Un vaccin MRNA determină răspunsuri imune antitumorale dependente de STING

Abstract

Vaccinurile ARN formulate cu lipide au fost utilizate pe scară largă pentru prevenirea și tratamentul bolilor, dar mecanismul lor de acțiune și componentele individuale care contribuie la astfel de acțiuni rămân de delimitat. Aici, arătăm că un vaccin terapeutic împotriva cancerului compus dintr-un miez de protamină/ARNm și un înveliș lipidic este foarte puternic în promovarea răspunsurilor citotoxice ale celulelor T CD8+ și în medierea imunității anti-tumorale. Din punct de vedere mecanic, atât miezul ARNm, cât și învelișul lipidic sunt necesare pentru a stimula pe deplin expresia interferonilor de tip I și a citokinelor inflamatorii în celulele dendritice. Stimularea expresiei interferonului-b este dependentă exclusiv de STING, iar activitatea antitumorală din vaccinul ARNm este compromisă semnificativ la șoarecii cu o genă Sting defectuoasă. Astfel, vaccinul ARNm provoacă imunitate antitumorală dependentă de STING.

cistanche beneficii pentru bărbați-întărește sistemul imunitar

1. Introducere

Dezvoltarea rapidă și aplicarea la nivel mondial a vaccinurilor ARNm pentru prevenirea infecției cu SARS-CoV-2 au demonstrat puterea medicamentelor pe bază de ARNm în domeniul sănătății1,2. Datorită greutății lor moleculare mari și a sarcinii negative, moleculele de ARNm trebuie să fie ambalate în vehicule de livrare pentru a pătrunde eficient în celulele de mamifere. Ambalarea în vehicule de livrare de dimensiuni nanometrice are, de asemenea, avantajul de a proteja moleculele de ARNm de degradarea enzimatică. Au fost dezvoltate mai multe platforme de livrare pentru a se potrivi scopului, cum ar fi nanoparticule de lipide4, lipopoliplex (LPP)5, lipozom-protamină-ARN (LPR)6, ARN lipoplex (ARN-LPX)7 și particule de vaccin asemănător virusului (VLVP). )8. În timp ce fiecare platformă are propria sa structură și compoziție unică, majoritatea vehiculelor conțin o moleculă de lipide ionice care facilitează ambalarea ARNm și evacuarea moleculelor de ARNm din endozomi. Odată cu succesul vaccinurilor profilactice, există o realizare generală că terapiile cu ARNm pot fi utilizate pentru a trata poate cele mai multe, dacă nu toate tipurile de boli9e12. Într-adevăr, vaccinurile terapeutice împotriva cancerului pe bază de ARNm au fost studiate de mulți ani13,14. Progresele recente în studiile clinice au demonstrat, de asemenea, potențialul lor de aplicare la pacienții cu cancer selectați15e17. Spre deosebire de vaccinurile cu peptide împotriva cancerului care sunt preparate cu molecule adjuvante18e20, particulele de vaccin ARNm pot servi și ca autoadjuvanți21.

De exemplu, un vaccin împotriva cancerului pe bază de ARNm cu două componente care conține ARNm complexat liber și protamină poate activa, de asemenea, semnalizarea receptorului de tip toll-like 7 (TLR7)22. Cu toate acestea, odată cu creșterea îngrijorării cu privire la toxicitatea imună înnăscută acută de la ARNm nu, majoritatea investigatorilor și companiilor folosesc ARN modificat pentru a evita recunoașterea înnăscută de către TLR23. În consecință, componentele lipidice joacă un rol important în creșterea activității adjuvantului în particulele de vaccin ARNm, de preferință prin activarea semnalizării non-TLR. Un studiu recent asupra lipozomului ARN-LPX încărcat negativ, formulat cu lipide, format cu 1,2- di-octadecenil-3-trimetilamoniu (DOTMA, o lipidă cationică)/dioleoilfosfatidiletanolamină (DOPE, o lipidă auxiliară) a dezvăluit activarea axei antagonistului receptorului interleukinei 1 (IL1)-interleukinei 1 (IL-1ra) în reglarea secreției de citokine proinflamatorii și rolul esențial de activare a căii inflamazome în două etape în monocite24. Interesant este că o altă investigație recentă asupra BNT162b2 pe bază de LNP preparat cu ALC-0315 (o lipidă ionizată), 1,{2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolină (DSPC, o lipidă auxiliară) , polietilenglicol-2000-N, N-di tetradecil acetamidă (PEG{2000-DTA) și colesterolul au arătat rolul cheie de activare a semnalizării MDA5 dependente de interferon de tip I, dar nu și TLR-urile sau inflamazomul, în stimularea ambelor imunitatea înnăscută și adaptativă a vaccinului COVID-1925. Aceste studii indică posibilitatea ca platformele de livrare compuse din molecule de lipide variabile să se bazeze pe diferite căi de transducție a semnalului pentru activitatea vaccinului. Astfel, este important să se investigheze pe deplin funcția moleculelor cheie și combinațiile lor pentru a îmbunătăți în continuare terapeutica ARNm.

În studiul actual, am înființat experimente pentru a diseca rolul funcțional al componentelor individuale într-un vaccin terapeutic împotriva cancerului. Particula de vaccin ARNm (MVP) este compusă dintr-un miez de protamină/ARNm care este încapsulat într-o înveliș lipidic constând dintr-o lipidă cationică, o lipidă auxiliară, o lipidă pegilată și colesterol (Fig. 1A). S-a demonstrat că includerea lipidelor încărcate poate facilita livrarea țintită a ARN26, iar dioleoiletil fosfatidilcolina (EDOPC) și dioleoil-3-trimetilamoniu propan (DOTAP) sunt două dintre lipidele cationice care au fost testate în acest scop5,27. Am examinat stimularea exprimării interferonului-b (IFN-b), IL-1b și a factorului de necroză tumorală-a (TNF-a) de către miezul ARNm, vehiculul fără ARNm și întregul MVP și au corelat astfel de activități cu TLR7, semnalizarea antivirală mitocondrială (MAVS, cunoscută și ca IPS-1), stimulatorul genelor IFN (STING) și adaptorul care conține domeniul TIR care induce semnalizarea IFN-b (TRIF). Ulterior, am investigat rolul protaminei în miez și al lipidelor cationice din coajă în stimularea expresiei IFN-b și TNF-a. În cele din urmă, am comparat răspunsurile imune antitumorale de la MVP la șoareci de tip sălbatic și gene knockout.

