007 la sută ), 20-acetilacteozidă2,11 (8, {{ 42}}.0{{{50}}38 la sută ), decafeoilacteozidă14 (9, 0.0002 la sută ), partea tubulară A2,11 (10, 0,013 la sută), cistantubulozide B19 (11, 0,0020 la sută), B29 (12,0,0003 la sută), arenariozidă15 (13, 0,0006 la sută), wiedemanninozid C16 (14,0,0008 la sută), cistantubulozidă A9 (15, 0,0009 la sută), siringalidă A 30-OaL ramnopiranozidă4 (16, 0,0017 la sută), campneozide I17,18 (17,0,0009 la sută) (17,0,815 la sută) și II (17,0,817%) , 0,0005 la sută) și salidrozidă11 (19, 0,0027 la sută) și două oligozaharuri acilate, cistanozida F11 (20, 0,0004 la sută) și kancanoză11 (21, 0,0004 la sută).

2.3. Structuri ale kancanozidelor H1 (1), H2 (2) și I (3)

Kankanoside H1 (1) a fost obținut sub formă de pulbere albă cu rotație optică negativă (½a-24D{-45.3 în MeOH). Spectrul său IR a arătat benzi de absorbție la 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1{{1{0}}70 și 1040 cm 1 atribuibile hidroxililor, carbonililor ester, funcțiilor eter. și inele aromatice. Spectrele FABMS de ioni pozitivi și negativi de 1 au arătat vârfuri de ioni cvasimoleculari la m/z 835 (M plus Na) plus și respectiv m/z 811 (MH), iar formula moleculară a fost determinată ca C37H48O20 prin pozitiv de înaltă rezoluție. măsurarea ionului FABMS. Spectrele 1H și 13C RMN ale lui 1 (CD3OD, Tabelele 2 și 3), care au fost atribuite prin diferite experimente RMN,19 au arătat semnale atribuibile la două metilene [d 2,70(2H, m, H2-7), 3,66 , 4,07 (1 H fiecare, ambele m, H2-8)], protoni aromatici de tip ABC orto- și meta-cuplați [d 6,52 (1H, dd, J=1.8,7,8 Hz, H{ {50}}), 6,65 (1H, d, J=1,8 Hz, H{-2), 6,67 (1H, d, J {= 7,8 Hz, H{{62 }})], două fragmente bD-glucopiranozil [d 4,29 (1H, d, J=7,8 Hz, terminal-Glc-H{-1), 4,54 (1H, d, J {{76 }},2 Hz, interior-Glc-H-1)] și fragment aa-L-ramnopiranosil [d 1,06 (3H, d, J=6,0 Hz, Rha-H{{89 }}),4,80 (1H, br s, Rha-H-1)] împreună cu o grupare acetil [d 1,98(3H, s)] și o grupare trans-p-cumaroil {o trans-olefină [d 6,34,7,67 (1H fiecare, ambele d, J=16,0 Hz, H{-8 și 7)] și protoni aromatici de tip orto-cuplați A2B2- [d 6,80, 7,46 (2 H fiecare , ambele d,J=8.7 Hz, H{-3,5 și 2,6)]}. Conectivitățile dintre fragmentele oligoglicozide și acil din 1 au fost caracterizate printr-un experiment HMBC, care a arătat corelații pe distanță lungă între următoarele perechi de protoni și carbon: inner-Glc-H-1 și C{-8 (dC71.9) ); interior-Glc-H-2 [d 4,88 (1H, asemănător dd)] și acetil carbonilcarbon (dC 171,4); interior-Glc-H-4 [d 5,08 (1H, dd, J=9.6, 9,6 Hz)] și carbonul p-cumaroil carbonil (dC 168,2); Rha-H-1 și interior-Glc-C-3 (dC 80,5); și terminal-Glc-H-1 și interior-Glc-C-6 (dC69.3) (Fig. 2). În cele din urmă, hidroliza alcalină a lui 1 cu 5% hidroxid de potasiu (KOH) a eliberat acid trans-p-cumaric, care a fost identificat prin analiza HPLC, împreună cu un produs deacilat. Produsul dedeacilat a fost tratat succesiv cu acid clorhidric 1,0 M (HCl) pentru a elibera L-ramnoză și D-glucoză, care au fost identificate prin analiza HPLC folosind un detector cu rotație optică.10,11 Astfel, structura kankanozidei H1 a fost elucidată pentru a fi {{181 }}(3,4-dihidroxi fenil)etil OaL-ramnopiranozil-(1- 3)-[bD-glucopiranosil-({1-6)]{-2-O-acetil{{196 }}O-trans-p-cumaroil-bD-glucopiranozidă (1).

