Efectele anti-îmbătrânire ale antocianinelor Ribes Meyeri asupra celulelor stem neuronale și a șoarecilor îmbătrâniți Partea 2

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

Nar salvează fenotipurile senescente ale 23M-NSC

Antocianinele R. Meyer sunt bogate în multe tipuri de flavonoide și componente bioactive [1,3-5]. Pentru a determina care componentă a antocianilor R. Meyer joacă un rol important în anti-îmbătrânire, am efectuat o analiză metabolomică a R. Meyer. antociani Meyer. Am dezvăluit că Nar poate fi un metabolit flavonoid important, deoarece calea biosintetică a flavonoidului a fost foarte îmbogățită în antociani R. Meyer (Tabelul suplimentar 1). Pentru a determina efectele antisenescente ale Nar, diferite concentrații (0, 1,7,3,4,6,8,13,6 și 27,2 ug/mL) au fost aplicate la testele 23M-NSC și CCK-8 pentru a investigați viabilitatea celulară. După cum arată figura suplimentară 3, tratamentul cu Nar cu 6,8 ug/mL a crescut viabilitatea celulară cu 150 la sută. Pentru a explora în continuare efectele antisenescente ale Nar, 23M-NSC au fost tratate cu Nar și apoi au fost detectați indicatori legați de îmbătrânire. .utilizări hesperidinăÎn 23M-NSC tratate cu 6,8 ug/mL Nar, expresia ARNm p16nk4a a fost redusă (Figura 3A). Nar a prelungit, de asemenea, telomerii mNSC-urilor cultivate și a crescut sinteza ADN (Figura 3B, 3C). Pentru a explora în continuare efectele Nar asupra proliferării celulare, am efectuat colorarea prin imunofluorescență a Ki67, care este un antigen nuclear al celulelor mitotice care este exprimat pe tot parcursul ciclului celular, cu excepția G0 [19,27]. Tratamentul cu Nar a sporit proliferarea celulară, măsurată prin numărul crescut de celule Ki67-pozitive (Figura 3D, 3E). Apoi, am detectat, de asemenea, potențialul de diferențiere al NSC-urilor în neuroni. Într-adevăr, tratamentul cu 6,8 ug/mL Nar a crescut și numărul de celule MAP2-pozitive (Figura 3F, 3G). Aceste rezultate demonstrează în mod constant că Nar poate inversa senescența 23M-NSC.

Figura 2. Antocianinele Ribes Meyer îmbunătățesc memoria șoarecelui și abilitățile de învățare prin creșterea celulelor stem neuronale (NSC). (A) Este nevoie de timp pentru a găsi platforma. (B) Este nevoie de timp pentru a ajunge prima la platformă. (C) Viteza medie pentru găsirea platformei. (D) Distanța a înotat înainte de a găsi platforma. (E. F) Tratament cu R.cistanche a imperiului pierdutfiecare antociană a crescut numărul și dimensiunea neurosferei în comparație cu martorii. (G) Neurosferele cu o dimensiune de 50-100 um au fost crescute în număr prin tratamentul cu antociani R. Meyer la șoareci. Datele sunt prezentate ca medie ± SD a trei experimente independente. *P<><0.01, and=""><0.0001 compared="" with="" untreated="" cells."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" in="" each="" experimental="">

Figura 3. Efectul naringeninei (Nar) asupra senescenței celulelor stem neuronale de șoarece (MNC). (A) Expresia ARNm p16k4a a fost măsurată prin qRT-PCR în 23M-NSC-uri cu și fără tratament de 6,8 ug/mL Nar timp de 48 de ore. (B) Distribuțiile fazei ciclului celular ale 23M-NSC tratate cu Nar timp de 48 de ore și celule de control. (C) Lungimea relativă a telomerilor 23M-NSC a crescut semnificativ cu tratamentul cu Nar, (D) colorarea prin imunofluorescență Ki67 a mușchilor tratați cu Nar timp de 48 de ore, cu etichetare nucleară DAPI, (E) Cuantificarea (D), (F) reprezentativ câmpurile de colorare prin imunofluorescență MAP2 și GFAP a mNSC-urilor cultivate după control și tratament Nar. (G) Cuantificarea lui (F). Datele sunt prezentate ca medie ± SD a trei experimente independente. *P<>< 0.01,="" and="">< 0.0001="" compared="" with="" untreated="">