Beneficiile cistanche tubulosa-Antitumoral

2. Materiale și metode

2.1. Materiale

1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolină (EDOPC) (890704), 1,{2-dioleoil-sn-glicero{-3-fosfatidil-etanolamină (DOPE) (850725) ), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamină-N-[amino(polietilen glicol)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- dioleoil-3-trimetilamoniu-propan (DOTAP) (890890), 1,{2- dioleoil-sn-glicero{-3-fosfocolină (DOPC) (850375) au fost achiziționate de la Avanti Polar Lipids, Inc. ( Birmingham, AL, SUA). Colesterolul (C8667) a fost obținut de la Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, SUA). Reactivii au fost dizolvați în etanol la o concentrație de 2 mg/mL pentru DSPE-PEG2k, 10 mg/mL pentru colesterol și DOPC și 20 mg/mL pentru EDOPC, DOPE și, respectiv, DOTAP. Sulfatul de protamina (P4020) a fost obținut de la Sigma Aldrich. Moleculele de ARNm care codifică ovalbumină (OVA-mARN) (L-7210), eGFP (eGFP mARN) (L{-7201) și luciferaza (Luc-mARN) (L{-7204) au fost achiziționate de la TriLink Biotechnologies (San Diego, CA, SUA). Apa fără RNază (W0805-010) a fost obținută de la GeneDEPOT (Baker, TX, SUA). Agonistul TLR7 imiquimod (tlrimq) și agonistul Sting 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) au fost produse de la Invivogen (San Diego, CA, SUA). Lipofectamine 2000 (11668019) și trusa de analiză Quant-iT™ RiboGreen™ ARN (R11490) au fost achiziționate de la Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, SUA). GM-CSF de șoarece recombinant (554586) a fost achiziționat de la BD Biosciences (San Diego, CA, SUA). 500 Cocktailul inhibitor al transportorului de proteine ​​(00-4980-93) a fost un produs de la Invitrogen. Kitul Cytofix/Cytoperm (AB_2869010) a fost achiziționat de la BD Biosciences. Kitul EasySep™ Mouse T Cell Isolation Kit (19851) a fost obţinut de la STEMCELL Technologies, Inc. (Vancouver, BC, CAN). Următorii anticorpi au fost achiziționați de la BioLegend (San Diego, CA, SUA): anti-CD80-PE-Cy7 (104734), anti-CD86-FITC (105006), anti-CD11b-APC- Cy7 (101226), anti-CD8-BV510 (100752), anti-CD44-APC (103012), anti-CD69-APC (104514) și anti-H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), anti-CD64- PE-Cy7 (139314), anti-B220-APC (103212), anti-MHCII-BV711 (107643) și anti-CD103-PE (121406). Anti-CD40-FITC (553723), anti-LY6C-AF700 (557979) și anti-IFN-g-PE (554412) au fost de la BD Biosciences. OVA257e264-MHCI dextramerPE (JD2163) a fost achiziționat de la ImmuDex (Fairfax, VA, SUA). Trusele ELISA pentru IL{-1b (EM2IL1B) și TNF-a (BMS{607-3) au fost achiziționate de la Invitrogen, iar kiturile ELISA pentru CCL5 (DY478) și IFN-b (DY8234) au fost obținute de la R&D Systems , Inc. (Minneapolis, MN, SUA). Anticorpi pentru analiza Western blot, inclusiv anti-MAVS (4983), anti-STING (13647), anti-TBK1 (3504), antifosfo-TBK1 (5483), anti-b-actin (4970) și anti-GAPDH (5174) au fost achiziționate de la Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, SUA).

Figura 1 Prepararea și caracterizarea particulelor de ARNm. (A) Vedere schematică a preparării particulelor de vaccin. (B) Electroforeza pe gel de agaroză arată că moleculele de ARNm au fost reținute în godeul de încărcare a probei în probe preparate cu ARNm/protamina la un raport de 1:1 până la 1:2. (CeF) Caracterizarea particulelor de vaccin ARNm (MVPs) bazată pe procentul de încapsulare, indicele de polidispersitate, potențialul zeta și dimensiunea. (G) Imagini TEM reprezentative ale particulelor MVP2, bară de scară Z 50 nm. (H) Procentul de expresie eGFP după ce celulele DC2.4 au fost tratate cu eGFP-MVP timp de 16 ore. (I) Imagini fluorescente ale celulelor DC2.4 care exprimă eGFP, bară de scară Z 400 mm. (J) Analiză cantitativă asupra bioluminiscenței în BMDC-uri tratate cu MVP-uri încapsulate cu ARNm care codifică luciferaza timp de 16 ore. (K) Modificări ale viabilității BMDC-urilor tratate cu PBS, vehicul fără ARNm, miez de ARNm/protamină sau MVP2 încapsulat în ARNm. Concentrațiile de tratament au fost echivalente în ARNm. Datele sunt prezentate ca SEM medie (n Z 3). *P <0,05; **P <0,01.

2.2. Liniile celulare și cultura celulară

Linia de celule dendritice murine DC2.4 a fost obținută de la ATCC (Manassas, VA, SUA) și a fost cultivată în RPMI-1640 care conține 10% ser fetal bovin (FBS) și 1% penicilină-streptomicină. Linia celulară de melanom murin B16-OVA a fost achiziționată de la Dr. Kenneth Rock, Dana-Farber Cancer Institute (Boston, MA, SUA). Celulele B16-OVA au fost cultivate în DMEM suplimentat cu 10% FBS și 1% penicilină-streptomicină. Linia celulară de adenocarcinom de colon murin MC38 a fost achiziționată de la ATCC. Celulele au fost modificate cu expresia OVA și au fost cultivate în DMEM cu 10% FBS și 1% penicilină-streptomicină. Cultura celulară a fost menținută la 37 C cu 5% CO2.

cistanche tubulosa-imbunatateste sistemul imunitar

2.3. Prepararea particulelor de vaccin ARNm

Toate particulele de vaccin ARNm au fost preparate folosind instrumentul microfluidic NanoAssemblr Benchtop de la Precision Nanosystems, Inc., (Vancouver, BC, CAN) prin amestecarea fazei organice și a fazei apoase. Pentru a prepara faza organică, EDOPC (20 mg/mL), DOPE (20 mg/mL), colesterolul (10 mg/mL) și bis-DSPE-PEG2k (2 mg/mL) au fost dizolvate în etanol și amestecate la 34°C. :30:35:1 Raport M cu un debit de 9 ml/min. Pentru a prepara miezul ARNm în fază apoasă, ARNm a fost amestecat cu sulfat de protamină la 1:1 (g/g) în instrumentul microfluidic la un debit de 9 ml/min. După 20 de minute de incubare la 20°C, miezul ARNm în fază apoasă a fost amestecat cu faza organică pentru a genera particule de vaccin ARNm. După 20 de minute, suspensia de particule de vaccin a fost transferată într-un filtru ultra centrifugal Amicon (MWCO 30 kDa) și s-a adăugat apă de grad molecular 9-volum pentru a dilua concentrația de etanol de la 25% la 2,5%. Suspensia de particule a fost apoi concentrată prin centrifugare la 2000 g (Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) la 4°C. Un volum egal de 2 PBS a fost adăugat la produsul concentrat pentru a regla presiunea osmotică.

2.4. Test de retardare a gelului

Miezul ARNm/protamină a fost mai întâi analizat prin întârziere pe gel. Pe scurt, miezul de ARNm/protamină care conține 0,5 mg de ARNm a fost încărcat în godeul unui gel de agaroză 1% în 1 soluție de TBE și s-a efectuat electroforeza la 120 V timp de 30 de minute (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Hercules, CA). Benzile de ARN au fost colorate cu Gelred (Biotium, Hayward, CA) și detectate cu un sistem GelDoc (Gel Doc XR+, BioRad Co., Ltd.).

2.5. Caracterizarea particulelor de vaccin ARNm

Distribuția mărimii și potențialul zeta au fost măsurate cu Zetasizer cu împrăștiere dinamică a luminii (Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Westborough, MA, SUA). Rata de încapsulare a fost determinată utilizând un kit de testare ARN Quant-iT™ RiboGreen™. Pe scurt, o probă de particule de vaccin care conține 0,5 mg ARNm a fost diluată cu un tampon TriseEDTA (10 mmol/L TriseHCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,5) cu sau fără 2% Triton-X100 într-un { {10}}plăcuță de puț. După 10 minute de incubare la 37°C, RiboGreen a fost adăugat în fiecare godeu și a fost măsurată intensitatea fluorescentă. Eficiența încapsulării a fost calculată așa cum se arată în Eq. (1): Microscopia electronică de transmisie (TEM) a particulelor de vaccin a fost efectuată urmând o procedură descrisă anterior9.

