Efectele anti-îmbătrânire ale extractului de cultură de calus de Leontopodium Alpinum (Edelweiss) prin profilarea transcriptomului

Vă rugăm să faceți clicoscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

Abstract:Edelweiss (Leontopodium Alpinum) din familia Asteraceae este o floare sălbatică care crește în locuri stâncoase de calcar. Aici, am investigat eficacitatea extractului de cultură de calus de edelweiss (extract de cultură de calus Leontopodium Alpinum; LACCE) utilizând mai multe teste de la in vitro la in vivo, precum și profilarea transcriptomului. Câteva rezultate ale testelor in vitro au arătat activitatea antioxidantă puternică a LACCE ca răspuns la tratamentul UVB. Mai mult, LACCE a suprimat inflamația și ridurile; cu toate acestea, activitatea de hidratare a fost crescută de LACCE. Testul clinic in vivo a demonstrat că aplicarea constantă a LACCE pe față și pe țesuturile pielii a îmbunătățit ridurile anti-periorbitale, elasticitatea pielii, densitatea dermică și grosimea pielii în comparație cu placebo. Rezultatele secvențierii ARN au arătat că cel puțin 16,56 la sută din genele umane au fost exprimate în celulele keratinocitelor. gene reglate în sus LACCE care codifică mai multe proteine ​​KRT; DDIT4, BNIP3 și IGFBP3 au fost implicați în reglarea pozitivă a procesului de dezvoltare, moartea celulară programată, keratinizarea și cornificarea formând bariere ale pielii, care oferă multe avantaje pielii umane. În schimb, genele reglate în jos au fost gene sensibile la stres, inclusiv metale, oxidare, răni, hipoxie și infecție cu virus, sugerând că LACCE nu a provocat niciun stres dăunător asupra pielii. Studiul nostru cuprinzător a demonstrat că LACCE este un agent promițător pentru cosmeticele anti-îmbătrânire.

Cuvinte cheie:anti îmbătrânire; calus; floare de colt;Celulele pielii; transcriptom

1. Introducere

Edelweiss (Leontopodium noble sub sp. Alpinum(Cass.) Greuter) din familia Asteraceae este o floare sălbatică care crește în locuri calcaroase stâncoase la altitudini mari, cum ar fi Alpii elvețieni [1,2]. Datorită rarității florilor sale albe de scurtă durată, edelweiss reprezintă frumusețea și puritatea legate de Alpi și Carpați. În plus, multe țări, inclusiv Austria, Bulgaria, România, Slovenia și Elveția, consideră edelweiss ca un simbol național.

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

Multă vreme, edelweiss a fost folosită ca medicament tradițional împotriva durerilor abdominale, bronșitei, diareei, dizenteriei și febrei [3, A]. Recent, mai multe studii au arătat eficacitatea extractelor de edelweiss pentru antiinflamație la șoareci și șobolani [3] și la keratinocite și celule endoteliale umane [4]. În plus, extractele de rădăcină de edelweiss conțin constituenți care îmbunătățesc neurotransmisia colinergică, indicând potențialul său pentru agenți antidemență [5] și antioxidanți, cum ar fi

acidul leontopodic A și acidul 35-cafeoilchinic, care pot fi utilizați ca agenți anti-îmbătrânire [6]. În plus, extractele de edelweiss au prezentat activitate antibacteriană împotriva Enterococcus faecium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia și Streptococcus pyogenes, sugerând posibila lor utilizare etnomedicinală pentru afecțiuni respiratorii și abdominale [7].

Mai multe studii anterioare au analizat compușii extractelor de edelweiss. De exemplu, metoda cromatografiei capilare a evidențiat 12 compuși importanți din punct de vedere farmacologic, inclusiv flavonoide, acizi cafeici și acid leontopodic, din părțile aeriene ale edelweiss [8]. Pentru a extrage antioxidanți din plantele edelweiss, au fost dezvoltate metode de cromatografie de partiție centrifugă (CPC) și cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) [6]. Se știe că compușii activi ai extractelor de edelweiss dintre părțile aeriene și rădăcini sunt diverși[3]. De exemplu, rădăcinile păroase ale edelweiss produc lignani activi din punct de vedere farmacologic, cum ar fi login și 5-metoxi-login, care pot fi stimulați de mai multe alte componente, cum ar fi nitrat de argint, zaharoză, metil iasmonat și extract de drojdie. 9].beneficiile extractului de cistancheÎn plus, modelele metabolice ale a 11 specii diferite de Leontopodium au fost dezvăluite prin spectroscopie de rezonanță magnetică nucleară (1H RMN) și cromatografie lichidă-spectrometrie de masă (LC-MS) în relația lor de taxonomie [10].

