Efectele anti-imbatranire de Leontopodium Alpinum (Edelweiss) Calus Cultura Extract prin Transcriptome Profilare Partea 2

Vă rugăm să faceți clic peoscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informații

2.9. Măsurarea elasticității pielii

Elasticitatea pielii a fost analizată cu ajutorul unui Cutometer MPA 580 (Courage & Khazaka, Köln, Germania). O sondă cu un diametru de 2 mm a fost montată pe acest echipament pentru încercare. Modul 1 sau modul de solicitare a timpului a fost folosit ca condiție de măsurare. La timp 2.0s și off-time 2.0s au fost apoi aplicate la presiunea negativă specificată a stării modului 1 (450 bar), iar măsurătorile au fost efectuate de trei ori consecutiv. Au fost măsurate trei valori diferite ale parametrilor, R2(elasticitate brută), R5 (elasticitate netă) și R7 (elasticitate biologică).

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

2.10. Măsurarea densității cutanate și a grosimii pielii

Densitatea dermică și grosimea pielii de pe obraz au fost analizate folosind Dermascan-C(Cortex Technology, Hadsund, Danemarca), o mașină de imagistică de înaltă rezoluție care utilizează unde supersonice de 20 MHz, ceea ce este foarte util în observarea non-invazivă a modificărilor la straturile interioare ale pielii. În studiul nostru, a fost utilizată imaginea de scanare B.cistanche nzÎn primul rând, am setat viteza undelor supersonice la 20 MHz, am răspândit jeleul de contact pentru test, am plasat sonda într-un unghi drept față de piele și am presat-o ușor pentru a măsura zona obrazului. Grosimea pielii și densitatea dermică au fost calculate de sistemul software Dermascan-C.

Cistanche ar putea anti-imbatranire

Imaginile feței au fost fotografiate cu condiții de fotografie identice, cum ar fi aceeași lumină, cameră digitală de înaltă rezoluție și fotograf. După aceea, ridicarea facială la colțul gurii a fost examinată folosind analiza Moire pe baza imaginilor feței. Am selectat colțul gurii, unde lăsarea pielii este proeminentă, ca zonă de testare. Folosind imaginile, unghiul (R) dintre linia orizontală și linia de contur trasată în colțul gurii a fost calculat folosind software-ul de analiză a imaginii (ImagePro Plus, Rockville, MD, SUA).

2.11.Testul statistic

Am efectuat un test ANOVA unidirecțional pentru comparația dintre probele de control și cele de testare. Rezultatele au fost prezentate cu deviație medie și standard (media ± SEM). Valorile p p<0.05 (*),=""><0.01(*), and=""><0.001 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" statistical="" tests="" were="" declared="" statistically="" significant="" at="" the="" 0.05="" level.="" we="" used="" ibm="" spss="" statistics="" version="" 21.0="" (spss,="" chicago,="" il,="" usa)="" for="" the="" statistical="">

2.12. Pregătirea bibliotecilor pentru secvențierea ARN-Seq și de generație următoare

Pentru analiza transcriptomului, celulele HaCaT cu o densitate de 1×10°, pe puț, au fost incubate într-o placă cu șase godeuri timp de 24 de ore. După aceea, celulele keratinocite umane (tratament) au fost tratate cu o concentrație finală de 1% extract de LACCE timp de 24 h, în timp ce starea de machetă (control) a fost tratată cu apă sterilă. Pentru fiecare condiție, au fost recoltate trei probe biologice diferite. ARN-ul total a fost extras folosind un Mini Kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Germania) conform instrucțiunilor producătorului. După extragerea RNA-urilor totale din fiecare probă, șase biblioteci diferite pentru ARN-Seq au fost pregătite de TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Cele șase biblioteci diferite au fost secvențiate de sistemul NovaSeq 6000 al illumina (Macrogen, Seul, Coreea). Datele obținute privind secvențele brute au fost depuse în baza de date a Centrului Național de Informații biotehnologice (NCBI) Sequence Read Archive (SRA) cu următoarele numere de aderare: SRR9127735, SRR9127736, SRR9127737, SRR9127738, SRR9127733 și SRR9127734.