2.6. Animale

Toate operațiunile cu animale au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor din Houston Methodist Hospital (număr de protocol AUP06200042). Șoarecii au fost găzduiți într-un mediu care a îndeplinit complet standardele de reglementare ale Institutului Național de Sănătate și ale Asociației Americane de Îngrijire a Animalelor de Laborator. Șoarecii C57BL/6J de tip sălbatic și șoarecii modificați genetic, inclusiv șoarecii Tlr7 /, Sting /, Mavs / și Trif / au fost achiziționați de la Jackson Laboratory.

2.7. Generarea de celule dendritice derivate din măduva osoasă murine (BMDC)

Celulele de măduvă osoasă au fost îndepărtate din femur și tibie cu RPMI 1640 complet. Globulele roșii au fost lizate cu un tampon de liză ACK și celulele imature de măduvă osoasă au fost cultivate în RPMI 1640 suplimentat cu 20 ng/mL GM-CSF murin recombinant timp de 10 zile la 37 C cu 5% CO2. Mediul de cultură celulară a fost reîmprospătat în zilele 3, 6 și 8, iar celulele dendritice neaderente au fost colectate în ziua 10.

2.8. Măsurarea citokinelor și chemokinelor

BMDC-urile au fost însămânțate într-o placă de 24-godeuri la o densitate de 5  105 celule/godeu. După 1 oră de sedimentare, celulele au fost tratate cu 1 mg/mL imiquimod, 20 mg/mL 20 30 -cGAMP, (1 mg/mL echivalent ARNm) particule de vaccin sau martori. Mediile de cultură celulară au fost colectate 24 de ore mai târziu, iar nivelurile de TNF-a, CCL5, IFN-b și IL-1b au fost măsurate utilizând kituri de testare imunosorbantă legată de enzime (ELISA) urmând procedurile sugerate de producător.

cistanche plant-creșterea sistemului imunitar

2.9. Analize privind transfecția DC, maturarea DC și stimularea

Pentru a analiza eficiența transfecției DC in vitro, celulele DC2.4 au fost însămânțate la 2,5 105 celule/godeu într-o placă de 24-godeuri. Celulele au fost tratate cu particule încapsulate în ARNm care codifică eGFP sau luciferază la o concentrație finală de 1 mg ARNm/mL. Celulele au fost recoltate 24 de ore mai târziu, spălate cu 2% FBS în soluție de PBS și apoi resuspendate în aceeași soluție înainte de a fi aplicate pentru analiza citometriei în flux cu un citometru în flux BD LSR II (LSR II, BD Biosciences, San Jose, CA) . Pentru a măsura maturarea DC și prezentarea antigenului in vitro, BMDC-urile au fost însămânțate la 2.5  105 celule/godeu într-o placă de 24-godeuri și tratate cu 1 mg/mL OVA-MVP timp de 24 de ore. BMDC-urile au fost colorate timp de 30 de minute cu anticorpi specifici pentru CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80 și CD86 pentru maturarea DC și anti-H{-2Kb (SIINFEKL) pentru prezentarea antigenului. Pentru a determina potența de stimulare in vivo, șoarecii C57BL/6J au fost vaccinați o dată cu 10 mg de OVA-MVP per șoarece în picior și s-au recoltat LN poplitei drenați 24, 48 și următorii markeri de suprafață celulară: CD11c, MHC I, CD11b, B220 , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.

2.10. Analize de citometrie în flux privind activarea și proliferarea celulelor T

Pentru a măsura activarea celulelor T in vivo, șoarecii au fost vaccinați o dată cu 10 mg de OVA-MVP, iar LN-urile poplitee au fost izolate la 24 sau 48 de ore. Celulele T au fost colorate cu următorii anticorpi: CD45, CD3, CD4, CD8 și CD69. Pentru a detecta celulele T specifice antigenului, tumorile, splina și ganglionii limfatici poplitei au fost recoltate la 5 zile după a doua vaccinare. Țesuturile au fost procesate pentru a genera suspensii unicelulare, iar celulele au fost colorate cu anticorpi specifici celulelor T și dextramer OVA257e264-MHCI, urmând instrucțiunile producătorului. Pentru a măsura nivelul intracelular de IFN-g, 2  106 splenocitele sau celulele izolate din LN poplitee și tumori au fost stimulate cu 10 mg/mL peptidă OVA257e264 în mediu RPMI 1640 complet suplimentat cu 55 mmol/L b-mercaptoetanol și 1 inhibitor de transportor de proteine. cocktail timp de 18 ore. Celulele au fost recoltate și colorate cu anticorpi specifici celulelor T. După fixare și permeabilizare cu kitul Cytofix/Cytoperm, celulele au fost colorate cu anticorp anti-IFN-g și aplicate pentru analiză pe un citometru de flux BD LSR II (BD Biosciences). Pentru a măsura proliferarea celulelor T, celulele T au fost izolate din splina șoarecilor transgenici OT-I folosind un kit de izolare a celulelor T de șoarece. Au fost colorați cu 1 mmol/L CFSE în RPMI 1640 care conține 200 mg/mL BSA timp de 10 minute la 37 C. Celulele T marcate cu CFSE au fost spălate de două ori cu 5 volume de RPMI 1640 complet rece. Între timp, BMDC mature au fost tratate cu 2 mg/mL MVP încapsulat în ARNm OVA timp de 24 de ore înainte de izolarea celulelor T. Odată ce celulele T au fost gata, BMDC și celulele T au fost co-cultivate într-un raport de 1:5 (DC:T) timp de 72 de ore. Celulele au fost colectate și colorate cu anticorpi de suprafață pentru celulele T, proliferarea a fost testată folosind un citometru de flux BD LSR II (BD Biosciences) și analizată. Toate rezultatele citometriei în flux au fost analizate cu software-ul FlowJo v10 (Ashland, OH, SUA).

2.11. Urmărirea expresiei proteinelor la șoarecii vii

Șoarecii BALB/c au fost tratați prin injecție intra-footpad cu 10 mg de MVP încapsulat în ARNm Luc. Au fost injectați intraperitoneal cu 30 mg de RediJect D-luciferin per șoarece 6, 12, 24 sau 48 de ore mai târziu, iar bioluminiscența a fost măsurată cu sistemul de imagistică Xenogen IVIS-200 (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA, SUA).

2.12. Testul ELISpot

Plăcile de filtrare IP au fost pre-clătite cu 50 mL de etanol 35% și spălate bine de 3 ori cu PBS înainte ca etanolul să se evapore. Plăcile au fost apoi acoperite cu anticorpi de captare anti-IFN-g la 4°C peste noapte. Plăcile au fost blocate cu mediu complet RPMI 1640 care conține 55 mmol/L b-mercaptoetanol timp de 2 ore la 37°C. Celulele (1  105 splenocite, 1  105 celule din LN poplitee) au fost însămânțate în fiecare godeu și stimulat timp de 36 de ore cu 10 mg/mL peptidă OVA257e264. Mediile au fost aruncate, iar celulele au fost spălate de 4 ori cu PBST (PBS conţinând 0,05% Tween 20) şi de două ori cu PBS. După spălarea finală, a fost adăugat un anticorp de detecție anti-IFN-g și incubat timp de 2 ore la temperatura camerei în întuneric. Plăcile au fost spălate de 4 ori cu PBST și de două ori cu PBS și s-a adăugat avidin-HRP și s-a incubat încă 45 de minute la temperatura camerei în întuneric. În cele din urmă, plăcile au fost spălate cu PBST și PBS din nou așa cum s-a descris mai sus și s-au aplicat 50 mL de substrat AEC și au fost urmărite pentru reacția spot. Când petele au devenit vizibile, reacția a fost oprită prin aruncarea substratului AEC și clătirea acestuia cu apă dublu distilată de 5 ori. După uscare la aer peste noapte, plăcile au fost scanate și analizate folosind CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa ELISpot Analyzer (S5Versa-02- 9038, CTL Inc., Cleveland, OH, SUA).