Kankanoside H2 (2) a fost izolat ca o pulbere albă cu rotație optică negativă (½a 25 D 52,4 în MeOH). Sa constatat că formula sa moleculară C37H48O20 este aceeași cu cea a lui 1 prin măsurarea FABMS cu ioni pozitivi de înaltă rezoluție. Proprietățile spectroscopice ale lui 2 au fost foarte asemănătoare cu cele ale lui 1, cu excepția semnalelor datorate grupării cis-p-cumaroil [d 5,79, 6,95 (1H fiecare, ambele d, J=12,8 Hz, H{{ 22}} și 7), 6,76, 7,73 (2H fiecare, ambele d, J=8,7 Hz, H-3,5 și 2,6)]. Mai mult, experimentul HMBC pe 2 a dezvăluit, de asemenea, moduri similare de corelații pe distanță lungă ca cele detectate pentru 1 între următoarele perechi de protoni și carbon: inner-Glc-H-1 [d 4,51 (1H, d, J {{44 }},8 Hz)] și C-8 (dC 72,0); interior-Glc-H-2 [d 4,88 (1 H, m)] și carbonul acetil carbonil (dC 171,4); interior-Glc-H-4 [d 4,98 (1H, dd, J=9,6, 9,7 Hz)] şi carbonul p-cumaroil carbonil (dC 166,7); Rha-H-1 [d 4,77 (1H, d, J=1,4 Hz, Rha-H{-1)] și interior-Glc-C-3 (dC 80,7 ); și terminal-Glc-H-1 [d 4,28 (1H, d, J {= 7.8 Hz)] și interior-Glc-C{-6 (dC 69,4) (Fig. 2) . Prin studiul de degradare, 2 a dat acid cis-p-cumaric și două aceleași zaharuri ca cele obținute în cazul lui 1. În consecință, structura kankanozidei H2 a fost elucidată a fi 2-(3,4- dihidroxifenil)etil OaL-ramnopiranozil-(1-3)-[bD-glucopiranozil-(1-6)]{-2-O-acetil{-4-O-cis-p-cumaroil- bD-glucopiranozidă (2).

Kankanoside I (3) a fost, de asemenea, izolat ca o pulbere albă cu rotație optică negativă (½a- 25D{-62.2 în MeOH). Formula sa moleculară, C35H46O18, a fost determinată prin măsurători FABMS pozitive și negative și HRFABMS. Proprietățile spectroscopice ale 3(CD3OD, Tabelele 2 și 3) au fost superpozabile cu cele ale echinacozidei (4), cu excepția semnalelor datorate părții agliconului {{două metilen {d 2,95 (2H, dd, J=7). 3, 7,8 Hz, H2-7), [3,79 (1H, m), 4,10 (1H,dt, J {= 16,9, 7,3 Hz), H{{32} }]}, protoni aromatici monosubstituiți [d7,18 (1H, m, H-4), 7,26–7,28 (4H, m, H{-2,6, 3,5)]}}. Hidroliza alcalină a lui 3 cu 5% KOH a eliberat acid trans-cafeic, iar produsul dedeacilat a fost tratat succesiv cu HCI 1,0 M pentru a elibera L-ramnoză și D-glucoză. În cele din urmă, conectivitățile grupării acil și ale fragmentelor de zahăr din 3 au fost clarificate prin experimentul HMBC, așa cum se arată în Figura 2. Pe baza dovezilor menționate mai sus, structura kankanozidei I a fost elucidată ca fiind2-feniletil OaL- ramnopiranozil-(1-3)-[bD-glucopirano-sil-(1-6)]{-4-O-trans-cafeoil-bD-glucopiranozid (3)

2.4. Efectele constituenților chimici din tulpinile de Cistanche tubulosa asupra citotoxicității induse de D-GalN în hepatocitele primare de șoarece de cultură

Se recunoaște că leziunile hepatice induse de D-GalN/LPS se dezvoltă prin răspunsuri imunologice.19 Acest tip de leziune hepatică este raportată că apare în două forme. În primul rând, sensibilitatea la TNF-a prin epuizarea ofuridină trifosfat în hepatocite este crescută de D-GalN. În al doilea rând, mediatorii proinflamatori, cum ar fi NO și TNF-a, sunt eliberați de macrofagele activate de LPS (celulele Kupffer). Se raportează că apoptoza hepatocitelor de către TNF-a are un rol important în leziunile hepatice induse de D-GalN/LPS.20