2.13. Cartografierea, normalizarea și identificarea genelor exprimate diferențial

Am mapat secvența brută citește din fiecare bibliotecă la transcrieri de referință umane versiunea GRCh38 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/) folosind aliniatorul BBMap cu parametrii impliciti (https://sourceforge.net/projects/bbmap/). Folosind bbmap. opțiunea sh, am calculat fragmente pe kilobază de milioane (FPKM) valori pentru fiecare transcriere. Valorile FPKM obținute din fiecare afecțiune au fost supuse DEBrowser pentru normalizarea și analiza genelor exprimate diferențial(DEG)[19].cistanche dimensiunea penisuluiValorile FPKM mai mici de 1 au fost eliminate. Folosind EdgeRcu metoda TMMnormalization și tipul cel mai exact, am identificat gene exprimate diferențial în funcție de valorile p ajustate mai mici de 0,001 și log2 convertite ori modificări de mai mult de unul.

2.14. Ontologie genică (GO)Analiza îmbogățirii la termen

Pentru analiza îmbogățirii pe termen lung a GO, Curtea a identificat DEG-uri pe baza unor valori p ajustate mai mici de 0,05 și a modificărilor de ori convertite log2 de peste 0,5. Ca urmare, au fost identificate 22 de gene up-reglementate și 13 down-regulated. Fiecare set de gene a fost supus analizei îmbogățirii folosind programul GORILLA cu parametri impliciti (http:/cbl-gorilla.cs.Technion.ac.il/)[20]. Am selectat două liste neevaluate de gene ca mod de rulare folosind 11.290 de gene exprimate ca set de fundal.

3. Rezultate

3.1. Pregătirea LACCE din Edeluweiss

LACCE a fost obținut așa cum se arată în figura 1. Pe scurt, semințele de edelweiss au fost mai întâi sterilizate și germinate (Figura 1A). Calusul a fost indus din frunzele semințelor germinate (Figura 1B) și supus culturii celulare de suspensie (Figura 1C). Celulele de suspensie au fost cultivate în bioreactoare pentru producția pe scară largă de LACCE (Figura 1D).cistanche pulbereCelulele cultivate au fost recoltate și liofilizate pentru studii suplimentare (Figura 1E). LACCE a fost preparat prin extracție de căldură. Diferitele concentrații lacce au fost utilizate pentru analize multiple in vitro (0,1%,0,5%, și 1%), in vivo (1%), și transcriptome (1%) analize.

Figura 1. Procedura experimentală pentru obținerea extractului de cultură Leontopodium Alpinum callus (LACCE) din edelweiss callus folosind un bioreactor. (A) Semințele de Edelweiss au fost sterilizate și germinate. (B) Calusul a fost indus din țesutul frunzelor de edelweiss. (C) Calusul indus a fost cultivat cu suspendare. (D) Celulele obținute au fost cultivate într-un bioreactor. (E) Celulele calusului au fost recoltate și liofilizate într-o cantitate mare.

3.2. Evaluarea in vitro a LACCE ca agent anti-îmbătrânire

Am efectuat un test de bromură de tetrazoliu 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil bromură de tetrazoliu (MTT) pentru a observa viabilitatea celulară după tratamentul cu LACCE. În acest studiu, am folosit celule imortalizate în loc de celulele primare ale pielii umane din următoarele motive. Liniile celulare nemuritoare au multe beneficii, inclusiv fiind ușor de a lucra cu, ieftin, și o aprovizionare nelimitată de material.extract de cistanche salsaÎn plus, putem sări peste multe probleme etice legate de utilizarea țesuturilor umane. În plus, liniile celulare imortalizate sunt utilizate preferențial pentru studiul proceselor biologice de bază, cum ar fi ARN-Secvențierea (ARN-Seq). Două linii celulare diferite, HaCaT și Detroit551, au fost tratate cu trei concentrații diferite de LACCE (0,1%,0,5% și 1%). Viabilitatea celulară a celulelor HaCaT și Detroit551 după tratamentul cu LACCE a fost comparabilă cu cea a controlului (Figura 2). În detaliu, viabilitatea celulară a celulelor HaCaT a fost ușor redusă de la 98,61% (0,1% LACCE) la 94,72% (1% LACCE), pe măsură ce concentrația lacce a fost crescută (Figura 2A). În schimb, viabilitatea celulară a celulelor Detroit551 a fost ușor crescută de la 95,99% (0,1%LACCE)la 99,95% (1%LACCE) pe măsură ce concentrația lacce a fost crescută (Figura 2B).

