Vaccinul împotriva adenovirusului care conține subunitatea trunchiată a proteinei Spike S1 SARS-CoV-2 duce la un răspuns imun specific la șoareci

AbstraCT:Dezvoltarea unui vaccin eficient și sigur împotriva bolii coronavirus 2019 (COVID-19) este o abordare crucială pentru gestionarea pandemiei de coronavirus 2 (SARS-CoV-2) a bolii respiratorii acute severe în lumina condițiilor actuale. În acest studiu, am produs un segment scurt al genei optimizate SARS-CoV-2 (2043 bp, denumită S1) care a fost capabilă să codifice o proteină S1 trunchiată. Proteina a fost testată pentru a determina dacă ar putea provoca o imunizare eficientă la șoareci împotriva SARS-CoV-2. Prezența proteinei S1 a fost confirmată prin imunofluorescență și Western blot. Un vaccin adenovirus purtând fragmentul de genă S1 (Ad-S1) a fost administrat intramuscular la şoareci de patru ori pe parcursul a 4 săptămâni. Imunitatea umorală a proteinei SARS-CoV-2 S1 a fost demonstrată la toți șoarecii imunizați. Serul de la șoareci imunizați a demonstrat o activitate anti-infectie excelentă in vitro. Un răspuns imun umoral robust împotriva SARS-CoV-2 a fost observat la șoareci după vaccinarea cu Ad-S1, ceea ce sugerează că vaccinul adenovirus poate ajuta la dezvoltarea vaccinurilor împotriva SARS-CoV-2 și a altor tipuri distincte genetic. virusuri.

cistanche tubulosa-imbunatateste sistemul imunitar

Cuvinte cheie: SARS-CoV-2; vaccinuri; vector adenoviral; gena S1; imunitate

1. Introducere

Boala coronavirus 2019 (COVID-19) este adesea asociată cu insuficiență de organe multiple și rate ridicate de mortalitate [1] și reprezintă o amenințare majoră pentru siguranța publică la nivel mondial. Începând cu 15 iulie 2022, pandemia COVID-19 a persistat la nivel global, cu 557.917.904 de cazuri confirmate, inclusiv 6.358.899 de decese, raportate la Organizația Mondială a Sănătății (OMS). În plus, au fost administrate un total de 12.130.881.147 de doze de vaccin începând cu 11 iulie 2022. Prin urmare, proiectarea și dezvoltarea de noi vaccinuri împotriva coronavirusului (nCoV) sunt de mare importanță și una dintre prioritățile de top în domeniul sănătății globale. Proteina S este un factor cheie în intrarea SARS-CoV-2 coronavirus 2 a bolii respiratorii acute severe (SARS-CoV-2) în celulele gazdă [2,3]. Proteina se leagă de receptorul gazdă și permite virusului să intre fără probleme în celula gazdă [4]. Glicanii N-legați ies de pe suprafața trimerului și decorează proteina S în mod extensiv, afectând plierea proteinei S, imunitatea umorală și procesarea proteazei celulei gazdă [5]. Proteina S SARS-CoV-2 are o densitate mai mică a glicanilor N-legați decât alte proteine ​​​​S umane patogene induse de coronavirus [6]. Prin urmare, proteina S poate fi foarte imunogenă și este o țintă majoră a anticorpilor de neutralizare. Proteina S are trei domenii structurale, printre care domeniul S1 este cel mai important antigen de suprafață al proteinei S [4]. Datorită dificultății de a produce proteine ​​recombinante mari (domeniul extracelular al proteinei S este de aproximativ 1300 de aminoacizi) și riscul de îmbunătățire dependentă de anticorpi (ADE) a infecției, S1 (aproximativ 700 de aminoacizi) și domeniul său de legare la receptor (RBD, aproximativ 200 de aminoacizi) sunt considerate pe scară largă drept cele mai atractive ținte potențiale pentru un vaccin împotriva coronavirusului [7,8]. Adenovirusul uman serotip 5 (HAdV-C5) este utilizat pe scară largă în virologia de bază ca terapie genică și vector de livrare a vaccinului [9]. HAdV-C5 are diversitate naturală și poate parazita majoritatea gazdelor, ceea ce formează baza pentru dezvoltarea experimentelor pe animale. Vectorii adenovirus recombinanți cu replicabilitate și defecte de replicare construiți din HAdV-C5 au fost utilizați pe scară largă în administrarea vaccinului și terapia genică [9,10]. În prezent, adenovirusurile au fost aprobate ca vaccinuri împotriva infecțiilor respiratorii acute și au existat multe teste cu astfel de vaccinuri, cum ar fi pentru malarie și HIV-1 [9]. În această lucrare, descriem un vaccin cu vector adenovirus uman cu deficit de replicare SARS-CoV-2 și prepararea și aplicarea acestuia. În acest studiu, vaccinul adenovirus a fost construit după cum urmează: vectorul a fost un adenovirus uman HAdV-C5 cu deleție E1 și E3, cu deleție E1 și E3, plasmida scheletului a fost adenovirus recombinant cu pBHGlox∆E1,3Cre, linia celulară de ambalare a fost celule HEK293, iar gena țintă a fost gena trunchiată a proteinei S1 a SARS-CoV-2. Expresia proteinei S1 în vaccin a fost identificată prin teste Western blot și imunofluorescență. Pentru a determina calitatea răspunsurilor imune induse de candidații vaccin pe bază de vârfuri, răspunsul anticorpilor post-vaccinare a fost examinat în detaliu. Beneficiul imunitar al vaccinului a fost evaluat cu un test cu anticorpi de legare (testul imunosorbent legat de enzime [ELISA]) și un test cu anticorpi de neutralizare. Descoperirile noastre oferă baza pentru dezvoltarea și evaluarea vaccinurilor și tratamentelor COVID-19 bazate pe proteina S1.