În studiile noastre anterioare despre compușii hepatoprotectori din medicamentele naturale, am raportat că mai mulți constituenți din Hovenia Dulcis,21 Bupleurum scorzonerifolium,22,23 Curcuma zedoaria,24–26Angelica furcijuga,27,28 Betula sativum,30 Salacia reticulata,31 Tilia argentea,33 hierochuntica,33 Panax notoginseng,34 Cyperus longus,35 Erycibe expansa,36Camellia sinensis,37 Sedum sarmentosum,38,39 Sinocrassula indica,40Hedychium coronarium,41 și Piper chaba42,43 au prezentat efecte hepatoprotectoare asupra infecțiilor induse de D-G/L de către D-L la șoareci și/sau platyphylla var. japonica,29 Efectul inhibitor al pisumului asupra citotoxicității induse de D-GalN în hepatocitele de cultură primară. Deoarece extractul metanolic din tulpinile deCistanche tubulosaau arătat efecte hepatoprotectoare asupra leziunilor hepatice induse de D-GalN/LPS la șoareci (vide ante), efectul inhibitor al constituenților asupra citotoxicității induse de D-GalN în hepatocitele de șoarece de cultură primară a fost examinat folosind 3-(4,{ Analiza {6}}dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu (MTT). După cum se arată în tabelul 4, echinacozidă (4, IC50=10,2 lM), actozidă (5, 4,6 lM), izoaceteozidă (6, 5,3 lM), 20-acetillacteozidă (8, 4,8 lM), tubulozidele A (10,8,6 lM) și B11 (22, 14,6 lM) și kankanozida G11 (23, 14,8 lM) au prezentat activitate puternică. Activitățile lor au fost mai mari decât cele ale silibinei comerciale (38,8 lM),33–43 ca control pozitiv.44,45 Cerințele structurale aleglicozide feniletanoide for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM), 5 >> cistanoside F (20, >100 lM)]; (2) agliconul având gruparea 3,4-dihidroxi a prezentat o activitate mai puternică decât cel având gruparea 4-hidroxi (6 > 23); (3) fragmentul 60-ObD-glucopiranozil a redus activitatea (4 < 5,10="">< 8);="" (4)="" partea="" 8-obd-glucopiranozil="" care="" are="" grupa="" 40-o-cafeoil="" a="" prezentat="" o="" activitate="" mai="" puternică="" decât="" cea="" care="" are="" grupa="" 60-o-cafeoil="" (5="6," 8=""> 22 ); și (5) introducerea 20-O-acetilpartului a redus activitatea (8 5 5, 22 <>

Next, effects of the principal constituents (4–6) on NO and TNF productions, as markers of macrophage activation in LPS-activated mouse peritoneal macrophages were examined.43,46,47 As a result, these constituents (4–6) showed neither NO nor TNF production inhibitory activities (IC50 >100 lM, datele nu sunt prezentate). Astfel, s-a descoperit că acești compuși nu afectează supraproducțiile de NO și TNF-a din macrofagele activate cu LPS.

2.5. Efectele constituenților chimici asupra citotoxicității induse de TNF-a în celulele L929

Pentru a clarifica efectele constituenților asupra sensibilității hepatocitelor la TNF-a, scăderea viabilității celulelor L929 indusă de TNF-a, a fost examinată o linie celulară sensibilă la TNF-a48 utilizând testul MTT. Fără probe de testare, viabilitatea celulei a fost redusă la cca. 60 la sută după incubarea celulelor cu 20 ng/mL TNF-a timp de 44 de ore comparativ cu cazul fără TNF-a. După cum se arată în tabelul 5, echinacozidă (4, IC50=31,1 lM), actozidă (5, 17,8 lM), izoaceteozidă (6, 22,7 lM), 20-acetilaceozidă (8, 25,7 lM), tubulozida A (10,23,2 lM) și cistantubulozidă B1 (11, 21,4 lM) au inhibat scăderea viabilității celulare, iar activitățile lor au fost găsite mai mari decât cele ale piperinei42,43 și silibinei. Cerințele structurale aleglicozide feniletanoide for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM)]; (2) the aglycone having the 3,4-dihydroxy group showed stronger activity than that having the 4-hydroxy group [4 > cistantubuloside A (15, >100 lM), 5 > syringalide A 30 -O-a-L-rhamnopyranoside (16, >100 lM), 6 > kankanoside G (23, >100 lM)]; (3) the 60 -O-b-D-glucopyranosyl moiety reduced the activity (4 < 5); (4) the 8-O-b-D-glucopyranosyl part having the 40 -O-caffeoyl group showed stronger activity than that having the 60 -O-caffeoyl group [5 > 6, 8 > tubuloside B (22, >100 lM)]; și (5) introducerea fragmentului 20-O-acetil a redus activitatea (8 < 5,="" 22="">< 6).="" aceste="" cerințe="" au="" fost="" găsite="" similare="" cu="" cele="" observate="" în="" capitolul="" anterior="" privind="" efectele="" inhibitoare="" asupra="" citotoxicității="" induse="" de="" d-galn="" în="" hepatocitele="" de="" șoarece="" de="" cultură="">

Aceste descoperiri in vitro sugerează următoarele mecanisme posibile de acțiune pentru efectul hepatoprotector al constituenților tulpinilor deCistanche tubulosa: (i) scăderea citotoxicității induse de D-GalN (4-6, 8, 10, 22 și 23) și (ii) scăderea citotoxicității induse de TNF-a (4-6, 8, 10 și 11) .