Figura 2. Evaluarea in vitro a LACCE ca agent anti-îmbătrânire, inclusiv citotoxicitate și activitate anti-oxidantă. Viabilitatea celulară pentru trei concentrații diferite (0,1%, 0,5% și 1%) de LACCE în celulele HaCaT(A) și celulele Detroib551(B)prin testul MTT. Bara Gri indică celulele tratate cu apă distilată. (C) Celulele HaCaT au fost tratate cu peroxid de hidrogen. Viabilitatea celulară pentru trei concentrații diferite de LACCE a fost măsurată prin testul 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil bromură de tetrazoliu (MTT). N-acetilcisteina (NAC) a fost folosit ca un control pozitiv. (D) Activitatea antioxidantă a diferitelor concentrații de LACCE a fost măsurată prin testul DPPH. Vitamina C (Vit. C) a fost utilizată ca martor pozitiv.*și** indică semnificația statistică cu valori p mai mici de0,05 și, respectiv, 0,01.tulpina cistanche(E) Morfologia celulară din fiecare probă tratată cu peroxid de hidrogen a fost vizualizată cu colorare în albastru de metilen.

În plus, am efectuat un test MTT indus de peroxid de hidrogen (H2O2). În general, peroxidul de hidrogen a cauzat citotoxicitate puternică (42,52% din viabilitatea celulară) în comparație cu controlul negativ, în timp ce adăugarea de N-acetil cisteină (NAC), un antioxidant în celulă, a inhibat citotoxicitatea cauzată de peroxidul de hidrogen (60,24% din viabilitatea celulară). Pe măsură ce concentrația lacce a fost crescută, viabilitatea celulară a fost crescută de la 45,54% (0,1% LACCE) la 60,37% (1% LACCE) ca răspuns la peroxidul de hidrogen (Figura 2C). În special, rata de inhibare a speciilor reactive de oxigen (ROS) pentru extractul de LACCE de 1% a fost comparabilă cu cea a CNA. În plus, morfologia celulară a fost observată și după colorarea cu albastru de metilen, prezentând o creștere a viabilității celulare din LACCE (Figura 2E).

Apoi, am efectuat un test antioxidant folosind un test radical 2,2-difenil-1-picrilhidril (DPPH) radicale coridoarele (Figura 2D). Activitatea de curățare radicală a DPPH a fost crescută de la 2,85%(0,1% LACCE)la 20,47%(1% LACCE), pe măsură ce concentrația extractului LACCE a fost crescută. Comparativ cu vitamina C(14.05%), atât concentrațiile lacce de 0,1%, cât și cele de 0,5% au arătat o activitate mai scăzută de curățare radicală, în timp ce concentrația de 1% a extractului LACCE a prezentat o activitate mai mare de curățare a radicalilor.

3.3.In Vitro a extractului LACCE ca agent antiinflamator

Pentru a examina efectul antiinflamator al LACCE, expresia a două gene markeri inflamatori care codifică COX-2 și, respectiv, sintetazei inductibile de oxid nitric (iNOS), au fost cuantificate cu RT-PCR în timp real (Figura 3A, B). În general, iradierea UVB a reglementat expresia genei COX-2 care codifică o proteină care induce inflamația (Figura 3A). În comparație cu controlul negativ, adăugarea LACCE la celula HaCaT a suprimat semnificativ expresia genei COX-2. Cu toate acestea, nu au existat diferențe semnificative între diferitele concentrații lacce. Comparativ cu martorul pozitiv care conține dexametazonă (Dex), LACCE (0,1% până la 1%)a arătat un efect antiinflamator foarte similar. Expresia genei iNOS a fost inhibată de controlul pozitiv care conține Dex și LACCE (Figura3B). Pe măsură ce concentrația extractului LACCE a fost crescută, expresia genei iNOS a fost redusă treptat.

Figura 3. Evaluarea in vitro a LACCE ca agenți antiinflamatori, hidratanti și antirid prin RT-PCR în timp real. Expresia relativă a COX2(A) și iNOS (B), două gene marker inflamator, în concentrații diferite de LACCE ca răspuns la probele tratate cu UVB, a fost măsurată prin RT-PCR în timp real. Dexametazona (Dex)a fost folosită ca martor pozitiv. Barele gri și albastre indică celulele HaCaT fără și, respectiv, cu tratament UVB. (C) Expresia relativă a AOP3, un marker pozitiv pentru efectul de hidratare, în diferite concentrații LACCE. (D) Expresia relativă a MMP-2, un marker de creștere celulară, în concentrații diferite LACCE ca răspuns la UVB. Expresia genelor individuale a fost normalizată la expresia genei GAPDH.* și* indică semnificația statistică cu valori p mai mici de 0,05 și, respectiv, 0,01.

Acest articol este extras din Gene 2020, 11, 230; doi:10.3390/gene11020230 www.mdpi.com/journal/genes