2. Materiale și Metodă

2.1. Celule și animale

Liniile de celule de rinichi de maimuță HEK293 și Vero E6 au fost utilizate în acest studiu. Ambele linii celulare au fost crescute în mediu Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) suplimentat cu 2% ser fetal bovin (FBS) și 1% penicilină și streptomicina la 37 ◦ C cu 5% CO2 și umiditate saturată. Douăzeci de șoareci femele C57BL/6 (6-8 săptămâni) au fost achiziționați de la Centrul experimental pentru animale Zhejiang, provincia Zhejiang. Șoarecii au fost împărțiți aleatoriu în două grupuri cu 10 șoareci în fiecare grup. Un grup a fost imunizat (injecție intraperitoneală de 100 µL) cu un vector Ad5 care exprimă proteina spike SARS-CoV-2 (Ad{5-S) și celălalt cu PBS (injecție intraperitoneală de 100 µL) ca martor. Cantitatea totală de virus a fost de 5 × 109 VP Toți șoarecii au fost imunizați cu injecție intramusculară D0/D14 [11,12]. La D14, a fost prelevat sânge periferic de 100 uL, serul a fost separat și a doua injecție a fost administrată la două ore după colectarea sângelui. La D28, sângele a fost colectat prin puncție retroorbitală și serul a fost separat. Anticorpii de legare au fost detectați la 3 zile după fiecare recoltare de sânge, anticorpii neutralizanți au fost detectați la 7 zile după fiecare recoltare de sânge și citokinele au fost detectate la 7 zile după a doua recoltare de sânge. Toți șoarecii au fost eutanasiați; toate testele au fost efectuate în strictă conformitate cu „Orientările pentru îngrijirea și utilizarea animalelor experimentale din Republica Populară Chineză” și aprobate de Consiliul de etică al Universității Zhejiang Shuren.

2.2. Vaccinuri

Toate tulpinile SARS-CoV-2 utilizate în acest studiu au fost colectate de la pacienți cu COVID-19 cu consimțământ. Laboratorul cheie de stat pentru diagnosticarea și tratarea bolilor infecțioase a dezvoltat un vaccin împotriva adenovirusului (celula Vero, tulpină WuHan, număr GISAID: EPI_ISL{_415711) împotriva SARS-CoV-2 și apoi vaccinul a fost fabricat într-un cadru conform nivelului de biosecuritate (BSL). Specificația vaccinului este de 0,5 ml/doză și conține Tris, NaCl, zahăr din trestie, MgCl2,6H2O, C6H9N3O2, etanol absolut și proteina SARS-CoV-2 S1.

2.3. Construcția adenovirusului recombinant

Secvența proteinei SARS-CoV-2 S1 (nr. QRU91950.1) a fost obținută de la PubMed. Conform degenerarii genei, secvența optimizată de nucleotide de codon adecvată pentru expresia celulelor de mamifere a fost proiectată pe baza premisei că secvența de aminoacizi a proteinei produsului codificată de proteina SARS-CoV-2 S1 a rămas neschimbată. Lungimea totală a fost de 2043 bp. Secvența de 50 de precursori a fost sintetizată cu activator tisular de plasminogen (tPA) și secvența care codifică SARS-CoV-2 S1 aminoacidul 2–688 și secvența precursorului tPA au fost ligate. O secvență Kozak și un situs de restricție Spel au fost adăugate în fața codonului de pornire și a fost adăugat situl de restricție Xbal după codonul de terminare. Secvențele de nucleotide ale genelor de mai sus au fost sintetizate și donate în pUC18 de către Sangon Biotech pentru a obține plasmida donată a genei sintetice. Secvența genei S1 sintetizată și vectorul pDC316 au fost digerate cu endonucleazele de restricție Spel și Xbal. Fragmentul țintă și vectorul au fost extrase din gel și conectate pentru a forma o plasmidă navetă. Plasmida navetă SARS-CoV-2 a fost ambalată cu plasmida scheletului sistemului de adenovirus AdMax pBHGloxd∆E1 și 3Cre prin co-transfecția celulelor HEK293. Soluția de virus primar a fost obținută după înghețare-dezghețare și centrifugare repetate, iar virusul a fost amplificat și cultivat după purificarea plăcii.

cistanche beneficii pentru bărbați-întărește sistemul imunitar

Faceți clic aici pentru a vedea produsele Cistanche Enhance Immunity

【Cereți mai multe】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Determinarea titrului de adenovirus

Celulele HEK293 în stare bună de sănătate au fost selectate și resuspendate pentru a prepara o suspensie de celule de 5,{2}} × 1{05 celule/ml, care a fost însămânțată într-o placă de 24-godeuri (1 ml/godeu). ) și cultivate la 37 ◦C într-un mediu cu 5% CO2. Proba a fost diluată în serie de zece ori și o probă diluată (0,1 ml) de 10-5 până la 1{0-8 celule a fost inoculată pe o placă de 24-godeuri . Apoi, plăcile au fost expuse la infecție la 37 ◦ C cu 5% CO2 timp de 48 de ore. Ulterior, mediul de cultură a fost îndepărtat, s-a adăugat metanol pre-răcit (0,5 ml) și probele au fost fixate la -20 ◦ C timp de 20 de minute. După fixare, probele au fost spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și blocate cu 1% albumină serică bovină (BSA, 0,2 mL) la 37 °C timp de 1 oră. Apoi, anticorpii primari (Mouse Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) și secundari (Goat pAb la MS IgG2a(HRP), Abcam ab97245, 1:1000) au fost adăugați și incubați timp de 1 oră, timp în care PBS a fost folosit pentru spălare. După incubare, a fost adăugată o soluție de lucru nou preparată (0,2 ml) și incubată timp de 5-10 minute la temperatura camerei. Apoi, soluția de lucru a fost aruncată, probele au fost spălate cu PBS și a fost adăugat din nou PBS (1 mL). A fost calculat numărul mediu de celule pozitive în câmpul microscopic (cat. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope), unde a fost selectat un gradient cu 5–50 de celule pozitive în câmpul vizual și au fost selectate aleatoriu cel puțin cinci zone pentru numărare . S-a calculat numărul de câmpuri vizuale din fiecare godeu al plăcii 24-de godeuri. Apoi, titrul virusului a fost calculat conform următoarei formule (1):

2.5. PCR în timp real

Pentru a detecta expresia ARNm a celulei HEK293 după infecția virală, am extras ARN intermediar conform instrucțiunilor de operare TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, SUA). ARN-ul total a fost extras folosind TRIzol și procesat cu DNază I fără RNază RQ1 (Promega, Madison, WI, SUA) pentru a elimina ADN-ul rezidual. ADN-ul complementar (ADNc) a fost obținut prin transcrierea inversă a ARN-ului extras folosind un kit de reactiv PrimerScript™ RT cu kit de șters gDNA (Takara, Kusatsu, Japonia). Fragmentele de ADN au fost generate cu primerii specifici P1 (50 -GGTGATTCTTCTTCAGGTTGGA{-30) și P2 (50 -GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30) ​​ai genei țintă (S1). Gena a fost amplificată cu primerii P3 (50 -GCTTCACCCACCATGGAGAA-30) și P4 (50 -TAAGCAGTTGGTGGGTGC{-30) ca control intern (GAPHD).

2.6. Western Blot

Lizatul celular și supernatantul au fost separate cu electroforeză în gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE) și apoi transferate pe membrane de fluorură de poliviniliden (PVDF). Petele au fost vizualizate cu echipament de imagistică Western blot (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA). Pe scurt, membranele au fost transferate în TBST (50 mL Tris-HCI, pH 7,5, 8 g NaCI [{0,5 mL], 0,2 g KCl, 0,5 mL Tween -20) cu lapte praf uscat degresat 5% și agitat pe un agitator decolorant la temperatura camerei timp de 1 oră. Membranele grupurilor experimentale și de control au fost îndepărtate din soluția de etanșare și incubate cu anticorpul primar: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000, cat. #40591- T62, Sino Biological, Beijing, China)] la temperatura camerei. Anticorpii primari au fost agitați și incubați peste noapte pe un agitator de decolorare la 4 ◦ C. Pata a fost clătită cu soluție TBST și incubată timp de 2 ore cu anticorpul secundar [imunoglobulină G de capră anti-iepure (IgG) H&L (HRP) (1:10.000, cat. #ab6721, Abcam, Cambridge, Marea Britanie)]. După clătire, petele au fost incubate timp de 1 minut cu un kit de soluție LumiBest ECL Substrate (cat. #4AW011-100, 4A Biotech) și apoi observate într-un aparat de imagine.

2.7. Test de imunofluorescență

Celulele HEK293 (3 × 106/godeu) au fost însămânțate în plăci de 12-godeuri. După 48 de ore, celulele au fost infectate cu adenovirus care conține gena S1 (Ad-S1). După 48 de ore, mediul a fost aspirat, iar celulele au fost spălate o dată cu PBS care conține 2% BSA și fixate timp de 15 minute cu metanol care a fost pre-răcit timp de 15 minute la -20 °C. După trei spălări cu 2% BSA în PBS, celulele au fost permeabilizate cu 0,5% Triton X-100 timp de 10 minute. Apoi, celulele au fost blocate timp de 1 oră cu 2 mL 2% BSA, soluția de blocare a fost aruncată și celulele au fost spălate de trei ori cu PBS. Ulterior, s-au adăugat 2 ml de anticorp primar [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #{40591-T62, Sino Biological)] la fiecare godeu și incubat la temperatura camerei timp de 1 oră sau 4 ◦C peste noapte. Apoi, proba a fost clătită de trei ori cu 2% BSA timp de 5 minute per clătire. Apoi, s-au adăugat 2 ml de anticorp secundar [IgG de capră anti-iepure H&L (Alexa Fluor 488) (1:1000, cat. #550037, ZenBio)] la fiecare godeu și s-au incubat la temperatura camerei timp de 1 oră. Ulterior, probele au fost clătite de trei ori cu 2% BSA timp de 5 minute per clătire. 40, în fiecare godeu s-a adăugat soluție de6-diamidino{-2-fenilindol (DAPI) (2 ml, 1 mg/ml) (1:400, cat. #S0001, Bioss, Woburn, MA, SUA) și a reacționat timp de 10 minute în întuneric. Analiza a fost observată cu un sistem de imagistică EVOS™ M7000 (cat. #AMF7000, Invitrogen).

2.8. ELISA

Proteina S SARS-CoV-2 (1 µg/mL) a fost acoperită peste noapte în plăci cu 96-godeuri (100 µL/godeu) cu 0. 0Tampon bicarbonat de 5 M. După spălarea cu PBST (0,2 g KH2PO4, 2,9 g Na2HPO4·12H2O, 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,5 ml Tween-20, adăugați apă la 1000 ml) cinci de ori, soluția de blocare a fost adăugată și incubată la 37 °C timp de 1 oră. Proba de ser a fost diluată şi adăugată în fiecare godeu (100 uL/godeu). După 1 oră de incubare la 37 ◦ C, probele au fost spălate cu PBST de cinci ori. Anticorpul primar [SARS-CoV-2 ({2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #{40591-T62, Sino Biological)] a fost adăugat și incubat timp de 1 oră, apoi probele au fost spălate de cinci ori cu PBST, urmată de 1 oră de incubare la 37 ◦C cu anticorp secundar conjugat cu peroxidază de hrean [IgG H&L de capră anti-iepure (HRP) (1:10.000, cat. #ab6721, abcam)] și cinci se spală cu PBST. După adăugarea a 3, 30, 5 și 50-tetrametil bifenil anhidridă timp de 5 minute, reacția a fost oprită cu acid sulfuric 2 M. Densitatea optică a fost măsurată la 450 nm și 630 nm cu un instrument de etichetare a enzimelor (Molecular Devices, SpectraMax 190) și apoi ajustată la o curbă standard.