2.6. Efectele protectoare ale echinacozidei (4), actozidei (5) și izoacteozidei (6) împotriva leziunilor hepatice induse de șoarecii D-GalN/LPS și modul lor de acțiune

În cele din urmă, am examinat efectul principaluluiglicozide feniletanoide, echinacozidă (4), acteozidă (5) și izoacteozidă (6) asupra leziunii hepatice induse de D-GalN/LPS la șoareci. După cum se arată în tabelele 6 și 4-6, a inhibat semnificativ creșterea sAST și a SALT indusă de D-GalN/LPS la șoareci la doze de 25-100 mg/kg, PO. Pe de altă parte, 4-6 nu au afectat supraproducția de TNF-a din macrofagele activate de LPS. În plus, 4-6 au inhibat semnificativ moartea celulelor L929 cauzată de TNF-a, indicând o scădere a sensibilității celulelor L929 la TNF-a (vide ante). Aceste descoperiri sugerează că 4-6 reduc sensibilitatea acestor celule la citotoxicitatea indusă de TNF-a. Au fost raportați mulți compuși care inhibă moartea celulară indusă de D-GalN și producția de TNF-a,24,26,32, dar s-au raportat puțini compuși care reduc selectiv sensibilitatea hepatocitelor la TNF-a.42,43,49,50.

În concluzie, din tulpini proaspete deCistanche tubulosa, trei noiglicozide feniletanoide, kancanozide H1 (1), H2 (2) și I (3) împreună cu 16 cunoscuteglicozide feniletanoide(4–19) și oligozaharurile două acilate (20, 21) au fost izolate. Cerințele structurale pentru efectele lor protectoare asupra leziunii hepatocitelor induse de D-GalN și efectele citoprotectoare asupra celulelor L929 cauzate de TNF-a au fost următoarele; (1) partea aglicon a fost esențială pentru activitate; (2) agliconul având gruparea 3,4-dihidroxi a prezentat o activitate mai puternică decât cea care are gruparea 4-hidroxi; (3) fragmentul {60-ObD-glucopiranozil a redus activitatea; (4)partea 8-ObD-glucopiranozil care are gruparea 40-O-cafeoil a prezentat o activitate mai puternică decât cea care are grupa 60-O-cafeoil; și (5) introducerea {{27} }} Fragmentul O-acetil a redus activitatea. În plus, principalulglicozide feniletanoide, echinacozidul (4), actozidul (5) și izoacteozidul (6), au inhibat creșterea insAST și saLT la doze de 25-100 mg/kg PO la șoarecii tratați cu D-GalN/LPS și s-a sugerat că aceste efecte inhibitoare sunt depinde de sensibilitatea redusă a hepatocitelor la TNF-a. Mecanismele detaliate de acțiune aleglicozide feniletanoidear trebui studiat în continuare.

3. Experimental

3.1. General

Pentru obținerea datelor spectrale și fizice au fost utilizate următoarele instrumente: rotații specifice, polarimetru digital Horiba SEPA-300(l=5 cm); Spectre UV, spectrometru Shimadzu UV-1600; Spectre IR,Shimadzu FTIR-8100 spectrometru; Spectre 1H și 13C RMN, spectrometre JEOLJNM-ECA600 (600 și 150 MHz) și JEOL JNM-ECS400 (400 și 100 HMz) cu tetrametilsilan ca standard intern; FABMS și FABMS de înaltă rezoluție, spectrometru de masă JEOL JMS-SX 102A; Detector HPLC, Shimadzu RID-10A indice de refracție, Shimadzu SPD-10A UV-vis și Shodex OR-2 detectoare optice de rotație. Coloana HPLC, Cosmosil 5C18-MS-II și coloanele pNAP (Nacalai TesqueInc., 250 4,6 mm id) și (250 - 20 mm id) au fost utilizate în scopuri analitice și, respectiv, pregătitoare.

Pentru cromatografie au fost utilizate următoarele condiții experimentale: cromatografie pe coloană cu silicagel în fază normală (CC), silicagel 60 N (Kanto Chemical Co., Ltd, 63–210 mesh, sferic, neutru ); gel de silice cu fază inversă CC, Diaion HP-20 (NipponRensui) și Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd, 100–200 mesh); plăci TLC în fază normală, pre-acoperite cu silicagel 60F254 (Merck, 0,25 mm); plăci TLC în fază inversă, preacoperite cu silicagel RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm); HPTLC cu fază inversă, plăci TLC pre-acoperite cu silicagel RP-18 WF254S(Merck, 0,25 mm), detectarea a fost realizată prin pulverizare cu 1% Ce(SO4)2–10% H2SO4 apos, urmată de încălzire .

3.2. Material vegetal

Tulpini proaspete deCistanche tubulosacultivate la Urumqi, provincia Xinjiang, China au fost colectate în septembrie 2007. Materialul vegetal a fost identificat de unul dintre autori (MY). Un voucher pentru materialul vegetal este înregistrat în laboratorul nostru.

3.3. Extracție și izolare

Tulpinile proaspete aleCistanche tubulosa(2,98 kg) au fost tăiate fin și extrase de trei ori cu metanol la reflux timp de 3 ore. Evaporarea solventului la presiune redusă a furnizat un extract metanolic (249,1 g, 8,36 la sută). Extractul metanolic a fost supus Diaion HP 20 CC (5,0 kg, H2O?MeOH) pentru a da fracții eluate cu H2O și MeOH (167,84 g, 5,63 la sută și 81,21 g, 2,73 la sută). , respectiv). Fracția eluată cu MeOH (61,00 g) a fost supusă la silicagel în fază normală CC[1,8 kg, CHCl3–MeOH–H2O (15:3:0.4?1{{48} }:3:0.5?6:4:1, v/v/v)?MeOH] pentru a da șapte fracții [Fr. 1 (1,12 g), 2 (9,56 g), 3 (0,89 g), 4 (1{0,69 g), 5 (8,84 g), 6 (12,52 g) și 7 (4,60 g)]. Fracția 2(9,56 g) a fost separată prin silicagel cu fază inversă CC [400 g,MeOH–H2O (1{{2{01}}:9{0, v /v)?MeOH-acetonă] pentru a da cinci fracţii [Fr. 2–1 (55,9 mg), 2–2 (4,48 g), 2–3 (3,42 g), 2–4 (1,16 g) și 2–5 (31,9 mg)]. Fracția 2–3 (1.0{0 g) a fost supusă la HPLC [Cosmo sil 5C{18-MS-II, CH3CN–1% AcOH apos (7:93, v/ v)] a da șapte fracțiuni [Fr. 2–3–1 (66,5 mg), 2–3–2 (20,4 mg), 2–3–3 (26,{0 mg), 2–3–4 (136,6) mg), 2–3–5 (38{{300}},6 mg), 2–3–7 (84,9 mg)]. Fracția 2–3–4 (106,6 mg) a fost purificată în continuare prin HPLC [Cosmosil pNAP,CH3CN–1% AcOH apos (5:95, v/v)] pentru a da salidrozidă (19,13,7 mg, {{340}}.0{{4{09}}27 la sută ). Fracția 4 (10,69 g) a fost separată cu silicagel în fază inversă CC [5{00 g, MeOH-H2O (30:7 0,v/v)?MeOH?acetonă] pentru a da patru fracții [Fr. 4–1 (878,2 mg), 4–2 (7,06 g), 4–3 (1,57 g) și 4–4 (792,8 mg)]. Fracția 4–2(1,5{{560}} g) a fost supusă la HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 procente de AcOH apos (2{{57{{586} }}}:80, v/v)] pentru a da cinci fracții {Fr. 4–2–1(42,9 mg), 4–2–2 [= campneozidă I (17, 67,0 mg, 0,014 la sută )], 4–2– 3 [= actozidă (5, 1,21 g, 0,26 la sută )], 4–2–4 (41,6 mg) și 4–2–5 (181,3 mg)}. Fracția 4–2–4 (41,6 mg) a fost purificată în continuare prin HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1% AcOH apos (18:82, v/v)] pentru a da izoacteozidă (6, 19,1 mg, 0,0040%) și cis-acteozidă (7,3,4 mg, 0,0007 la sută). Fracția 4-3 (1,57 g) a fost purificată prin HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN-1% AcOH apos (20:80, v/v)] pentru a da 11 fracții [Fr. 4–3–1 (30,4 mg), 4–3–2 (55,2 mg), 4–3–3 (= 17, 22,1 mg, 0,0010 la sută ), 4–3–4 (= 5 , 224,6 mg, 0,010 la sută ), 4–3–5 (27,4 mg), 4–3–6 (43,6 mg), 4–3–7 (= 6, 825,0 mg, 0,037 la sută ), 4–3 –8 [= syringa lide A 30-OaL-ramnopiranozidă (16, 37,6 mg, 0,0017 la sută )], 4–3–9 (39,8 mg), 4–3–10 [{{310} }acetillacteozidă (8, 85,4 mg, 0,0038 la sută)] și 4–3–11 (64,6 mg)]. Fracția 4–3–6 (43,6 mg) a fost purificată în continuare prin HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1% AcOH apos (18:82,v/v)] pentru a da kancanozide H1 (1, 17,0 mg, 0,0008%) și H2 (2,3,3 mg, 0,0001 la sută). Fracția 4–3–9 (39,8 mg) a fost purificată în continuare prin HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1% AcOH apos (18:82, v/v)] pentru a da kancanozida I (3, 15,4 mg, 0,0007%) și 6 ( 3,1 mg, 0,0001 procente). Fracția 5 (8,84 g) a fost separată prin gel de silice în fază inversă CC [400 g, MeOH-H2O (20:80-30:70, v/v)?MeOH?acetonă] pentru a da şapte fracţii [Fr. 5–1 (870,2 mg), 5–2 (478,9 mg), 5–3 (3,72 g), 5–4 (979,9 mg), 5–5 (1,19 g), 5–6 (1,27 g) și 5 –7(130,1 mg)]. Fracția 5–1 (870,2 mg) a fost purificată prin HPLC [Cos mosilpNAP, CH3CN–1% AcOH apos (5:95, v/v)] pentru a da lacteozidă decafeoidă (9, 5,1 mg, 0,0002 la sută) și cistanozida F ( 20, 8,1 mg, 0,0004 procente). Fracția 5-3 (3,72 g) a fost purificată prin HPLC [Cosmosil5C18-MS-II, CH3CN-1 procente AcOH apos (15:85, v/v)] pentru a da șase fracții [Fr. 5–3–1 (128,6 mg), 5–3–2 [= kancanoză (21, 9,4 mg, 0,0004 la sută )], 5–3–3 (64,6 mg), 5–3–4 (72,3) mg), 5–3–5 [= echinaco side (4, 2,54 g, 0,11 la sută) și 5–3–6 (318,5 mg)]. Fracția 5–3–4 (72,3 mg) a fost purificată în continuare prin HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1% AcOH apos (10:90, v/v)] pentru a da campneozida II (18,10,6 mg, 0,0005%). Fracția 5-4 (979,9 mg) a fost purificată prin HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN-1% AcOH apos (15:85, v/v)] la fracții dateină [Fr. 5–4–1 (28,6 mg), 5–4–2 (90,5 mg), 5–4–3 (99,7 mg), 5–4–4 (= 4, 25,7 mg, 0,0012 procente), 5 –4–5 (16,4 mg), 5–4–6 (318,5 mg), 5–4–7 (21,6 mg), 5–4–8 (= 5, 204,4 mg, 0,0091 la sută) și 5– 4–9 (134,7 mg)]. Fracția 5–4–6 (318,5 mg) a fost purificată prin HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1% AcOH apos (15:85, v/v)] pentru a da cistantubulozide B1 (11, 44,9 mg, 0,0020 procente), B2 (12) , 7,6 mg, 0,0003 la sută) și A (15, 21,1 mg, 0,0009 la sută) și wiedemanninozidă C (14, 17,2 mg, 0,0008 la sută). Fracția 5–5 (1,19 g) a fost purificată prin HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 procente de AcOH apos (18:82, v/v)] pentru a da tubulozidă A (10, 300,3 mg, 0,013 la sută) și arenariozidă (13,5,8 mg, 0,0006 la sută). Fracția 6 (12,52 g) a fost separată prin silicagel CC în fază inversă [600 g, MeOH-H2O (20:80-30:70, v/v)?MeOH-acetonă] pentru a da patru fracții [Fr. 6–1 (553,8 mg), 6–2 (10,69 g), 6–3 (1,40 g) și 6–4 (17,8 mg)]. Fracția 6–2 (500,0 mg) a fost purificată prin HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1 procente AcOH apos (25:75, v/v)] pentru a da 4 (353,1 mg, 0,34 procente). ).

3.3.1. Kankanoside H1 (1)

O pulbere albă, ½a- 24D {-45,3 (c 1,06, MeOH). FABMS cu ioni pozitivi de înaltă rezoluție: Calculat pentru C37H48O20Na (M plus Na) plus: 835,2637. Găsit: 835,2633. UV [MeOH, nm (log e)]: 226 (4,33), 293 (sh, 4,36), 317 (4,52). IR (KBr): 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1070,1044 cm-1. 1H RMN (600 MHz, CD3OD) d: dat în Tabelul 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: dat în Tabelul 3. FABMS cu ioni pozitivi: m/z 835 (M plus Na) plus. FABMS cu ioni negativi: m/z 811 (MH)-.

3.3.2. Kankanoside

H2 (2) O pulbere albă, ½a- 25D-52,4 (c 0,27, MeOH). FABMS cu ioni pozitivi de înaltă rezoluție: Calculat pentru C37H48O20Na (M plus Na) plus: 835,2637. Găsit: 835,2644. UV [MeOH, nm (log e)]: 228 (4,26), 290 (sh, 4,22), 316 (4,37). IR (KBr): 3420, 1717, 1638, 1605, 1508, 1159, 1067 cm-1. 1H RMN (600 MHz, CD3OD) d: dat în Tabelul 2. 13C RMN (150 MHz, CD3OD) dC: dat în Tabelul 3. FABMS cu ioni pozitivi: m/z 835 (M plus Na) plus FABMS cu ioni negativi : m/z 811 (MH)-.

3.3.3. Kankanodul I (3)

O pulbere albă, ½a-25D-62.2 (c 1.{00, MeOH). FABMS cu ioni pozitivi de înaltă rezoluție: Calculat pentru C35H46O18Na (M plus Na) plus: 777,2581. Găsit: 777,2585. UV [MeOH, nm (log e)]: 246 (3,97), 295 (sh, 4,04), 334 (4,23). IR (KBr): 3415, 1717, 1647, 1603, 1508, 1070,1046 cm-1. 1H RMN (600 MHz, CD3OD) d: dat în Tabelul 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: dat în Tabelul 3. FABMS cu ioni pozitivi: m/z 777 (M plus Na) plus. FABMS cu ioni negativi: m/z 753 (MH)-.

3.4. Hidroliza alcalină și acidă de 1–3

Soluțiile de 1, 2 și 3 (fiecare 1,5 mg) în hidroxid de potasiu apos 5% (KOH, 0,5 ml) au fost agitate la 40 grade timp de 1 oră. Fiecare soluție a fost neutralizată cu Dowex HCR W2 (formă H plus) și rășinile au fost îndepărtate prin filtrare. Evaporarea solventului la presiune redusă a produs produșii deacilati corespunzători, care au fost supuși analizei HPLC [coloana: Cosmosil pNAP,250 - 4,6 mm id; faza mobilă: CH3CN–1% AcOH apos (15:85, v/v); detecție: UV (254 nm); debit: 1,0 mL/min] pentru a fi identificat ca acid trans-cafeic (tR 9,9 min de la 3), acid trans-p-cumaric (tR 17,1 min de la 1) și acid cis-p-cumaric (tR17,8 min de la 2), respectiv. Apoi fiecare a fost dizolvat în 1,0 MHCl (1,{0 mL) și încălzit la 80 C timp de 3 ore. După răcire, amestecul de reacție a fost neutralizat cu Amberlite IRA-400 (forma OH), iar rășinile au fost îndepărtate prin filtrare. După îndepărtarea solventului la presiune redusă, reziduul a fost separat prin coloana cu cartuş Sep-Pak C18 (H20-MeOH). Fracţia eluată cu H2O a fost supusă analizei HPLC în următoarele condiţii: coloană HPLC, Kaseisorb LC NH2-60-5, 4,6 mm id - 250 mm (Tokyo Kasei Co., Ltd, Tokyo, Japonia); detecție, rotație optică[Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd, Tokyo, Japonia); fază mobilă, CH3CN–H2O (85:15, v/v); debit 0,8 mL/min]. Identificarea L-ramnozei (i) și D-glucozei (ii) eliberate din 1, 2 sau 3 în fracția eluată cu H2O au fost efectuate prin compararea timpilor de retenție și rotație optică a acestora cu cele ale probelor autentice [i,tR 9,9 min. (negativ)] și [ii, tR 17,9 min (pozitiv)].

3.5. Biotest

3.5.1. Reactivi

LPS (de la Salmonella enteritidis), mediu esențial minim (MEM) și mediu William's E au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich Chemical (St. Louis, MO, SUA); serul fetal bovin (FBS) a fost de la Invitrogen (Carlsbad, CA, SUA); și alte substanțe chimice au fost de la Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd (Osaka, Japonia). 96-Microplăcile Well au fost achiziționate de la Sumitomo Bakelite Co., Ltd (Tokyo, Japonia).

3.5.2. animale

Șoarecii masculi ddY au fost achiziționați de la Kiwa Laboratory AnimalCo., Ltd, (Wakayama, Japonia). Animalele au fost găzduite la o temperatură constantă de 23 ± 2 C și au fost hrănite cu un laborator standard (MF, Oriental Yeast Co., Ltd, Tokyo, Japonia). Toate experimentele au fost efectuate cu șoareci conștienți, dacă nu este indicat altfel. Protocolul experimental a fost aprobat de Comitetul de Cercetare pe Animale Experimentale al Universității Kinki.

3.5.3. Efecte protectoare asupra șoarecilor cu leziuni hepatice induse de D-GalN/LPS

Metoda descrisă de Tiegs et al.51 a fost modificată și utilizată pentru acest experiment. Pe scurt, șoarecii masculi ddY cântărind aproximativ 25-30 g s-au alimentat timp de 20 de ore înainte de experiment. D-GalN (350 mg/kg) și LPS (10 lg/kg) dizolvate în soluție salină au fost injectate intraperitoneal pentru a produce leziuni hepatice. Fiecare probă de testat a fost administrată oral cu 1 oră înainte de injectarea D-GalN/LPS. Au fost colectate probe de sânge din plexul venos infraorbital la 10 ore după injectarea D-GalN/LPS. Nivelurile sAST șisALT au fost determinate folosind metoda Reitman-Frankel (kit comercial, Transaminase CII-Test Wako, Wako Pure ChemicalIndustries, Co., Ltd). Hidrocortizonul a fost utilizat ca compus de referinţă. Probele de testat au fost suspendate cu 5% soluție de gumă arabică, iar soluția a fost administrată oral la 10 ml/kg în fiecare experiment, în timp ce vehiculul a fost administrat oral la 10 ml/kg în grupul de control corespunzător.