2.13. Analiza Western blot

Au fost colectate BMDC-uri derivate de la șoareci de tip sălbatic, Mavs KO sau Sting KO, iar celulele au fost lizate în tampon de liză celulară RIPA suplimentat cu inhibitori de protează și fosfatază. Concentrația de proteine ​​în lizat de celule a fost măsurată cu un kit de analiză a proteinei BCA. Probele de proteine ​​au fost separate cu electroforeză în gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE) și transferate pe o membrană de difluorura de poliviniliden (PVDF). Expresia MAVS și STING a fost detectată după ce membrana a fost incubată cu un anticorp anti-MAVS sau anti-STING la diluție 1:2000 urmată de imunodetecție cu SuperSignal West Pico și substrat Femto Chemiluminescent. Pentru a măsura activarea căii STING, BMDC-urile derivate de la șoareci de tip sălbatic au fost tratate cu vehicul sau MVP încapsulat în ARNm OVA la concentrația indicată timp de 2 ore. Celulele au fost lizate și efectuate pentru analiza Western blot cu anticorpi anti-TBK1 și antifosfo-TBK1 la diluție 1:2000.

2.14. Test antitumoral

Modelele de tumori murine au fost generate prin inocularea 2  105 celule B16-celule de melanom OVA sau 5  105 MC38-celule OVA per șoarece subcutanat în flancul stâng de la 6 la {{5} }șoareci femele C57BL/6J în vârstă de o săptămână. Șoarecii au fost alocați aleatoriu în grupuri de tratament și tratați de două ori, separați de 7 zile, cu 10 mg de OVA MVP sau martori în picior. Creșterea tumorii a fost monitorizată la fiecare 2 zile. Volumul tumorii a fost calculat conform Eq. (2):

Șoarecii au fost eutanasiați la 5 zile după a doua vaccinare și a fost înregistrată greutatea țesuturilor tumorale.

2.15. analize statistice

Toate rezultatele sunt prezentate ca SEM mediu. Statisticile au fost evaluate cu un test ANOVA unidirecțional folosind corecția lui Tukey pentru compararea cu mai multe grupuri și un test t cu două cozi nepereche pentru compararea cu două grupuri. Datele au fost analizate cu software-ul GraphPad Prism v8.0.2. P < 0.{{10}}5 a fost considerat semnificativ statistic (*P < 0.{05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001).

3. Rezultate

3.1. MVP mediază expresia robustă a ARNm în celulele dendritice (DC)

Am pregătit particule de vaccin miez-înveliș într-o abordare micro-fluidică în două etape (Fig. 1A) și am evaluat sistematic componentele individuale din nanoparticulă pentru a asambla o particulă de vaccin cu stabilitate ridicată, absorbție celulară ridicată și potențial de expresie ridicat în DC. Electroforeza pe gel a arătat că un miez stabil de ARNm ar putea fi format odată ce raportul ARNm-protamină a fost la 1 sau mai jos (Fig. 1B). Folosind ARNm care codifică eGFP ca marker surogat, am constatat că o compoziție de lipide la un raport molar de 34% EDOPC/30% DOPE/35% colesterol/1% DSPEPEG2k a oferit o rată ideală de încapsulare și cea mai bună eficiență de exprimare (Tabelul 1, Informații justificative Fig. S1AeS1D). Modificarea raportului de încărcare nu a schimbat semnificativ viteza de încapsulare, indicele de polidispersitate sau încărcarea de suprafață a particulelor (Tabelul 2, Fig. 1CeE); cu toate acestea, dimensiunea particulelor rezultate a fost între 70 și 80 nm în diametru când raportul a fost între 12 și 16, comparativ cu un diametru de 120e130 nm odată ce raportul a căzut în afara intervalului (Fig. 1F și G). Cea mai bună expresie a fost detectată în celulele DC2.4 tratate cu MVP2 care au avut un raport de încărcare de 12 (Fig. 1H și I). Un model similar a fost observat atunci când particulele au fost preparate cu ARNm care codifică luciferaza și a fost detectată expresia dependentă de doză (Fig. 1J). Particulele încapsulate în ARNm au demonstrat o stabilitate de dorit, deoarece nu și-au pierdut activitatea după liofilizare sau îngheț-dezgheț (Fig. S1E și S1F). În plus, nu a existat nicio citotoxicitate după ce celulele dendritice derivate din măduva osoasă (BMDC) au fost tratate numai cu miezul ARNm, o particulă vehicul preparată fără molecule de ARNm sau MVP2 care conține ARNm (Fig. 1K). Astfel, MVP2 a afișat cel mai bun potențial de exprimare. A fost folosit pentru toate experimentele ulterioare din studiu și etichetat ca MVP în restul textului. Particulele de MVP ar putea livra eficient molecule de ARNm in vivo și nu a existat nicio toxicitate detectabilă din MVP-ul încapsulat în ARNm pe baza modificărilor greutății corporale (Fig. S1GeS1I).

3.2. MVP induce eficient prezentarea antigenului și activarea celulelor T in vitro și in vivo

Am pregătit miezul ARNm, vehiculul fără ARNm și MVP încapsulat ARNm OVA și le-am aplicat pentru a testa maturarea DC și prezentarea antigenului (Fig. 2A). BMDC-urile tratate cu MVP au prezentat supraexprimarea dependentă de doză a markerilor de maturare DC, inclusiv CD40, CD80 și CD86 (Fig. 2BeD). Tratamentul fie cu vehiculul fără ARNm, fie cu MVP încapsulat în ARNm a declanșat supraexprimarea MHC I (Fig. 2E), indicând faptul că efectul a fost asociat cu vehiculul mai degrabă decât cu complexul ARNm. În plus, tratamentul cu MVP a dus la afișarea suprafeței celulare a complexului epitop antigen OVA257e264-MHC I (SIINFEKL-MHC I), care a fost detectat cu un anticorp anti-SIINFEKL-MHCI (Fig. 2F), demonstrând procesarea eficientă a antigenului și prezentarea de către BMDC. . În plus, co-incubarea BMDC-urilor tratate cu MVP cu B3Z, o linie de celule T CD8+ care a recunoscut în mod specific epitopul OVA257e264 sau celulele T izolate din splina unui șoarece OT-I care a exprimat o celulă T specifică OVA257e264- receptor, a declanșat secreția IL-2, un rezultat neobservat în celulele T coincubate cu DC tratate numai cu vehicul sau numai cu nucleul ARNm/protamină (Fig. 2G). Analiza citometriei în flux a detectat 32,5% celule T CD8+ proliferative după co-incubare cu MVP (Fig. 2H și I). Particulele MVP încapsulate în ARNm OVA au fost, de asemenea, aplicate pentru a trata șoarecii prin injecție intradermică. Examinarea celulelor din ganglionii limfatici de drenaj a evidențiat o creștere constantă a exprimării CD86 atât în ​​rândul DC clasice (CD8 + DC, CD11b + DC, CD103 + DC) cât și al DC plasmacitoide (pDC) în primele 48 de ore, indicând stimularea DC maturare (Fig. 2J). Tratamentul a promovat, de asemenea, îmbogățirea celulelor T CD8+ în ganglionii limfatici, cu o creștere semnificativă a populației de celule T CD69+CD8+ (Fig. 2K și L), indicând activarea celulelor T prin tratament. Pentru a determina activarea celulelor T, am colectat celule în ganglionii limfatici de drenaj la 3, 5 sau 7 zile după tratamentul cu MVP și am efectuat analize ELISpot după ce celulele au fost provocate cu peptida antigen OVA257e264 (Informații de sprijin Fig. S2). Tratamentul cu MVP a declanșat un salt mare în celulele secretoare de IFN-g în timpul timpului, cu o activitate de vârf în ziua 5 (Fig. 2M). Aceste rezultate au demonstrat stimularea DC robustă, prezentarea antigenului și activarea celulelor T după tratamentul cu MVP.