Cistanche ar putea anti-imbatranire

Calusul plantei poate fi definit ca mase de celule neorganizate sau nediferențiate, care sunt ușor induse prin rănire pentru a acoperi o rană a plantei sau prin conducerea artificială a unui sistem in vitro. Calusul plantelor este cultivat artificial prin adăugarea de nutrienți și regulatori de creștere a plantelor în condiții de creștere antiseptică. În prezent, este posibil să se producă un număr mare de celule vegetale specifice de calitate egală într-un bioreactor. Mai mult, o celulă vegetală are o capacitate denumită totipotență, care este potențialul genetic al unei celule vegetale de a produce întreaga plantă matură [11]. Astfel, este posibil să se genereze o plantă matură din calusul specific al plantei. În plus, calusul poate fi utilizat pe scară largă pentru regenerarea plantelor pentru a conserva plantele rare și pe cale de dispariție [12,13].

La fel ca și celulele animale, celulele vegetale au abilități de a facilita stimularea și regenerarea plantelor după rănire [14]. Deși celulele stem din plante sunt considerate materiale emergente în industria cosmetică, materialele disponibile sunt limitate. Este important să se identifice noi surse de plante și să se evalueze componentele funcționale ale acestora asociate cu produsele cosmetice.

Extractele de Edelweiss sunt bine cunoscute pentru utilizarea lor în agenții farmaceutici; cu toate acestea, efectele extractului de edelweiss ca sursă cosmetică naturală sunt rareori raportate. Aici, am investigat eficacitatea extractului de calus de edelweiss (extract de cultură de calus Leontopodium Alpinum; LACCE) derivat din frunze de edelweiss folosind mai multe teste de la in vitro la in vivo și am dezvăluit mecanismul molecular cauzat de LACCE folosind profilarea transcriptomului.

2. Materiale și metode

2.1. Producția de calus de Edelweiss

Semințele de Edelweiss au fost achiziționate comercial. Semințele de edelweiss au fost înmuiate în 70 procente etanol timp de 30, urmate de spălare cu apă distilată. Din nou, semințele au fost agitate în 0,3% hipoclorit de sodiu (Waco, Osaka, Japonia) timp de 20 minute și spălate cu apă distilată. Semințele sterilizate au fost germinate pe un mediu de bază Murashige și Skoog(MS) (Duchefa Biochemie, Haarlem, Olanda). Frunzele de edelweiss în stare aseptică au fost tăiate în bucăți mici (0,5 până la 1 cm). Am indus stadiul incipient al celulelor vegetale pe un mediu MS care conține 0,5-3 mg/mL de 6-Benzilaminopurină ({6-BAP)(Duchefa Biochemie) și 0.3-1 mg/mL de acid 2,4-diclorfenoxiacetic (2,4-D)(Duchefa Biochemie) în întuneric la 25± 2 grade [15]. pH-ul mediului MS a fost ajustat la 5,8 folosind 1 N de NaOH (Duchefa Biochemie). Calusul indus a fost propagat în placa Petri. Linia de calus selectată a fost cultivată într-un bioreactor în Institutul de Cercetare Anti-Aging al BIO-FD&C Co., Ltd., Incheon, Coreea. Calusul cultivat a fost recoltat și spălat de trei ori cu apă distilată.cistanche genghis khanCalusul a fost deshidratat folosind liofilizatorul (IlShinbioBase, Dongducheonsi, Coreea) conform instrucțiunilor producătorului. Calusul uscat de edelweiss a fost agitat în apă distilată la 50 de grade timp de 8 ore. Extractele de calus au fost obținute prin extracție la căldură la 98 de grade timp de 10 minute.

2.2. Cultura celulelor pielii umane

Efectele evaluate ale extractelor de edelweiss asupra celulelor pielii umane, a celulelor keratinocite (HaCaT) și a fibroblastului uman normal Detroit 551 (ATCC, Manassas, VA, SUA) au fost cultivate în Mediul Vultur modificat (DMEM) de la Dulbecco (Welgene, Gyeongsan-si, Coreea). ) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) și 1% antibiotic-antimicotic (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) la 37 de grade cu o condiție de 5% CO2.