3.5.4. Efecte protectoare asupra citotoxicității induse de D-GalN în hepatocitele de șoarece de cultură primară

Efectul hepatoprotector al constituenților a fost determinat de bromura de {{{0}}(4,{5-dimetiltiazol-2-il){-2,5-difeniltetrazoliu (MTT ) test colorimetric folosind hepatocite primare de șoarece de cultură.33–43 Hepatocitele au fost izolate de la șoareci maleddY (30–35 g) prin metoda perfuziei colagenazei. O suspensie de celule la 4 - 104 celule în 100 lL mediu William's E care conţine FBS (10 la sută), penicilină G (100 unităţi/mL) şi streptomicina (100 lg/mL) a fost inoculată într-o microplacă de 96-godeuri şi pre-cultivat timp de 4 ore la 37 de grade sub o atmosferă de 5% CO2. Mediul a fost adăugat cu 100 iL de mediu proaspăt conţinând D-GalN (2 mM) cu sau fără proba de testat şi hepatocitele au fost cultivate timp de 44 de ore. Mediul a fost schimbat cu 100 1L de mediu proaspăt și 10 1L de MTT [5 mg/mL în soluție tamponată cu fosfat (PBS)] s-au adăugat la mediu. După 4 ore de incubare, mediul a fost îndepărtat și s-au adăugat apoi 100 1L de izopropanol care conține 0,04 M HCI pentru a dizolva formazanul produs în celule. Densitatea optică (OD) a soluției de formazan a fost măsurată cu un cititor de microplăci la 570 nm (referință: 655 nm). Inhibarea (procent) a fost obţinută prin următoarea formulă.

Inhibație (procent)= [(OD(eșantion) - OD(control))/(OD(normal)-OD(control))] x 100

3.5.5. Efecte asupra producției de NO în macrofagele peritoneale de șoarece stimulate cu LPS

Un test de screening pentru producția de NO folosind macrofage peritoneale de șoarece induse de TGC a fost efectuat așa cum s-a descris anterior.43,46,

3.5.6. Efecte asupra producției de TNF-a în macrofagele peritoneale de șoarece stimulate de LPS

TNF-a eliberat în mediu a fost determinat așa cum s-a descris anterior28, cu o ușoară modificare. Pe scurt, macrofagele peritoneale de șoarece induse de TGC (5 - 105 celule/godeu) au fost colectate din cavitățile peritoneale ale șoarecilor masculi ddY, suspendate în 100 lLof RPMI 1640 suplimentat cu 5% FBS, penicilină (100 unități/ ml) și streptomicina (100 lg/mL) și pre-cultivate în 96-microplate de godeuri la 37 de grade în 5% CO2 în aer timp de 1 oră. Celulele neaderente au fost îndepărtate prin spălare cu PBS și s-au adăugat 100 1L de mediu proaspăt care conține diferite concentrații de compus de testat. După 10 min, s-au adăugat 100 1L de mediu care conține 10 lg/mL LPS și s-au incubat timp de 4 ore. Producția de TNF-a în fiecare godeu a fost determinată utilizând un kit ELISA (kit ELISA TNF-a de șoarece, Invitrogen). Fiecare compus de testat a fost dizolvat în DMSO și soluția a fost adăugată la mediu (concentrația finală de DMSO 0,5 la sută)

3.5.7. Efecte inhibitoare asupra morții celulare induse de TNF-a în celulele L929

Celulele L929 (Dainippon Pharmaceuticals, Osaka, Japonia) au fost menținute în Minimum Essential Medium Eagle (MEM, Sigma–Aldrich) care conține 10 procente FBS, 1 procente MEM aminoacizi neesențiali (Invitrogen), penicilină G (100 unități) /mL) și streptomicina (100 lg/mL) la 37 C într-o atmosferă de 5% CO2. Celulele au fost inoculate într-o placă de cultură de țesut 96-godeu [3 -104 celule/godeu în 100 lL/godeu în MEM]. După 44 de ore de incubare în mediu TNF-a (20 ng/mL) cu sau fără proba de testat, viabilitatea celulelor a fost evaluată prin testul colorimetric MTT (videante).49,50 Fiecare compus de testat a fost dizolvat în DMSO și soluţia a fost adăugată la mediu (concentraţia finală în DMSO0,5 procente).

3.6. Statistici

Valorile sunt exprimate ca medii ± SEM Analiza unidirecțională a varianței (ANOVA) urmată de testul Dunnett a fost utilizată pentru analiza statistică. Valorile probabilității (p) mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative.

Mulțumiri

TM, KN și OM au fost susținute de un Grant în ajutor pentru cercetare științifică de la Proiectul „Centrul de cercetare de înaltă tehnologie” pentru universități private: subvenție fond de egalitate dintr-un Grant în ajutor pentru cercetare științifică de la Ministerul Educației, Culturii , Sport, Știință și Tehnologie (MEXT) din Japonia, 2007–2011 și, de asemenea, susținut de un Grant-in-Aid pentru cercetare științifică de la MEXT. MY și HM au fost sprijiniți de cel de-al 21-lea Program COE, Proiectul Academic Frontier și de un Grant-in-Aid pentru cercetare științifică de la MEX

De la: ' Acilatfeniletanoidoligoglicozide cu activitate hepatoprotectoare din planta deșertuluiCistanche tubulosa' deToshio Morikawa și colab

---Bioorganic & Medicinal Chemistry 18 (2010) 1882–1890.