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

Nar îmbunătățește memoria și cogniția la șoarecii în vârstă

Nivelurile cognitive scad odată cu îmbătrânirea, iar tratamentele anti-îmbătrânire pot îmbunătăți nivelurile cognitive [11, 28]. Pentru a verifica efectele anti-îmbătrânire ale Nar in Vivo, am injectat 20 mg/kg Nar în șoareci în vârstă C57BL/6 (12 luni) prin vena cozii. Testul MWM a fost folosit pentru a examina memoria spațială și abilitățile cognitive ale șoarecilor.fracție de flavonoid purificată micronizat 1000 mg utilizăriPeste 5 zile de antrenament repetat, timpul necesar șoarecilor în vârstă tratați cu Nar pentru a găsi platforma a scăzut treptat în comparație cu grupul de control (Figura 4A). Rezultatele testului au arătat că timpul necesar pentru a ajunge prima la platformă a fost redus (Figura 4B), în timp ce timpul petrecut în zona platformei a fost crescut (Figura 4C). În plus, șoarecii îmbătrâniți tratați cu Nar au fost observați în zona platformei la o frecvență mai mare decât grupul de control (Figura 4D). Împreună, aceste rezultate sugerează că Nar poate îmbunătăți memoria spațială și abilitățile cognitive la șoarecii în vârstă.

Analiza de secvențiere ARN a sângelui tratat cu Nar de la șoareci în vârstă

Pentru a investiga mecanismele anti-îmbătrânire specifice Nar, am analizat profilul de expresie genică a sângelui tratat cu Nar de la șoareci în vârstă, folosind secvențierea ARN (ARN-seq). Rezultatele au evidențiat 1.961 de gene exprimate diferențial (DEG). În general, Nar a redus expresia genei și doar un număr mic de gene au fost reglate în sus în comparație cu grupul de control netratat (Figura 5A, 5B). În plus, genele importante ale căii de semnalizare legate de îmbătrânire au fost reglate în jos, în special cele din calea de semnalizare TNF (Figura 5C).oteflavonoidAceste rezultate implică faptul că Nar afectează calea de semnalizare a TNF, influențând astfel profund funcția TNF-a, care este implicată în tulburările cognitive legate de îmbătrânire [29,30]. Prin urmare, am examinat nivelurile de TNF din plasma șoarecilor. Rezultatele testelor d imunosorbente (ELISA) legate de enzime

Figura 4. Naringenina (Nar) îmbunătățește memoria și abilitățile de învățare la șoarecii în vârstă. (A) Latența de evadare a șoarecilor în vârstă tratați cu Nar a fost mai scurtă în comparație cu grupul de control. (B) Timpul necesar pentru a ajunge prima la platformă a fost mai scurt la șoarecii în vârstă tratați cu Nar decât în ​​grupul de control. (C) Durata timpului petrecut în zona platformei. (D) Frecvența de a fi observată în zona platformei pentru șoarecii în vârstă tratați cu Nar în comparație cu grupul de control. Datele sunt prezentate ca medie ± SD a trei experimente independente.*P<>< 0.01,=""><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" used="" for="" each="" experimental="" group.="" revealed="" that="" nar="" treatment="" led="" to="" the="" downregulation="" of="" plasma="" tnf-a="" levels="" (figure="" 5d).="" we="" also="" examined="" pl6ink4agene="" expression="" in="" the="" hippocampus="" of="" mice="" and="" demonstrated="" that="" nar="" treatment="" downregulates="" pl6ink4amrna="" expression(figure="">

Cistanche poate anti-imbatranire

DISCUŢIE

Îmbătrânirea este asociată cu un risc crescut de declin cognitiv, precum și cu o pierdere a capacității de învățare și memorie [22,23]. Pierderea neuronelor și neurogeneza afectată sunt strâns legate de disfuncția creierului asociată vârstei [11-13]. Astfel, creșterea numărului de neuroni și îmbunătățirea neurogenezei sunt cruciale pentru tratamentul anti-îmbătrânire. R. Meyer, o plantă bogată în flavonoide și alte substanțe bioactive [1, 3-6], are multe funcții care nu au fost încă descrise. În studiul de față, antocianinele R. Meyer au promovat proliferarea NSC și au crescut formarea de neurosfere cu morfologie uniformă. Tratamentul cu antociani R. Meyer a îmbunătățit, de asemenea, fenotipul de îmbătrânire celulară, cu niveluri reduse de ROS și expresia genei P16nk4 legate de îmbătrânire, creșterea fazei de sinteză a ADN-ului și telomerii prelungiți.puritani vitamina cMai mult, rezultatele colorării prin imunofluorescență au arătat că antocianinele R Meyer au stimulat formarea neuronilor. Aceste rezultate sugerează că antocianinele R. Meyer au efecte anti-îmbătrânire asupra mNSC-urilor și pot, de asemenea, promova direct formarea neuronilor in vitro. În plus, declinul cognitiv este strâns legat de îmbătrânire [22, 23]. Rezultatele noastre MWM au demonstrat că administrarea intragastrică de antociani R. Meyer a îmbunătățit memoria spațială și abilitățile de învățare la șoarecii în vârstă și, de asemenea, a crescut

Figure 5. Tumor necrosis factor(TNF)-a plays an essential role in naringenin (Nar)-mediated anti-aging effects. (A) Summary of gene expressions in mouse blood, as determined by RNA-seq. (B)Heatmap showing differentially expressed genes (DEGs) in the blood between control and Nar-treated mice. DEGs were identified by a fold change of >2.0 sau<0.5. (c)bar="" graph="" showing="" the="" major="" correlated="" signaling="" pathways.="" (d)="" heatmap="" showing="" degs="" in="" the="" tnf="" signaling="" pathway="" (e)="" plasma="" tnf-a="" levels="" determined="" by="" enzyme-linked="" immunosorbent="" assay.="" (e)="" p16hka="" gene="" expression="" levels,="" as="" determined="" by="" qrt-pcr.="" data="" are="" presented="" as="" the="" mean="" ±="" sd="" of="" three="" independent=""><><><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group.="" nsc="" and="" neuronal="" numbers="" in="" the="" hippocampus="" of="" aging="" mice.="" these="" results="" suggest="" that="" r.="" meyer="" anthocyanins="" may="" enhance="" cognitive="" function="" by="" increasing="" nsc="" proliferation="" and="">

Utilizarea analizei metabolomice pentru a investiga compoziția specifică a antocianilor R. Meyer a arătat că Nar poate fi un metabolit flavonoid important. Sa raportat anterior că Nar ameliorează senescența celulelor miocardice [31], îmbunătățește capacitatea metabolică a tractului intestinal [32] și exercită efecte antiinflamatorii [33] și anticancerigene [34]. Cu toate acestea, efectele Nar asupra NSC în timpul îmbătrânirii rămân necunoscute. Pentru a explora efectele anti-îmbătrânire ale antocianilor R. Meyer, am efectuat studii suplimentare folosind Nar. Tratamentul cu 6,8 ug/mL Nar a crescut viabilitatea celulară, a redus expresia genei P16ink4a, a prelungit telomerii și a promovat diferențierea NSC în neuroni in vitro. Pentru a evalua în continuare efectele Nar asupra proliferării celulare, am efectuat studii de imunofluorescență. Rezultatele au indicat că tratamentul cu Nar a crescut atât numărul de celule Ki67-pozitive, cât și proporția de celule MAP2-pozitive, sugerând că Nar poate promova neurogeneza. În plus, efectele Nar asupra învățării și memoriei au fost, de asemenea, evaluate la șoarecii în vârstă. Rezultatele testului MWM au demonstrat în mod constant că tratamentul cu Nar îmbunătățește învățarea spațială la șoarecii în vârstă. Interesant, analiza ARN-seq a arătat că Nar poate afecta senescența prin calea de semnalizare a TNF, în special prin reglarea în jos a expresiei TNF-a în sângele șoarecilor îmbătrâniți. Testele ELISA au indicat, de asemenea, că tratamentul cu Nar a redus nivelurile plasmatice de TNF-a în comparație cu șoarecii în vârstă de control. TNF-a este un factor cheie în calea de semnalizare a TNF și este strâns legat de îmbătrânirea cognitivă. Funcțiile sale includ promovarea modificărilor patologice în sinapsele hipocampice [29] și inhibarea proliferării celulelor precursoare [35]. Nivelurile modificate de TNF sunt asociate cu afectarea cognitivă în depresie, schizofrenie, tulburare bipolară și boala Alzheimer [30,36,37]. Mai precis, TNF-a este suprareglat la pacienții cu boala Alzheimer [38].

În rezumat, studiul nostru demonstrează că antocianinele R. Meyer îmbunătățesc efectele îmbătrânirii în NSC prin Nar, care reglează în jos nivelul TNF-a in vivo și îmbunătățește cunoașterea la șoarecii în vârstă. În mod colectiv, descoperirile noastre oferă o strategie nouă pentru dezvoltarea tratamentelor clinice, care vizează o mai mare realizare a valorii medicinale a antocianilor R.Meyer.

MATERIALE ȘI METODE

Animale experimentale

Acest studiu a fost aprobat de Comitetul pentru îngrijirea animalelor de la Universitatea Tongji și a fost realizat în conformitate cu ghidurile instituționale. Antocianinele R. Meyer au fost administrate intragastric timp de 2 luni la șoareci în vârstă de 12-luni menținuți pe fundalul C57BL/6. Nar a fost injectat în vena caudală timp de șoareci în vârstă de 1-lună până la 12- luni menținuți pe fundalul C57BL/6. Șoarecilor de control li sa dat același volum de soluție salină tamponată cu fosfat (PBS).

Prepararea antocianilor R. Meyer și Nar

Fructul R. Meyer (500 g) a fost omogenizat folosind un omogenizator de țesuturi și suspendat în 1 L de metanol care conține 0,1% acid clorhidric. Extracția cu ultrasunete a fost efectuată de trei ori timp de 30 de minute la temperatura camerei. Extractele au fost combinate, iar metanolul a fost concentrat sub presiune redusă pentru a obține extracte de R Meyer. Extractul a fost purificat în continuare cu rășină macroporoasă AB-8 pentru a crește conținutul de antociani.

Naringenina (C15H1205; MW: 272,25; puritate: mai mare sau egală cu 98 la sută; grad HPLC) a fost achiziționată de la Chengdu Push Biotechnology Co. Ltd. (Sichuan, China) și depozitată la 2 grade {{6} }} grad într-un mediu uscat fără lumină. Concentraţia soluţiei stoc a fost de 100 mM în dimetil sulfoxid (DMSO). Concentrația finală de DMSO nu a depășit 0,1 procente în mediul de cultură.

Neurosferă și teste de diferențiere

NSC-urile au fost derivate din SVZ de șoarece. Șoarecii au fost sacrificați după anestezie și SVZ a fost disecat cu grijă și disociat în celule unice cu 0.4 U/mL papaină (Imogen, Alexandria, VA, SUA; Cat No: LS003126). NSC-urile au fost placate în vase de 10 cm care conțineau 10 ml de mediu bazal NSC cu 10 ng/mL EGF (PeproTech, Cranbury, NJ, SUA; Cat No: AF-100-15) și 10 ng/mL FGF (PeproTech, Cranbury, NJ). , SUA; Cat No:AF-100-18B). Neurosferele au fost trecute la fiecare 5 zile. NSC-urile din neurosfere de trecere proaspăt disociate-2 au fost însămânțate pe laminină (Gibco, Gaithersburg, MD, SUA; Cat No: 23017015) și bromhidrat de poli-L-ornitină (Poly-L; Sigma Aldrich, St Louis, MO, SUA) Cat No: P3655) lame de sticlă acoperite în NSCBasalMedium fără suplimente de diferențiere. Celulele diferențiate au fost imunocolorate pentru Tu1 (beta-tubulină II; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA; Cat No: 480011), MAP2 (Thermo Fisher Scientific, Cat No: MA5-12826) și proteina acidă fibrilară glială (GFAP; Thermo Fisher Scientific, Cat No. PA5-16291), și apoi contracolorat cu 4'{6-diamidino{-2-fenilindol (DAPI; Thermo Fisher Scientific, Cat No: D1306). Lamele au fost examinate folosind un microscop Olympus BX53 (Olympus, Madison, WI, SUA). Cuantificarea celulelor TuJ1- și MAP2-pozitive a fost efectuată prin numărarea celulelor marcate din trei experimente independente. Analiza statistică a fost efectuată folosind un test t nepereche.

Acest articol este extras de pe www.aging-us.com AGING 2020, Vol. 12, nr. 17