2.3. Evaluarea activității metabolice celulare prin test MTT

Pentru a evalua citotoxicitatea LACCE asupra creșterii celulare, propagării și supraviețuirii celulelor pielii umane, un MTT({{0}}({45-dimetiltiazol-2-il){{3} },5-bromură de difeniltetrazoliu) a fost efectuat așa cum s-a descris anterior[16,17]. Pe scurt, celulele HaCaT și Detroit 551 la o densitate de 5×10* celule per godeu, respectiv, au fost incubate într-o placă de 96-godeuri timp de 24 de ore. După aceea, concentrațiile finale de 0,1 la sută , 0,5% și 1% LACCE au fost tratate timp de 24 de ore. Apa distilată a fost folosită ca control. După tratamentul LACCE, mediul a fost îndepărtat urmat de adăugarea a 4 μLof 5 mg/mL MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) și incubat timp de 4 ore. După îndepărtarea mediului, s-au adăugat 100 μL de dimetilsulfoxid (DMSO) (Sigma) și s-au dizolvat timp de 10 minute.prelungirea vieții cistancheAbsorbanța lungimii de undă a fost măsurată la 570 nm utilizând un spectrofotometru cu microplăci Thermo Scientific Multiskan GO (Fisher Scientific Ltd., Vantaa, Finlanda). Viabilitatea celulară a fost obținută folosind următoarea formulă. Viabilitatea celulară (procent)=(cantitatea de absorbanță pentru celulele tratate/cantitatea de absorbanță a celulelor de control)× 100.

2.4. Evaluarea activității antioxidante prin test DPPH

Activitatea antioxidantă a LACCE a fost măsurată într-un test DPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazină-hidrat) așa cum a fost descris anterior [18]. Pe scurt, 0,1 mL de concentrațiile finale de 0,1%, {{10}},5% și 1% LACCE au fost tratate în 0,1 mL de 0,1 mM de DPPH (Sigma-Aldrich) în prezența de 0.4 mL de etanol. Am folosit 0,001 procente de acid ascorbic (vitamina C) (Sigma-Aldrich) ca martor pozitiv. Probele au fost amestecate bine timp de 10 secunde și incubate la temperatura camerei în condiții de întuneric timp de 30 de minute. Absorbanța lungimii de undă a fost măsurată la 517 nm folosind un spectrofotometru cu microplăci Thermo Scientific Multiskan GO (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Activitatea de captare a radicalilor a fost calculată folosind următoarea formulă. Activitate de captare (procent)=[1-(absorbanța probei de testat/absorbanța martor)]×100.

2.5. Evaluarea activității antioxidante prin analiza peroxidului de hidrogen (H2O2).

Peroxidul de hidrogen produce radicali liberi de oxigen în celule, ducând la moartea celulelor. Am testat rata mortalității celulare cauzată de peroxidul de hidrogen în probele tratate cu LACCE. Celulele HaCaT la o densitate de 5×105 celule per godeu au fost incubate într-o placă de 24-godeuri timp de 24 de ore. După aceea, concentrațiile finale de 0,1%,0,5% și 1% LACCE au fost tratate în prezența a 1 mM de H, O, timp de 8 ore. Ca martor pozitiv, a fost utilizat 0,033% NAC (Sigma-Aldrich). Un test MTT a fost utilizat pentru a măsura rata de supraviețuire celulară a probelor tratate cu LACCE cauzată de HO2. În plus, am observat morfologia celulară prin colorare cu albastru de metilen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA).

2.6. Transcriere inversă în timp real (RT)-PCR

Pentru a examina efectul LACCE asupra antirid, hidratant și antiinflamator, am efectuat RT-PCR în timp real cu primeri cunoscuți care amplifică genele marker folosind QuantiTect Primer Assays (Qiagen, Hilden, Germania) conform instrucțiunilor producătorului. Celulele Detroit 551 la o densitate de 5×104 celule per godeu au fost incubate într-o placă de 96-godeuri timp de 24 de ore. După aceea, concentrațiile finale de 0,1%,0,5% și 1% LACCE au fost tratate timp de 24 de ore. ADNc a fost sintetizat din celulele Detroit 551 respective tratate cu diferite concentrații LACCE folosind un kit SuperPrep Cell Lysis & RT pentru qPCR (Toyobo, Osaka, Japonia) care conține reactivi de liză și reactivi RT conform instrucțiunilor producătorului. Pentru efectul antirid asupra tratamentului LACCE, expresia genei care codifică Matrix Metalloproteinase-2(MMP{-2) a fost cuantificată prin RT-PCR în timp real utilizând un kit Thunderbird SYBR qPCR Mix (Toyobo) pe baza instrucțiunilor producătorului. Pentru evaluarea hidratării prin tratamentul LACCE, expresia genei care codifică Aquaporin 3(AOP3) a fost examinată prin RT-PCR în timp real. În cazul testului antiinflamator, celulele HaCaT la o densitate de 5×104 celule per godeu au fost incubate într-o placă de 96-godeuri timp de 24 de ore. După îndepărtarea mediului, UVB a fost iradiat pe celulele HaCaT. Pentru iradierea UVB, 5 mJ/cm' a fost folosit de o cutie UV CL-1000 (Analytik Jena AG, Jena, Germania). După aceea, concentrațiile finale de 0,1%, 0,5% și 1% LACCE au fost tratate timp de 4 ore. Am folosit dexametazonă (Dex) (Sigma-Aldrich) ca martor pozitiv. Pentru efectul antiinflamator al tratamentului LACCE, expresia genelor care codifică COX2 și, respectiv, iNOS, au fost cuantificate prin RT-PCR în timp real. Expresia genelor individuale a fost normalizată la expresia genei GAPDH. 2.7. Evaluarea clinică a LACCE ca agent pentru cosmetice în Vioo