Tabelul 1 Compoziția nanoparticulelor încapsulate cu ARNm care codifică eGFP.

masa 2Compoziția lipidelor și raportul de încărcare al MVPparticule.

3.3. MVP provoacă imunitate anti-tumorală puternică în modelele murine de tumoră colorectală și melanom

MVP a fost aplicat pentru a trata șoarecii cu cancer de colon MC38 și melanom B16. În ambele modele, tratamentul cu ARNm OVA încapsulat MVP de două ori a blocat complet creșterea tumorii subcutanat; în comparație, tratamentul cu eGFP mRNA încapsulat sau vehicul în monoterapie nu a avut niciun efect inhibitor detectabil asupra creșterii tumorii (Fig. 3AeD, Informații de sprijin Fig. S3). În conformitate cu modelul unei schimbări CD4 la CD8 în ganglionii limfatici (Fig. 2), am observat o creștere a raportului celulelor T CD8+/CD4+ în tumorile de la șoareci tratați cu MVP încapsulat ARNm OVA (Fig. 3E). În plus, am detectat niveluri crescute în celulele T IFN-g+CD8+ în spline, ganglioni limfatici și tumori la șoareci tratați cu MVP încapsulat în ARNm OVA, dar nu cu vehicul singur sau MVP încapsulat în ARNm GFP (Fig. 3FeH, Informații de sprijin Fig. S4). Mai mult, a existat o creștere semnificativă a celulelor T CD8+ OVA257e264-MHCI dextramer pozitive în tumorile din grupul de tratament MVP încapsulat în ARNm OVA, indicând proliferarea celulelor T CD8+ antigen-specifice (Fig. 3I). Testul ELISpot cu celule izolate din spline și ganglioni limfatici a oferit un sprijin suplimentar pentru activarea celulelor T (Fig. 3JeM).

3.4. MVP stimulează răspunsurile imune înnăscute prin activarea semnalizării dependente de STING

Am aplicat miezul ARNm, vehiculul fără ARNm și MVP încapsulat ARNm pentru a trata BMDC-urile pentru a identifica factorii și căile cheie responsabile pentru stimularea IFN-ului de tip I și a expresiei citokinelor inflamatorii. Interesant, MVP a fost la fel de puternic ca agonistul Tlr7 imiquimod în declanșarea secreției de IFN-b, iar vehiculul singur a arătat, de asemenea, activitate în promovarea secreției de IFN-b, deși potența sa nu a fost la fel de mare ca MVP; cu toate acestea, miezul ARNm singur a fost ineficient în stimularea secreției de IFN-b (Fig. 4A). Rezultatul a implicat că atât ARNm, cât și componentele din vehicul au fost necesare pentru a maximiza expresia IFN-b. Între timp, imiquimod și vehiculul au prezentat o activitate similară în promovarea expresiei TNF-a și IL-1b, în ​​timp ce MVP a fost mult mai puternic decât oricare dintre ele (Fig. 4B și C). Expresia CCL5, o citokină asociată în mod obișnuit cu factorii de reglare a NF-kB și IFN, a fost stimulată în mod egal în celulele tratate cu imiquimod, numai vehicul sau MVP (Fig. 4D). TLR7, MAVS, STING și TRIF sunt factori cheie în căile majore de transducție a semnalului care mediază răspunsurile celulare la ARN-ul viral și ADN-ul deteriorat28e30. Am generat BMDC de la șoareci cu knockout (KO) al genei Tlr7, Mavs, Sting sau Trif și am tratat celule cu miez de ARNm, vehicul fără ARNm sau MVP încapsulat cu ARNm pentru a examina expresia IFN-b și TNF-a.

Figura 2 Stimularea răspunsurilor imune de către MVP. (A) Vedere schematică a miezului mARN/protamină, vehicul fără mARN și MVP complet. (BeD) Maturarea BMDC-urilor după ce au fost tratate cu OVA-MVP timp de 24 de ore. (E și F) Expresia MHC I și complexul epitop al antigenului OVA257e264-MHC I în BMDC după ce au fost tratate cu OVA-MVP timp de 24 de ore. (G) Nivelul IL-2 din BMDC-urile tratate co-incubate cu celule T B3Z sau OT-I. (H și I) Analiza citometriei în flux a celulelor T proliferative. Sunt prezentate cromatogramele reprezentative ale celulelor T. (J) Maturarea DC după tratamentul MVP in vivo. Șoarecii C57BL/6J au fost tratați cu OVA-MVP și au fost analizate DC-urile din ganglionii limfatici poplitei. (K și L) Analiza populației de celule T. Șoarecii C57BL/6J au fost tratați cu vehicul sau OVA-MVP, iar celulele T din ganglionii limfatici poplitei au fost analizate cu citometrie în flux. (M) Testul ELISpot. Șoarecii C57BL/6J au fost tratați cu OVA-MVP și ganglionii limfatici au fost colectați la momentele de timp indicate. Celulele izolate au fost aplicate pentru măsurarea celulelor care exprimă IFN-g. Datele sunt prezentate ca SEM medie (n Z 3). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P <0,005; ****P < 0,001; ns, nu este semnificativ.

Figura 3 Activitatea antitumorală de la MVP. (A) Inhibarea creșterii tumorii MC38-OVA. Șoarecii femele C57BL/6J au fost inoculați subcutanat cu 5  105 MC38-celule tumorale OVA/șoarece în ziua 0 și tratați cu control PBS, control vehicul, GFP-MVP sau OVA-MVP pe Zilele 3 și 10. (B) Inhibarea creșterii tumorii B16-OVA. Șoarecii femele C57BL/6J au fost inoculați subcutanat cu 2  105 B{16-celule tumorale OVA/șoarece în ziua 0 și tratați cu control PBS, control vehicul, GFP-MVP sau OVA-MVP în zilele 3 și 10. (C și D) Imaginea și greutatea tumorilor B16-OVA în ziua 17. (E) Populația de celule T în tumorile șoarecilor post-tratament. (FeH) Celulele T IFN-gþCD8þ în spline, ganglioni limfatici (LN) și tumori ale șoarecilor post-tratament. (I) celule T CD8+ specifice OVA în tumorile șoarecilor post-tratament. (JeM) Imagini și analiza cantitativă a testului ELISpot a celulelor splenice și LN de la șoareci post-tratament. Datele sunt prezentate ca SEM medie (n Z 5). *P < 0.05; **P <0,01; ***P <0,005; ****P < 0,001.

Starea KO a Mavs și Sting în BMDC a fost confirmată cu analiza Western blot (Informații de sprijin Fig. S5A). În mod surprinzător, Sting KO a eliminat activitatea stimulatoare asupra secreției de IFN-b atât din vehicul singur, cât și din MVP (Fig. 4E), indicând faptul că MVP a activat expresia IFN de tip I prin STING. Pentru a susține noțiunea, am detectat fosforilarea kinazei 1 de legare a rezervorului (TBK1) (Fig. S5B), o kinază care este asociată în mod obișnuit cu activitatea STING31. În plus, această cale a fost independentă de semnalizarea TLR7, deoarece expresia IFN-b nu a fost compromisă în celulele tratate cu imiquimod (Fig. 4E). În comparație, Trif sau Mavs KO au avut un impact minim asupra expresiei IFN-b promovată de MVP. După cum era de așteptat, imiquimod a fost ineficient în stimularea secreției de IFN-b în BMDC-uri derivate din Tlr7 KO; cu toate acestea, Tlr7 KO a avut un impact negativ asupra efectului stimulator al MVP (Fig. 4E). Interesant, a fost observat un profil diferit asupra secreției de TNF-a din aceleași tratamente. Knockout de Sting, Trif sau Tlr7 nu a avut un impact minim asupra expresiei citokinei stimulate de MVP. Knockout de Mavs, pe de altă parte, a redus dramatic nivelurile de TNF-a în celulele tratate fie cu vehicul singur, fie cu MVP (Fig. 4F). Rezultatul indică faptul că MAVS este un regulator cheie al expresiei TNF-a în DC la tratamentul cu MVP.

3.5. MVP stimulează căile STING și MAVS pentru a promova secreția de IFN-I și citokine inflamatorii

Pentru a identifica componentele din vehicul responsabile de stimularea semnalizării STING și MAVS, am pregătit vehicule și MVP-uri prin înlocuirea sau omiterea componentelor cheie și le-am aplicat pentru a trata BMDC. Agonistul Sting GMP-AMP ciclic (cGAMP) a servit ca control pozitiv în stimularea secreției de IFN-b. Înlocuirea lipidei cationice EDOPC din vehicul cu o altă lipide încărcată pozitiv, DOTAP, a eliminat complet secreția de IFN-b. În comparație, efectul stimulator al vehiculului și MVP a fost reținut cu sau fără protamina și o astfel de activitate stimulatoare a fost dependentă de o genă Sting intactă (Fig. 4G). Interesant, BMDC-urile tratate cu componente individuale ale învelișului lipidic, inclusiv EDOPC, nu au promovat secreția puternică de IFN-b (Informații de sprijin Fig. S6). Astfel, EDOPC a fost esențial pentru activarea STING, iar activitatea sa este dependentă de formarea unei nanoparticule lipidice (adică vehicul sau MVP). Vehiculul și MVP preparate cu EDOPC sau DOTAP au fost, de asemenea, aplicate pentru a trata BMDCS derivate de la șoareci de tip sălbatic și Mavs KO și s-au determinat nivelurile de TNF în mediile de creștere celulară. După cum era de așteptat, înlocuirea EDOPC cu DOTAP sau DOPC a eliminat efortul de stimulare din vehicul și MVP. În plus, nivelul TNF-a a fost redus semnificativ în celulele Mavs KO în comparație cu celulele de tip sălbatic, dar nu a scăzut (Fig. 4H), indicând factori suplimentari care ar putea fi implicați în mediarea expresiei TNF-a stimulată de MVP.

3.6. Calea STING este esențială pentru răspunsurile imune anti-tumorale mediate de MVP

Atât șoarecii de tip sălbatic, cât și șoarecii knockout au fost tratați cu MVP încapsulat ARNm OVA și au fost examinate maturarea DC și proliferarea celulelor T. Sting KO a redus semnificativ procentul de celule CD80+ și CD86+ și celulele T CD69+ (Fig. 5AeD). Testul ELISpot a evidențiat o reducere semnificativă a celulelor producătoare de IFN-g în spline și ganglioni limfatici de la șoarecii Sting KO în comparație cu șoarecii de tip sălbatic după ce au fost tratați cu aceeași doză de MVP (Fig. 5EeH). Impactul Mavs KO a fost minim, deoarece nu a fost monitorizată nicio diferență asupra celulelor T de memorie CD44+CD8+, celulelor T CD8+ OVA257e264-MHCI dextramer pozitive sau numărul de celule producătoare de IFN-g în ganglionii limfatici în comparație cu celulele sălbatice. soareci de tip (Fig. 5IeL). Rezultatul întărește ideea că factori suplimentari, în afară de MAVS, pot fi implicați în exprimarea citokinelor inflamatorii stimulate de MVP. Atât șoarecii de tip sălbatic, cât și Sting KO au fost aplicați pentru a inocula tumorile B16-OVA, iar șoarecii au fost tratați cu control PBS sau MVP încapsulat în ARNm OVA. Analiza citometriei în flux pe probele de ganglioni limfatici și tumori colectate de la șoarecii vaccinați a relevat un număr semnificativ redus de celule T CD8+ producătoare de IFN-g la șoarecii Sting KO (Fig. 6A și B). Ca rezultat, creșterea tumorii a fost complet inhibată la șoarecii de tip sălbatic tratați cu MVP, în comparație cu inhibarea doar parțială la șoarecii Sting KO (Fig. 6C).

cistanche plant-creșterea sistemului imunitar

Faceți clic aici pentru a vedea produsele Cistanche Enhance Immunity

【Cereți mai multe】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

4. Discutie

În studiul actual, am examinat sistematic rolurile funcționale ale componentelor individuale în MVP privind stimularea răspunsurilor imune anti-tumorale. Studiul nostru pe celule a demonstrat în mod clar că atât moleculele de ARNm, cât și vehiculul fără ARN din MVP sunt necesare pentru activitatea sa deplină în promovarea expresiei IFN-b și a unui număr de citokine inflamatorii, inclusiv IL-1b și TNF. -a in celulele dendritice. S-a demonstrat că astfel de citokine joacă roluri esențiale în activarea celulelor dendritice și imunitatea antitumorală mediată de vaccin20. Studiul nostru a dezvăluit, de asemenea, că stimularea producției de citokine depinde de o serie de căi cheie de transducție a semnalului implicate în detecția imună înnăscută, inclusiv cele mediate de STING și MAVS. În timp ce STING este esențial pentru exprimarea IFN-b, MAVS este implicat în principal în reglarea expresiei TNF-a (Fig. 6D). Semnificația semnalizării STING asupra imunității anti-tumorale mediată de MVP este demonstrată în continuare prin activitatea redusă a celulelor T și, în consecință, inhibarea creșterii tumorii compromisă la șoarecii Sting KO. Acest rezultat este în conformitate cu alte rapoarte conform cărora activarea STING determină imunitatea antitumorală mediată de celulele T citotoxice32. MAVS este un intermediar cheie în semnalizarea receptorului RIG-I (RLR) ca răspuns la infecția virală. Activarea acestei căi duce la o cascadă de răspunsuri inflamatorii33. Este intrigant faptul că activitatea celulelor T nu este compromisă la șoarecii Mavs KO, având în vedere că semnalizarea MAVS joacă în mod clar un rol important în reglarea expresiei citokinelor inflamatorii, inclusiv TNF-a. Un posibil motiv este că stimularea unor astfel de citokine de către MVP este mediată de căi multiple, iar întreruperea căii MAVS nu reduce expresia citokinelor la un nivel suficient de scăzut pentru a provoca un impact semnificativ. Alternativ, pierderea semnalizării MAVS este compensată de celelalte căi. Sunt necesare studii suplimentare pentru a identifica aceste căi pentru a înțelege în continuare mecanismul de acțiune al vaccinului MVP. Deși TLR7 a fost în mod tradițional asociat cu ARNm terapeutic21, semnalizarea TLR7 nu pare să joace un rol major în mediarea activității MVP. Aplicarea moleculelor de ARNm complet metilate în studiul curent poate să fi făcut ca semnalizarea TLR7 să fie mai puțin relevantă. A fost bine demonstrat că metilarea ARN suprimă recunoașterea de către TLR23. TRIF este o proteină adaptoare cheie pentru semnalizarea TLR3/7/828. Knockout of Trif nu afectează nici activitatea MVP, întărind ideea că TLR-urile de mai sus, inclusiv TLR7, nu joacă un rol major în mediarea răspunsurilor celulare la MVP. Mai mulți agoniști Sting au fost aplicați în dezvoltarea vaccinului împotriva cancerului, inclusiv dinucleotide ciclice și compuși moleculari mici și mari34e37. Astfel de agonişti Sting trebuie adăugaţi ca adjuvanţi externi în timpul preparării vaccinului, ceea ce adaugă un alt strat de complexitate compoziţiei vaccinului. În plus, agonistul Sting adăugat extern poate provoca efecte adverse nedorite odată ce se separă de complexul ARNm. În comparație, MVP-ul nostru servește ca auto-adjuvant și funcționează în contextul unui vaccin împotriva cancerului, deoarece niciuna dintre componentele individuale ale vaccinului, inclusiv EDOPC, nu poate promova expresia citokinelor. Interesant, fosfolipidul cationic EDOPC nu poate fi înlocuit cu DOTAP non-fosfolipid care este, de asemenea, încărcat pozitiv. Este intrigant să speculăm mecanismul potențial al diferenței dintre aceste două lipide cationice. Cu toate acestea, s-a documentat că alte proprietăți ale unei componente ale unei molecule de lipide, cum ar fi hidrofobicitatea, pot avea un impact profund asupra funcției generale a unei nanoparticule și eficacității sale de livrare pentru acizii nucleici38. Astfel, trebuie avută grijă în selectarea moleculelor adecvate pentru a prepara un vaccin ARNm complet funcțional. În rezumat, am dezvoltat un vaccin terapeutic împotriva cancerului bazat pe ARNm și am atribuit componente individuale ale vaccinului cu funcționalitatea lor. Mecanismul său de acțiune este destul de diferit de alte platforme de ARNm utilizate pentru intervenții profilactice și terapeutice. Cunoștințele derivate din studiul actual vor ghida cu siguranță dezvoltarea viitoare a unor terapii suplimentare ARNm.

Figura 4 Promovarea răspunsurilor imune înnăscute de către MVP. (AeD) BMDC tratate cu 1 mg/mL imiquimod, 1 mg/mL nucleu echivalent ARNm, vehicul sau MVP timp de 24 de ore. Nivelurile de IFN-b, TNF-a, IL-1b și CCL5 au fost măsurate cu ELISA. (E și F) Expresia IFN-b și TNF-a a BMDC-urilor derivate de la șoareci de tip sălbatic și knockout de genă (KO). BMDC-urile au fost tratate cu reactivii indicați timp de 24 de ore. IFN-b și TNF-a au fost măsurate cu ELISA. (G) IFN-b în BMDC-uri derivate de la șoareci de tip sălbatic și Sting knockout. BMDC-urile au fost tratate cu 20 mg/mL cGAMP, 1 mg/mL nucleu echivalent ARNm, vehicul sau MVP timp de 24 de ore. Vehicul (DOTAP): pregătit prin înlocuirea EDOPC cu DOTAP; vehicul (fără protamină): preparat prin omiterea protaminei. ND: nedetectabil. (H) TNF-a în BMDC-uri derivate de la șoareci de tip sălbatic și Mavs knockout. BMDC-urile au fost tratate cu nucleu, vehicul sau MVP echivalent ARNm de 1 mg/mL timp de 24 de ore. Vehicul (DOTAP): pregătit prin înlocuirea EDOPC cu DOTAP; vehicul (DOPC): pregătit prin înlocuirea EDOPC cu DOPC. Datele sunt prezentate ca SEM medie (n Z 3). ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, nu este semnificativ.

Figura 5 Răspunsuri imune antitumorale la șoarecii knockout Sting și Mavs. (AeD) Scăderea activării celulelor DC și T la șoarecii knockout Sting. Atât șoarecii de tip sălbatic, cât și șoarecii knockout Sting au fost tratați cu MVP încapsulat în ARNm OVA, iar ganglionii limfatici au fost colectați 48 de ore mai târziu pentru măsurarea celulelor DC și T. (EeH) Reducerea celulelor T care exprimă IFN-g în splină și ganglionii limfatici de la șoarecii knockout Sting. Sunt prezentate atât imagini cu pete, cât și analize cantitative. (IeL) Niciun impact asupra activității celulelor T la șoarecii knockout Mavs. Atât șoarecii de tip sălbatic, cât și șoarecii knockout Mavs au fost tratați cu control PBS sau MVP încapsulat în ARNm OVA, iar ganglionii limfatici au fost colectați 48 de ore mai târziu pentru măsurarea celulelor T cu memorie CD44+CD8+ (I), OVA257e264-MHCI CD8+ dextramer pozitiv celule T (J) și numărul de celule producătoare de IFN-g (K și L). Datele sunt prezentate ca SEM medie (n Z 3 sau 5). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P <0,005; ****P < 0,001; ns, nu este semnificativ.

Figura 6 Imunitatea antitumorală dependentă de înțepături. (A și B) Analiza celulelor T care exprimă IFN-g în ganglionii limfatici și țesuturile tumorale după ce șoarecii de tip sălbatic și Sting knockout purtând tumori B16-OVA au fost tratați cu MVP încapsulat în ARNm OVA. Șoarecii au fost tratați în zilele 3 și 10, iar ganglionii limfatici și tumorile au fost colectate în ziua 15. Celulele unice au fost analizate cu citometrie în flux. (C) Inhibarea creșterii tumorii la șoarecii de tip sălbatic și Sting knockout. Șoarecii au fost tratați cu control PBS sau MVP în zilele 3 și 10. Datele sunt prezentate ca SEM medie (n Z 5). *P <0,05; ****P < 0,001; ns, nu este semnificativ. (D) Vedere schematică asupra stimulării MVP a căilor de transducție a semnalului care conduc la producerea de citokine în DC. În timp ce stimularea expresiei IFN-b este mediată exclusiv de STING, există mai mulți factori, inclusiv MAVS, care mediază expresia TNF-a și IL-1b.

Referințe

1. El Sahly HM, Baden LR, Essink B, Doblecki-Lewis S, Martin JM, Anderson EJ și colab. Eficacitatea vaccinului ARNm-1273 SARS-CoV{-2 la finalizarea fazei orb. N Engl J Med 2021;385:1774e85.

2. Moreira Jr ED, Kitchin N, Xu X, Dychter SS, Lockhart S, Gurtman A, et al. Siguranța și eficacitatea unei a treia doze de vaccin BNT162b2 Covid-19. N Engl J Med 2022;386:1910e21.

. Dowdy SF. Depășirea barierelor celulare pentru terapia ARN. Nat Biotechnol 2017;35:222e9.

4. Cullis PR, Hope MJ. Sisteme de nanoparticule lipidice pentru a permite terapii genetice. Mol Ther 2017;25:1467e75.

5. Persano S, Guevara ML, Li Z, Mai J, Ferrari M, Pompa PP, et al. Lipopolyplex potențează imunitatea antitumorală a vaccinării pe bază de ARNm. Biomateriale 2017;125:81e9.

6. Wang Y, Su HH, Yang Y, Hu Y, Zhang L, Blancafort P, et al. Livrarea sistemică a ARNm modificat care codifică virusul herpes simplex 1 timidin kinaza pentru terapia genică țintită a cancerului. Mol Ther 2013;21:358e67.

7. Kranz LM, Diken M, Haas H, Kreiter S, Loquai C, Reuter KC și colab. Livrarea sistemică a ARN-ului către celulele dendritice exploatează apărarea antivirală pentru imunoterapia cancerului. Natura 2016;534:396e401.

8. Meng C, Chen Z, Mai J, Shi Q, Tian S, Hinkle L și colab. Vaccin ARNm care imita virusul pentru tratamentul cancerului. Adv Ther 2021;4:2100144.

9. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. vaccinuri mARN noua eră în vaccinologie. Nat Rev Drug Discov 2018;17:261e79.

10. Rurik JG, Tombacz I, Yadegari A, Mendez Fernandez PO, Shewale SV, Li L, et al. Celulele CAR T sunt produse in vivo pentru a trata leziunile cardiace. Science 2022;375:91e6.

11. Esteban I, Pastor-Quinones C, Usero L, Plana M, Garcia F, Leal L. În era vaccinurilor ARNm, Există vreo speranță pentru o vindecare funcțională HIV? Viruși 2021;13:501.

12. Krienke C, Kolb L, Diken E, Streuber M, Kirchhoff S, Bukur T, et al. Un vaccin ARNm neinflamator pentru tratamentul encefalomielitei autoimune experimentale. Science 2021;371:145e53.

13. Miao L, Zhang Y, Huang L. vaccin ARNm pentru imunoterapia cancerului. Mol Cancer 2021;20:41.

14. Van Hoecke L, Verbeke R, Dewitte H, Lentacker I, Vermaelen K, Breckpot K și colab. ARNm în imunoterapia cancerului: dincolo de o sursă de antigen. Mol Cancer 2021;20:48.

15. Sahin U, Derhovanessian E, Miller M, Kloke BP, Simon P, Lower M, et al. Vaccinurile personalizate cu mutanom ARN mobilizează imunitatea terapeutică polispecifică împotriva cancerului. Natura 2017;547:222e6.

16. Sahin U, Oehm P, Derhovanessian E, Jabulowsky RA, Vormehr M, Gold M și colab. Un vaccin ARN stimulează imunitatea în melanomul tratat cu inhibitori ai punctelor de control. Natura 2020;585:107e12.

17. Hilf N, Kuttruff-Coqui S, Frenzel K, Bukur V, Stevanovic S, Gouttefangeas C, et al. Test de vaccinare personalizat activ pentru glioblastom nou diagnosticat. Natura 2019;565:240e5.

18. Carreno BM, Magrini V, Becker-Hapak M, Kaabinejadian S, Hundal J, Petti AA, et al. Imunoterapia cancerului. Un vaccin cu celule dendritice mărește lățimea și diversitatea celulelor T specifice neoantigenului melanomului. Science 2015;348:803e8.

19. Keskin DB, Anandappa AJ, Sun J, Tirosh I, Mathewson ND, Li S și colab. Vaccinul cu neoantigen generează răspunsuri intratumorale ale celulelor T în studiul cu glioblastom de fază Ib. Natura 2019;565:234e9.

20. Mai J, Li Z, Xia X, Zhang J, Li J, Liu H, et al. Activarea sinergică a imunității antitumorale printr-un vaccin terapeutic sub formă de particule. Adv Sci 2021;8:2100166.

21. Kobiyama K, Ishii KJ. Înțelegerea înnăscută a adjuvantității vaccinului ARNm. Nat Immunol 2022;23:474e6.

22. Fotin-Mleczek M, Duchardt KM, Lorenz C, Pfeiffer R, Ojkic-Zrna S, Probst J, et al. Vaccinurile pe bază de ARN mesager cu activitate dublă induc răspunsuri imune adaptative echilibrate dependente de TLR-7-și asigură activitate antitumorală. J Immunother 2011;34:1e15.

23. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suprimarea recunoașterii ARN de către receptorii Toll-like: impactul modificării nucleozidelor și originea evolutivă a ARN-ului. Imunitatea 2005;23:165e75.

24. Tahtinen S, Tong AJ, Himmels P, Oh J, Paler-Martinez A, Kim L, et al. IL-1 și IL-1ra sunt regulatori cheie ai răspunsului inflamator la vaccinurile ARN. Nat Immunol 2022;23:532e42.

25. Li C, Lee A, Grigoryan L, Arunachalam PS, Scott MKD, Trisal M și colab. Mecanisme de imunitate înnăscută și adaptativă la vaccinul PfizerBioNTech BNT162b2. Nat Immunol 2022;23:543e55.

26. LoPresti ST, Arral ML, Chaudhary N, Whitehead KA. Înlocuirea lipidelor auxiliare cu alternative încărcate în nanoparticulele lipidice facilitează livrarea țintită a ARNm în splină și plămâni. J Control Release 2022;345:819e31.

27. Charbe NB, Amnerkar ND, Ramesh B, Tambuwala MM, Bakshi HA, Aljabali AAA, et al. ARN mic de interferență pentru tratamentul cancerului: depășirea obstacolelor în livrare. Acta Pharm Sin B 2020;10:2075e109.

28. Fuertes MB, Woo SR, Burnett B, Fu YX, Gajewski TF. Răspunsul la interferon de tip I și percepția imună înnăscută a cancerului. Trends Immunol 2013;34:67e73.

29. Harding SM, Benci JL, Irianto J, Discher DE, Minn AJ, Greenberg RA. Progresia mitotică după deteriorarea ADN-ului permite recunoașterea modelului în micronuclei. Natura 2017;548:466e70.

30. Hartlova A, Erttmann SF, Raffi FA, Schmalz AM, Resch U, Anugula S, et al. Deteriorarea ADN-ului activează sistemul de interferon de tip I prin intermediul senzorului ADN citosolic STING pentru a promova imunitatea înnăscută antimicrobiană. Imunitatea 2015;42:332e43.

31. Zhang Z, Yuan B, Bao M, Lu N, Kim T, Liu YJ. Helicaza DDX41 detectează ADN-ul intracelular mediat de adaptorul STING în celulele dendritice. Nat Immunol 2011;12:959e65.

32. Sivick KE, Desbien AL, Glickman LH, Reiner GL, Corrales L, Surh NH, et al. Amploarea activării terapeutice STING determină imunitatea antitumorală mediată de celulele T CD8+. Cell Rep 2018;25: 3074e3085 e5.

33. Reikine S, Nguyen JB, Modis Y. Recunoașterea modelelor și mecanismele de semnalizare ale RIG-I și MDA5. Front Immunol 2014;5:342.

34. Fu J, Kanne DB, Leong M, Glickman LH, McWhirter SM, Lemmens E, et al. Vaccinurile împotriva cancerului formulate cu agonişti STING pot vindeca tumorile stabilite rezistente la blocarea PD-1. Sci Transl Med 2015;7: 283ra52.

35. Corrales L, Glickman LH, McWhirter SM, Kanne DB, Sivick KE, Katibah GE, et al. Activarea directă a STING în micromediul tumoral duce la regresie și imunitate tumorală puternică și sistemică. Cell Rep 2015;11:1018e30.

36. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J și colab. Livrarea vaccinurilor ARNm cu lipide heterociclice crește eficiența antitumorală prin activarea celulelor imune mediată de STING. Nat Biotechnol 2019;37:1174e85.

37. Luo M, Wang H, Wang Z, Cai H, Lu Z, Li Y și colab. Un nano vaccin care activează STING pentru imunoterapie împotriva cancerului. Nat Nanotechnol 2017;12:648e54.

38. Wang L, Koynova R, Parikh H, MacDonald RC. Activitatea de transfecție a amestecurilor binare de derivați cationici de fosfatidilcolină o-substituiți: miezul hidrofob modulează puternic proprietățile fizice și eficacitatea furnizării ADN-ului. Biophys J 2006;91:3692e706.