Beneficiile cistanche tubulosa- intareste sistemul imunitar

2.9. Determinarea citokinelor 

Placa (cat. #T-k15048D-1, MSD) a fost spălată de trei ori cu 150 ui tampon de spălare/godeu și a fost adăugată o probă preparată de 50 ui în fiecare godeu. Apoi, placa a fost sigilată cu un sigiliu a plăcii adezive și incubată la temperatura camerei cu agitare timp de 2 ore. Apoi, placa a fost spălată de trei ori cu tampon de spălare 150 uL/godeu și s-au adăugat 25 uL soluție de anticorp de detectare în fiecare godeu. Placa a fost sigilată din nou și incubată la temperatura camerei cu agitare timp de 2 ore. Apoi, placa a fost spălată de trei ori cu cel puţin 150 uL/godeu tampon de spălare; La fiecare godeu s-au adăugat 150 uL 2x Read Buffer T (MSD) și placa a fost analizată pe un instrument MSD.

2.10. Anticorp neutralizant

2.10.1. Test de neutralizare a pseudovirusului

Activitatea de neutralizare a serului la șoarece a fost testată utilizând un sistem pseudoviral al virusului stomatitei veziculoase (VSV). Serul a fost inactivat într-o baie de apă timp de {{0}},5 ore la 56 ◦C, apoi a fost diluat în serie la intervalul necesar. Celulele HEK293 au fost placate într-o placă de 96-godeuri. Serul diluat a fost amestecat cu 200 CCID50 (doza de virus care poate infecta 50% din cultura celulară)/100 µL de suspensie de virus într-un raport de 1:1 și plasat într-un incubator cu CO2 (37 ± 1 ◦C) pentru 2 h. Apoi, în fiecare godeu s-au adăugat 100 µL de soluție de întreținere a virusului care conține 0,5% anticorp dublu penicilină-streptomicină, iar amestecul neutralizat a fost inoculat într-o placă de 96-godeuri care conținea celule la 100 µL per godeu, cu două godeuri repetate pentru fiecare diluție. În același timp, a fost stabilit un control celular normal și celulele au fost incubate într-un incubator cu CO2 (37 ± 1 ◦C) timp de 96 de ore. Apoi, 200 CCID50/100 µL de soluție de virus au fost diluați la 10-1~10-3. Mediul de cultură celulară din placa de 96-godeuri a fost aruncat, s-au adăugat 150 µL de soluție de întreținere a virusului în fiecare godeu, iar diluția de soluție de virus a fost inoculată la o concentrație de 10-1~{{33} } în godeurile plăcii de 96-godeuri (50 µL per godeu). Fiecare diluție a fost repetată în 8 godeuri; un control celular normal a fost stabilit în același timp, urmat de cultură timp de 96 de ore. Modificările în CPE celulelor au fost observate la microscop inversat. Controlul celular normal ar trebui să nu aibă modificări citopatice, iar controlul pozitiv ar trebui să aibă modificări CPE. Punctele finale de neutralizare (diluțiile serului convertite în logaritmi) au fost calculate prin observarea CPE. Criteriul seronegativ/pozitiv a fost 1:12 ca criteriu pozitiv/negativ,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Test de neutralizare în direct

Activitatea de neutralizare a serului la șoarece a fost evaluată printr-un test de neutralizare viu. Serul diluat a fost amestecat cu SARS-CoV-2 și incubat la 37 ◦C timp de 1 oră. Amestecul a fost adăugat pe o placă de 96-godeuri pentru a infecta celulele Vero E6. După incubare 72-h la 37 ◦C, efectul citopatic al virusului (CPE) a fost observat sub mărire x40 și a fost calculat titrul de neutralizare (reciproca de 50% diluție a serului necesară pentru a neutraliza infecția cu virus). Procedurile de mai sus au fost toate efectuate într-un mediu de nivel 3 de biosecuritate.

2.11. Analize statistice

Analizele statistice au fost efectuate printr-un test t cu două eșantioane folosind SPSS 26. Valorile p mai mici sau egale cu 0,05 au fost considerate semnificative. Tendința centrală a fost măsurată cu media geometrică a titrului (GMT).

3. Rezultate

3.1. Construcția adenovirusului recombinant

S-a obţinut plasmida navetă adenovirus recombinată pAdeno-CMV-S1 cu inserare corectă; diagrama sa de structură este prezentată în Figura 1. Adenovirusul recombinant conținea genomul HAdV-C5 lipsit de regiunea E1/E3. O diagramă schematică a vectorului adenovirus recombinant obținut prin transfecția plasmidei navetă și a citoscheletului în celule HEK293 este prezentată în Figura 1.

3.2. Caracterizarea adenovirusului recombinant

Plasmida recombinantă care conține gena țintă a fost identificată prin PCR (vezi Figura 2A pentru rezultatele electroforezei pe gel). Acesta a fost un experiment repetat. Secvențele de primer au fost MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag și S1-R acaataagtagggactgggtc, iar secvențierea a confirmat că secvența a fost în concordanță cu designul. Expresia SARS-CoV-2 S1 în celule a fost detectată cu Western blot (Figura 2B) și imunofluorescență indirectă (Figura 2C). Colorația benzii (~75 kDa) a fost detectată prin Western blot și a fost în concordanță cu poziția așteptată a benzii. La nivel transcripțional, expresia in vitro a S1 a fost detectată prin PT-PCR. Rezultatele au arătat că expresia ARNm S1 în celulele HEK-293 a fost semnificativ mai mare decât cea din grupul de control.

Figura 1. Construcția vaccinului adenovirus recombinant și strategia experimentală. (A) pAdeno-CMV-S1 este o plasmidă navetă recombinantă a adenovirusului care conține gena țintă S1. pBHGlox∆E1,3Cre este plasmida scheletului adenovirusului. pBHGlox∆E1,3Cre și pAdeno-CMV-S1 au fost extrase cu un kit de extracție a plasmidei QIAGEN (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Beijing, China). Cu o zi înainte de transfecție, celulele HEK293 au fost trecute într-un balon de cultură celulară de 25 cm2. Mediul de cultură a fost DMEM conţinând 5% FBS fără antibiotice. În a doua zi, 60-80% din celule au fost selectate și soluția de transfecție a fost adăugată la celule. După 7 zile de transfecție, celulele au fost răzuite, centrifugate, supernatantul eliminat și celulele au fost resuscitate cu PBS. Celulele au fost înghețate-dezghețate în mod repetat la -80 ◦ C și 37 ◦ C. După centrifugare, supernatantul a conținut soluția primară de virus. Tulpina de adenovirus recombinant a fost purificată, amplificată şi obţinută după procesare ulterioară şi a fost desemnată Ad-S1. Vaccinul a fost injectat intramuscular în șoareci pentru studii ulterioare. (B) Scala de timp ilustrată a imunizării și retragerii sângelui.

3.3. Titrul de adenovirus

În acest experiment, a fost calculată o medie de șase celule pozitive în cinci câmpuri microscopice, iar virusul din godeu a fost diluat de 108 ori. Pe baza formulei descrise în secțiunea Materiale și metodă, titrul de adenovirus a fost de 4,74 × 1011 unități formatoare de plăci (pfu)/mL (Figura 2D).

3.4. Imunitatea celulară post-vaccinare

În timpul perioadei de testare, au existat modificări semnificative statistic ale citokinelor serice (p mai mic sau egal cu 0,05), care au arătat în principal că concentrația de chemoatractant de cheratinocite/oncogene reglată de creșterea umană (KC/GRO) a fost au scăzut, iar concentrațiile de IFN-, IL-10, IL-12p70, IL-1, IL-2, IL-4, IL{{10} } și TNF- au fost crescute, în timp ce concentrația de IL-6 nu a fost modificată semnificativ (Figura 3).

Figura 2. Identificarea proteinei S1 recombinate HAdV-C5–SARS-CoV-2 și determinarea titrului de adenovirus. (A) Detectarea PCR a plasmidei recombinante cu gena țintă S1. (B) Detectarea Western blot a SARS-CoV-2. Celulele HEK293 cu creștere exponențială au fost infectate cu SARS-CoV-2 timp de 48 de ore, apoi proteina celulară a fost extrasă și separată prin SDS-PAGE. Expresia SARS-CoV-2 a fost confirmată prin Western blot cu IgG anti-iepure de capră. (C) Microscopia de imunofluorescență a celulelor HEK-293 infectate cu Ad-S1 (verde). Celulele au fost contracolorate cu 40, 6-diamidino{- 2-fenilindol (DAPI) pentru a colora nucleele. Bară de scară 1000 µm. (D) Testul pe placă a fost utilizat pentru măsurare. Micrografii care prezintă diluția 10-5, 10-6, 10-7 și 10-8 (de la stânga la dreapta).

Figura 3. Ad-S1 a indus niveluri plasmatice modificate de citokine de tip 1/2, interferoni de tip 1 și alte citokine. Rezultatele au fost detectate prin extragerea de sânge de la șoareci la 7 zile după prima imunizare. Datele sunt prezentate sub formă de diagrame de dispersie în formă de cutie și mustăți. Fiecare cerc reprezintă un singur individ. Valorile p au fost calculate folosind un test t cu două eșantioane.

3.5. Detectarea anticorpilor anti-SARS-CoV-2 S1 post-imunizare

ELISA a dezvăluit că anticorpii specifici SARS-CoV-2-au fost prezenți la șoarecii cărora li s-a injectat primul și al doilea Ad-S1, dar nu și cei injectați cu capsida de adenovirus de control sau cu soluția PBS (Ad/PBS) (Figura 4A). Titrurile de IgG de 1:210 și 1:212 au fost detectate la șoarecii vaccinați cu Ad-S1-la două săptămâni după prima și, respectiv, a doua imunizare. Titrul de diluție la 28 de zile după vaccinare (D28, GMT 2297,4) a fost de 6,1-ori mai mare decât cel de la D14 (GMT 378,9).

Figura 4. Ad-S1 a indus titruri mari de anticorpi (A) și activitate de neutralizare (B, C) la șoareci. (A) ELISA de IgG seric specific SARS-CoV{-2-de la șoareci imunizați cu Ad-S{1-. (B) Analiza activităților pseudovirusului serului de la șoarecii imunizați cu Ad-S1-. (C) Analiza activităților de neutralizare a serului de la șoarecii imunizați cu Ad-S1-

3.6. Testarea anticorpilor de neutralizare

Provocarea SARS-CoV-2 a celulelor Vero E6 a permis detectarea activității de neutralizare în serul de șoarece imunizat (Figura 4B, C). Titrurile de neutralizare D14 și D28 ale celulelor Vero E6 imunizate Ad-S{1- împotriva provocării virusului vii SARS-CoV{{{{{0}} in vitro au fost 1:24,3 și, respectiv, 1:26,3. Testul de pseudovirus a dat rezultate similare cu cele ale testului de virus viu, cu titruri de neutralizare de până la 1:28,1 și 1:29,6 la D14 și, respectiv, D28. Titrul de neutralizare a pseudovirusului D28 (GMT 769,0) a fost de 2,7-ori mai mare decât cel al D14 (GMT 283,7).

4. Discutie

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 la<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

În acest studiu, am construit un vaccin recombinant adenovirus SARS-CoV-2 care conține subunitatea SARS-CoV-2 S1 și l-am desemnat Ad-S1. La fel ca CanSinoBIO, care a fost aprobat pentru comercializare [28], am folosit HAdV-C5 în acest vaccin. Adenovirusul este utilizat pe scară largă în terapia genică recombinantă și ca vector de vaccin. Cu toate acestea, rata seropozitivă a HAdV-C5 este la fel de mare ca 75-80% în populația normală [29]. Acest lucru implică faptul că imunitatea înainte de depozitare împotriva vectorilor HAdV-C5 reduce semnificativ imunitatea indusă de vaccin. Dezvoltat la Universitatea Oxford din Regatul Unit, ChAdOx1 nCoV-19 folosește un vector de adenovirus de cimpanzeu care, dimpotrivă, are o rată seropozitivă mai mică la oameni și, atunci când este pozitiv, prezintă de obicei un titru de anticorpi seric mai scăzut [30] . Prin urmare, vectorii de adenovirus care se pot sustrage imunității preexistente pot fi explorați pentru a spori eficacitatea de protecție a vaccinului adenovirus. În studiul de față, starea serică a șoarecilor înainte și după imunizare a fost determinată prin teste ELISA și de neutralizare și a dat dovezi ale imunității umorale pentru candidatii la vaccin. Serul produs după injectarea intramusculară a vaccinului la șoareci a protejat în mod eficient celulele Vero E6 de infecția SARS-CoV-2 in vitro (Figura 4). De asemenea, am detectat un răspuns imunitar mai puternic și o protecție mai bună la șoareci după o a doua imunizare (Figura 4). Rezultatele noastre experimentale sunt similare cu rezultatele experimentale principale.

Pe măsură ce cercetările cu SARS-CoV-2 continuă, mai multe studii au demonstrat că furtuna de citokine secundară infecției cu SARS-CoV-2 poate afecta producția de celule T, făcând dificil pentru pacienți să își mențină imunitatea pe termen lung la SARS-CoV-2 [31]. Prin urmare, este necesar să se determine dacă Ad-S1 poate induce imunitatea mediată de celule T la șoareci. Rezultatele noastre au demonstrat că concentrațiile de IFN- și IL-12 au crescut, iar concentrațiile de IL-4 au scăzut în grupul Ad-S1, ceea ce indică faptul că supraviețuirea și creșterea celulelor Th1 induse de vaccin la șoareci. Secreția de IL-12, IL{-10 și TNF- de către celulele Th1 a crescut ușor în grupul experimental. Aceste rezultate au indicat că Ad-S1 a indus în mod eficient un răspuns al celulelor T părtinitor Th1-la șoareci [32]. Creșterea IL-5 a indicat că și celulele Th2 participă la răspunsul imun și produc anumite efecte. Concentrația de KC/GRO în grupul experimental a fost redusă semnificativ în comparație cu cea a grupului de control PBS, ceea ce s-ar fi putut datora chimiotaxiei neutrofile reduse care a suprimat răspunsul inflamator și a permis ca efectele secundare ale vaccinului să fie ușor controlate. Acest lucru ar fi mai benefic pentru persoanele imunodeprimate, cum ar fi persoanele în vârstă sau pacienții supuși chimioterapiei. Li M., şi colab. [29] a dezvoltat un vaccin împotriva adenovirusului folosind Ad68 ca vector. Rezultatele au arătat că activitatea de neutralizare in vivo a SARS-CoV-2 a putut fi detectată în două săptămâni după imunizarea intramusculară a șoarecilor BALB/c și apoi a continuat să crească, iar titrul de anticorpi de neutralizare (PRNT ID50) a ajuns la 957,3 la opt săptămâni. Între timp, în studiul lui Liu J., et al. [33], au fost dezvoltate vaccinuri folosind AdC6 și AdC68 ca vectori; ambele răspunsuri de anticorpi de legare și neutralizare după imunizare au fost generate la 14 zile după doză, cu un titru IgG de 7108 (titrul mediu geometric, GMT; AdC6) și 5489 (GMT, AdC68). Titrul de neutralizare 50 (NT50) al testului de neutralizare a pseudovirusului a fost 125 (GMT, AdC6) și 67 (GMT, AdC68).

cistanche tubulosa-imbunatateste sistemul imunitar

În studiul de față, șoarecii vaccinați cu Ad-S1 au avut titruri de IgG de 1:1010 și 1:122 detectate prin ELISA la două săptămâni după prima și, respectiv, a doua imunizare. Titrul de diluție al ad-s1 a fost 378,9 (GMT) la 14 zile după inoculare și 2297,4 (GMT) la 28 de zile după inoculare. În testul cu anticorpi de neutralizare, celulele Vero E6 imunizate cu Ad-S1 au prezentat o neutralizare 1:24,3 și, respectiv, 1:26,3 la D14 și, respectiv, D28 împotriva provocării virusului SARS-CoV-2 viu in vitro. Titrurile de neutralizare ale pseudovirusului la D14 și D28 au fost 283,7 (GMT) și, respectiv, 769,0 (GMT). Astfel, vaccinul din acest studiu a fost mai eficient în ceea ce privește răspunsul imun la modelul de șoarece.

Datorită limitării condițiilor experimentale, nu am efectuat o analiză a spotului imunosorbent legat de enzime (ELISpot) a celulelor imune ale splinei ale șoarecilor experimentali. Mai mult, experimentele de protecție împotriva atacurilor cu SARS-CoV-2 pe șoareci nu au putut fi efectuate din cauza limitărilor laboratorului de protecție fizică. Cu toate acestea, am stabilit că vaccinul a avut o eficacitate ridicată în modelele de șoarece și ar putea fi folosit ca o tulpină ideală de vaccin de rezervă. În plus, imunogenitatea, siguranța și eficacitatea candidaților potențiali de vaccin SARS-CoV-2 ar trebui examinate în modele animale suplimentare (de exemplu, iepuri, primate, ratoni, câini), deoarece modelele de șoareci ar putea să nu dubleze complet imunologic uman. Caracteristici.

cistanche plant-creșterea sistemului imunitar

5. Concluzii

Datele obținute din studiile noastre preclinice ale vaccinului cu adenovirus au demonstrat că vaccinul are suficientă siguranță și eficacitate. Prin urmare, poate fi un vaccin profilactic promițător și fezabil împotriva infecției cu SARS-CoV-2.

Referințe

1. Trougakos, IP; Stamatelopoulos, K.; Terpos, E.; Tsitsilonis, OE; Aivalioti, E.; Paraskevis, D.; Kastritis, E.; Pavlakis, GN; Dimopoulos, MA Perspective asupra ciclului de viață al SARS-CoV-2, fiziopatologiei și tratamentelor raționalizate care vizează complicațiile clinice COVID-19. J. Biomed. Sci. 2021, 28, 9. [CrossRef]

2. Pillay, gena TS a lunii: 2019-nCoV/SARS-CoV-2 noua proteină cu vârf de coronavirus. J. Clin. Pathol. 2020, 73, 366–369. [CrossRef]

3. Sheinin, M.; Jeong, B.; Paidi, RK; Pahan, K. Regresia cancerului pulmonar la șoareci prin administrarea intranazală a SARS-CoV-2 Spike S1. Cancers 2022, 14, 5648. [CrossRef]

4. Kadam, SB; Sukhramani, GS; Bishnoi, P.; Pable, AA; Barvkar, VT SARS-CoV-2, coronavirusul pandemic: perspective moleculare și structurale. J. Microbiol de bază. 2021, 61, 180–202. [CrossRef]

5. Sternberg, A.; Naujokat, C. Structural features of coronavirus SARS-CoV-2 Spike protein: Targets for vaccination. Life Sci. 2020, 257, 118056. [CrossRef] [PubMed]

6. Pereți, AC; Tortorici, MA; Frenz, B.; Snijder, J.; Li, W.; Rey, FA; DiMaio, F.; Bosch, BJ; Veesler, D. Scutul Glycan și mascarea epitopului unei proteine ​​​​coronavirus observate prin microscopie crio-electronică. Nat. Struct. Mol. Biol. 2016, 23, 899–905. [CrossRef] [PubMed]

7. Wang, Y.; Wang, L.; Cao, H.; Liu, C. SARS-CoV-2 S1 este superior RBD ca antigen al vaccinului subunității COVID{-19. J. Med. Virol. 2021, 93, 892–898. [CrossRef]

8. Theoharides, TC; Conti, P. Fiți conștienți de proteina cu vârf SARS-CoV-2: există mai mult decât se vede. J. Biol. Regul. Homeost. Agenti 2021, 35, 833–838. [CrossRef] [PubMed]

9. Guo, X.; Deng, Y.; Chen, H.; Lan, J.; Wang, W.; Zou, X.; Hung, T.; Lu, Z.; Tan, W. Imunitatea sistemică și a mucoasei la șoareci determinată de o singură imunizare cu vaccinuri pe bază de adenovirus uman tip 5 sau 41 care poartă proteina de vârf a coronavirusului sindromului respirator din Orientul Mijlociu. Imunologie 2015, 145, 476–484. [CrossRef] [PubMed]

10. Gao, J.; Mese, K.; Bunz, O.; Ehrhardt, A. Vectorologie de ultimă oră a adenovirusului uman pentru abordări terapeutice. FEBS Lett. 2019, 593, 3609–3622. [CrossRef]

11. Xing, K.; Tu, XY; Liu, M.; Liang, ZW; Chen, JN; Li, JJ; Jiang, LG; Xing, FQ; Jiang, Y. Eficacitatea și siguranța vaccinurilor COVID-19: o revizuire sistematică. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi 2021, 23, 221–228. [CrossRef]

12. Voysey, M.; Clemens, SAC; Madhi, SA; Weckx, LY; Folegatti, PM; Aley, PK; Angus, B.; Baillie, VL; Barnabas, SL; Bhorat, QE; et al. Siguranța și eficacitatea vaccinului ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) împotriva SARS-CoV-2: o analiză intermediară a patru studii controlate randomizate în Brazilia, Africa de Sud și Regatul Unit. Lancet 2021, 397, 99–111. [CrossRef] [PubMed]

13. Li, C.; Guo, Y.; Fang, Z.; Zhang, H.; Zhang, Y.; Chen, K. Analiza eficacității protectoare a vaccinurilor aprobate împotriva COVID-19 împotriva diverșilor mutanți. Față. Imunol. 2022, 13, 804945. [CrossRef] [PubMed]

14. Tanriover, MD; Do ˘ganay, HL; Akova, M.; Güner, HR; Azap, A.; Akhan, S.; Köse, ¸S.; Erdinç, F.; Akalin, EH; Tabak, Ö.F.; et al. Eficacitatea și siguranța unui vaccin SARS-CoV-2 cu virion întreg inactivat (CoronaVac): rezultate intermediare ale unui studiu de fază 3 dublu-orb, randomizat, controlat cu placebo, în Turcia. Lancet 2021, 398, 213–222. [CrossRef]

15. Xia, S.; Zhang, Y.; Wang, Y.; Wang, H.; Yang, Y.; Gao, GF; Tan, W.; Wu, G.; Xu, M.; Lou, Z. Siguranța și imunogenitatea unui vaccin SARS-CoV-2 inactivat, BBIBP-CorV: un studiu randomizat, dublu-orb, controlat cu placebo, de fază 1/2. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 39–51. [CrossRef] [PubMed]

16. Yang, S.; Li, Y.; Dai, L.; Wang, J.; El, P.; Li, C.; Fang, X.; Wang, C.; Zhao, X.; Huang, E.; et al. Siguranța și imunogenitatea unui vaccin recombinant cu subunități proteice pe bază de RBD dimeric cu repetare în tandem (ZF2001) împotriva COVID-19 la adulți: două studii randomizate, dublu-orb, controlate cu placebo, de fază 1 și 2. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 1107–1119. [CrossRef]

17. Mallapaty, S. Vaccinul ADN COVID al Indiei este o premieră mondială - mai vin. Natura 2021, 597, 161–162. [CrossRef]

18. Grifoni, A.; Weiskopf, D.; Ramirez, SI; Mateus, J.; Dan, JM; Moderbacher, CR; Rawlings, SA; Sutherland, A.; Premkumar, L.; Jadi, RS; et al. Țintele răspunsurilor celulelor T la coronavirusul SARS-CoV-2 la oameni cu boala COVID-19 și la persoane neexpuse. Celula 2020, 181, 1489–1501.e1415. [CrossRef]

19. Cao, Y.; Su, B.; Guo, X.; Soare, V.; Deng, Y.; Bao, L.; Zhu, Q.; Zhang, X.; Zheng, Y.; Geng, C.; et al. Anticorpi neutralizanți potenți împotriva SARS-CoV-2 identificați prin secvențierea cu o singură celulă de mare capacitate a celulelor B ale pacienților convalescenți. Cell 2020, 182, 73–84.e16. [CrossRef]

20. Amanat, F.; Krammer, F. Vaccinuri SARS-CoV-2: Raport de stare. Imunitatea 2020, 52, 583–589. [CrossRef]

21. Li, Y.; Bi, Y.; Xiao, H.; Yao, Y.; Liu, X.; Hu, Z.; Duan, J.; Yang, Y.; Li, Z.; Li, Y.; et al. O formulă nouă de vaccin COVID-19 combinată cu ADN și proteine ​​oferă protecție completă împotriva SARS-CoV-2 la macacii rhesus. Emerg. Microbii infectează. 2021, 10, 342–355. [CrossRef]

22. Du, L.; Hei.; Zhou, Y.; Liu, S.; Zheng, BJ; Jiang, S. Proteina de vârf a SARS-CoV – o țintă pentru vaccin și dezvoltare terapeutică. Nat. Rev. Microbiol. 2009, 7, 226–236. [CrossRef] [PubMed]

23. Yue, L.; Cao, H.; Xie, T.; Long, R.; Li, H.; Yang, T.; Yan, M.; Xie, Z. Proteina nucleocapside trunchiată la N-terminal a SARS-CoV-2 ca un marker serologic mai bun decât proteina nucleocapsidă întreagă în evaluarea imunogenității SARS-CoV-2 inactivate. J. Med. Virol. 2021, 93, 1732–1738. [CrossRef] [PubMed]

24. Greaney, AJ; Loes, AN; Gentile, LE; Crawford, KHD; Starr, TN; Malone, KD; Chu, HY; Bloom, JD Vaccinul SARS-CoV-2 ARNm-1273 provoacă o neutralizare mai concentrată pe RBD, dar cu o legare mai largă a anticorpilor în RBD. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Mantus, G.; Nyhoff, LE; Kauffman, RC; Edara, VV; Lai, L.; Floyd, K.; Shi, PY; Menachery, VD; Edupuganti, S.; Scherer, EM; et al. Evaluarea răspunsurilor celulare și serologice la infecția acută cu SARS-CoV-2 demonstrează importanța funcțională a domeniului de legare a receptorilor. J. Immunol. 2021, 206, 2605–2613. [CrossRef]

26. El, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Kou, Z.; Li, W.; Farzan, M.; Jiang, S. Domeniul de legare la receptor al proteinei spike SARS-CoV induce anticorpi neutralizanți foarte puternici: Implicație pentru dezvoltarea vaccinului subunității. Biochim. Biophys. Res. comun. 2004, 324, 773–781. [CrossRef]

27. Deng, S.; Liang, H.; Chen, P.; Li, Y.; Li, Z.; Fan, S.; Wu, K.; Li, X.; Chen, W.; Qin, Y.; et al. Dezvoltarea și aplicarea vaccinurilor cu vectori virali în timpul pandemiei COVID-19. Microorganisme 2022, 10, 1450. [CrossRef]

28. Zhu, FC; Guan, XH; Li, YH; Huang, JY; Jiang, T.; Hou, LH; Li, JX; Yang, BF; Wang, L.; Wang, WJ; et al. Imunogenitatea și siguranța unui vaccin de tip adenovirus recombinant-5-vectorat COVID{-19 la adulți sănătoși cu vârsta de 18 ani sau mai mult: un studiu de fază 2 randomizat, dublu-orb, controlat cu placebo. Lancet 2020, 396, 479–488. [CrossRef]

29. Li, M.; Guo, J.; Lu, S.; Zhou, R.; Shi, H.; Shi, X.; Cheng, L.; Liang, Q.; Liu, H.; Wang, P.; et al. Imunizarea în doză unică cu un vaccin pe bază de adenovirus pentru cimpanzeu induce imunitate susținută și protectoare împotriva infecției cu SARS-CoV-2. Față. Imunol. 2021, 12, 697074. [CrossRef]

30. Guo, J.; Mondal, M.; Zhou, D. Dezvoltarea de noi vectori de vaccin: vectori adenovirali cimpanzei. Zumzet. Vaccinuri Immunother. 2018, 14, 1679–1685. [CrossRef]

31. Kaneko, N.; Kuo, HH; Boucau, J.; Farmer, JR; Allard-Chamard, H.; Mahajan, VS; Piechocka-Trocha, A.; Lefteri, K.; Osborn, M.; Bals, J.; et al. Pierderea Bcl-6-exprimând celulele T foliculare auxiliare și centrele germinale în COVID-19. Cell 2020, 183, 143–157.e113. [CrossRef] [PubMed]

32. Lexberg, MH; Taubner, A.; Albrecht, I.; Lepenies, I.; Richter, A.; Kamradt, T.; Radbruch, A.; Chang, HD IFN- și IL-12 fac sinergie pentru a converti Th17 generat in vivo în celule Th1/Th17. EURO. J. Immunol. 2010, 40, 3017–3027. [CrossRef] [PubMed]

33. Liu, J.; Xu, K.; Xing, M.; Zhuo, Y.; Guo, J.; Du, M.; Wang, Q.; Orice.; Li, J.; Gao, P.; et al. Imunizările heterologe cu vectori adenovirali de cimpanzeu generează o imunitate puternică și protectoare împotriva infecției cu SARS-CoV-2. Cell Discov. 2021, 7, 123. [CrossRef] [PubMed]