Un studiu clinic pentru evaluarea eficacității LACCE asupra liftingului facial și îmbunătățirii ridurilor periorbitale, elasticității pielii, densității dermice și grosimii pielii a fost realizat de compania Ellead după aprobarea pe baza procedurilor standard de operare (Ver. 3.{{1} }) (Ellead, Seongnam, Coreea) de la Ellead IRB în conformitate cu ghidul coreean de bune practici clinice (B1-2015-4-002) descris de Ministerul pentru Siguranța Alimentelor și Medicamentelor (MFDS) și procedurilor standard de operare Ellead (EL-P{ {4}}).

Pentru a examina efectul LACCE in vivo, am efectuat o evaluare clinică a LACCE pentru patru factori diferiți: lifting facial și îmbunătățirea ridurilor periorbitale, elasticitatea pielii, densitatea dermică și grosimea pielii. Pentru aceasta, un total de 21 de voluntari de sex feminin cu o vârstă medie de 48,04 ± 4,28 ani, care au fost împărțiți în continuare în 12 voluntari în vârstă de 40 de ani și nouă voluntari în vârstă de 50 de ani, au participat la evaluarea clinică pe parcursul a patru săptămâni.

Testul clinic a fost efectuat la trei momente de timp diferite, valoarea de bază, 2 săptămâni și 4 săptămâni, pentru toți voluntarii. De la o săptămână înainte de începerea studiului și până la final, toți voluntarii nu au suferit tratamente suplimentare pentru îmbunătățirea pielii, a produselor cosmetice și a ajutoarelor sanitare, care ar fi putut afecta rezultatele. După spălarea fețelor voluntarilor folosind spuma de curățare, voluntarii au stat cel puțin 30 de minute într-o cameră controlată cu o temperatură (20-24 grade ) și umiditate constante (40% -60% umiditate relativă) . Am efectuat măsurarea aleatoriu pe partea stângă sau dreaptă a fețelor voluntarilor. Testul nostru a fost un test dublu-orb în care nici subiecții, nici cercetătorii nu știau care produs este un eșantion de testare. Formulările pentru calcularea ratelor scăzute și crescute au fost descrise în Tabelul 1.

2.8. Măsurarea liftingului facial și ameliorarea ridurilor periorbitale

La început, ridurile periorbitale, elasticitatea pielii, densitatea dermică, grosimea pielii de pe obraz și lifting facial la colțul gurii au fost măsurate pentru toți voluntarii. După aceea, două probe diferite, LACCE și placebo (control), au fost aplicate pe zona desemnată a feței de două ori pe zi (dimineața și seara). Voluntarii au fost împărțiți în două grupuri diferite, un grup I (LACCE a fost aplicat pe zona feței stângi în timp ce placebo a fost aplicat în zona dreaptă a feței) și grupul II (placebo a fost aplicat pe zona stângă a feței în timp ce LACCE a fost aplicat pe zona facială dreaptă). La două și patru săptămâni după tratament, au fost efectuate aceleași măsurători pentru a evalua efectul LACCE în comparație cu cel al placebo.

Ridurile periorbitale au fost analizate folosind sistemul optic de măsurare a pielii 3D (dimensiune) PRIMOS High Resolution (Canfield Scientific, Parsippany, NJ, SUA), care este ideal pentru investigarea microstructurii pielii și a ridurilor. Doi parametri diferiți de rugozitate, Ra (rugozitate medie), care este media valorilor absolute ale înălțimilor profilului profilului de rugozitate și Rg (rugozitatea pătratică medie), care este media pătratică medie a înălțimilor profilului profil de rugozitate, au fost măsurate.

Acest articol este extras din Genes 2020, 11, 230; doi:10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes