Scaffoldul activat de gena Klotho anti-îmbătrânire promovează răspunsul de întinerire la vindecarea rănilor în celulele stem umane derivate din adipos

Cuvinte cheie:anti îmbătrânire; -Klotho; schelă activată de gene; celule stem derivate din adipos; angiogeneza;depunerea matricei;vindecare intineritoare

Faceți clic aici pentru a obține Herb Cistanche pentru anti-îmbătrânire și vindecarea rănilor

1. Introducere

Vindecarea rănilor este un proces biologic complex care necesită o orchestrare strânsă a evenimentelor celulare multiple.1]. Cu toate acestea, la îmbătrânirea populației, evenimentele celulare sunt perturbate, ducând la vindecarea întârziată.2]. Perturbarea mecanismelor de vindecare apare parțial din cauza găzduirii reduse a celulelor progenitoare din măduva osoasă și a altor boli metabolice predominante, cum ar fi diabetul.3,4]. În managementul rănilor, aplicarea schelelor de biomaterial devine din ce în ce mai frecventă ca tratament. Schele biomaterialeprotejați rana de infecții, absorbiți exsudatele plăgii și mențineți rana umedă pentru a preveni necroza tisulară [5]. Terapeuticele pot fi, de asemenea, încărcate în schele biomateriale și promovează o vindecare mai rapidă a rănilor greu de vindecat.1]. Cu toate acestea, schelele biomateriale singure pot să nu orchestreze în mod eficient cascadele multiple de semnalizare care apar în interiorul plăgii. Livrarea de celule stem este uneori propusă ca o soluție pentru moderarea evenimentelor complexe de semnalizare din rană [6]. 

Celulele stem secretă factori paracrini și se pot diferenția în celule din mai multe linii de țesut.7]. Celulele stem sunt de obicei introduse în rană prin injecții intradermice.6], pulverizare topică [8], sau ca grefe de inginerie tisulară [9]. În ultimii ani, aplicarea grefelor de inginerie tisulară pentru vindecarea rănilor cronice a câștigat treptat o acceptare mai largă datorită capacității lor de a vindeca rapid rănile.9–11]. Apligraf® și Dermagraft® sunt două dintre construcțiile bioinginerești aprobate de Food and Drug Administration (FDA) pentru tratamentul rănilor cronice.12,13]. Cu toate acestea, generarea acestor grefe necesită o cultură celulară prelungită pentru a produce un număr mare de celule.14]. Atunci când se utilizează celule stem, cultura prelungită poate crește senescența celulară și poate diminua caracterul stem al celulelor stem.15,16]. Prin urmare, menținerea stării celulelor stem este esențială pentru obținerea răspunsului terapeutic optim. Livrarea terapeutică a genelor către celulele stem folosind vectori non-virali este o strategie potențială de îmbunătățire a funcționalității celulelor stem.17]. În mod tradițional, celulele sunt transfectate în culturi 2D și ulterior transplantate in vivo [1].18]. Cu toate acestea, platforme cum ar fi schele activate de gene, constând din schele de biomaterial funcționalizate cu nanoparticule care poartă transgena terapeutică.19], pe care grupul nostru a fost pionierat, oferă o soluție alternativă pentru transfectarea celulelor într-un mediu 3-D. Acest studiu s-a concentrat pe dezvoltarea unei versiuni activate de gene a scheletului 3D de colagen-condroitin sulfat (coll-CS) care are un potențial de translație clinic uriaș, deoarece compoziția sa este similară cu cea a șablonului de regenerare cutanată (DRT) de la Integra, un model aprobat clinic. schelă pentru vindecarea rănilor cronice [20]. Folosim în primul rând un polimer cationic numit polietilenimină (PEI) pentru a condensa plasmidele ADN care codifică genele factorului de creștere, cum ar fi factorul alfa derivat din stromal -1 și factorul de creștere nervoasă și le asamblam în nanoparticule încărcate [21–23]. Aceste nanoparticule încărcate sunt apoi încărcate prin scufundare în schelele noastre coll-CS pentru a genera schelele activate de gene. Studiile noastre anterioare au arătat, de asemenea, că schela activată de genă bazată pe PEI poate provoca supraexprimarea tranzitorie a transgenei terapeutice într-o serie de celule de vindecare a rănilor și le poate promova abilitățile de regenerare.21,24,25]. În mod tradițional, schela activată de genă a fost dezvoltată pentru a ținti celulele gazdă și pentru a promova repararea locală.26]. Cu toate acestea, dovezile emergente indică faptul că schelele activate de gene încărcate de celule au o potență superioară de a regenera structuri tisulare complexe decât schelele activate de gene singure.27]. 

Abundența celulară este una dintre cerințele cruciale pentru generarea de grefe de inginerie tisulară.28]. Țesutul adipos este o sursă bogată care poate furniza un număr mare de celule stem. Țesutul adipos conține de 500 de ori mai multe celule stem pentru aceeași masă de măduvă osoasă, o sursă tradițională de țesut pentru extracția celulelor stem.29]. Mai mult, celulele stem pot fi extrase din țesutul adipos folosind un proces de liposucție minim invaziv.29]. Studiul nostru recent a constatat că celulele stem umane derivate din adipos (ADSC) demonstrează o biocompatibilitate excelentă cu schela coll-CS. Utilizarea unei schele activate de gene pro-angiogenice a îmbunătățit și mai mult răspunsurile regenerative ale ADSC-urilor.30]. Cu toate acestea, ADSC-urile tind să-și piardă stăpânirea la expansiune [31]. Anterior, am descoperit că o proteină anti-îmbătrânire -Klotho ar putea îmbunătăți semnificativ proliferarea ADSC-urilor umane sănătoase și diabetice [32]. Majoritatea studiilor folosesc în general varianta primară -Klotho [33–35] și au arătat că proteina poate crește durata de viață a ADSC-urilor prin activarea activității transcripționale a telomerazei.33]. - S-a constatat, de asemenea, că MSC-urile care supraexprimă Klotho exercită efecte anti-fibrotice puternice în leziunile renale prin inhibarea Wnt/ - semnalizare catenină [36]. Cu toate acestea, rolul de -Klotho în celulele stem rămâne relativ neexplorat.

Pe lângă diferența în focalizarea cercetării dintre - și -Klotho, anti-îmbătrânireProteinele Klotho nu au fost încă pe deplin încorporate în strategiile de inginerie tisularăpentru vindecarea rănilor. Prin urmare, în acest studiu, am căutat să studiem impactul funcțional al a -Schifod activat de gena Klotho pe ADSC-uri umane pentru aplicații de vindecare a rănilor. Noia investigat mai întâi activitățile transcripționale ale factorilor de pluripotență clasici (oct-4,Nanog și Sox-2), marker de proliferare (Ki-67) și regulatori de vindecare a rănilor (TGF- 3 și TGF- 1) în ADSC-uri. Apoi am evaluat bioactivitatea mediului condiționatgenerat de schela activată cu gene încărcate de ADSC pentru a evalua potențialul său paracrin.În cele din urmă, am examinat regenerarea membranei bazale (fibronectină, laminină,și colagen IV) și proteine ​​asociate cicatricilor ( -SMA și elastina) în ADSC-uri încărcateschelă activată de gene pentru a evalua maturarea controlată a țesuturilor.

2. Rezultate

2.1. - Scaffoldul activat de gena Klotho îmbunătățește tranzitoriu tulpina ADSC-urilor umane și genele pro-reparative

Analiza expresiei genelor a arătat mai întâi că ADSC-urile de pe schela activată de genă au supraexprimat -Gena Klotho peste 172-ori (p < 0.01) than the gene-free scaffold group on day 3 (Figure 1A). Această descoperire a confirmat interacțiunea eficientă a ADSC-urilor cu schela activată de genă. Analiza markerului de proliferare Ki-67 a confirmat în continuare că ADSC-urile de pe schela activată de genă au menținut, de asemenea, o capacitate de proliferare robustă timp de 14 zile (Figura1A). După ce s-a confirmat supraexpresia anti-îmbătrânire -Gena Klotho, am evaluat apoi întinerirea celulelor stem prin activarea factorilor de „pluripotență” în ADSC. În general, am observat o reglare tranzitorie a tuturor celor trei factori de transcripție pe parcursul celor 14 zile (Figura1B). Cu toate acestea, ADSC-urile au arătat doar o creștere semnificativă a expresiei genei Oct-4 care a fost susținută până în ziua 14. Mai exact, ADSC-urile au prezentat o creștere de 2.5-ori (p < 0.05) increase in the expression of the Oct-4 gene on day 3 before subsiding to 1.6-fold (p < 0.05) on day 14 relative to the gene-free scaffold group. The next set of genes we investigated were the transforming growth factors beta 1 and 3, which are crucial for regulating scarless wound healing (Figure 1C). Nivelurile TGF-ului profibrotic 1 genă în -ADSC-urile care supraexprimă Klotho s-au dovedit a fi la egalitate cu cea a grupului de schele fără gene pe parcursul celor 14 zile. Cu toate acestea, nivelurile de TGF antifibrotic 3 au fost semnificativ (3.6-ori,p < 0.05) elevated during the early days (day 3) and, as anticipated, subsided by about 0.4-fold by day 14, showing a controlled expression of the regulatory gene. 

2.2. - Schela activată de gena Klotho

Îmbunătățește potența paracrină a ADSC-urilor umane2.2.1. Bioactivitate pro-angiogenică Testul de bioactivitate al CM generat de schele activate cu gene încărcate de ADSC-uri a arătat mai întâi că ar putea controla temporar activitatea metabolică în HUVEC. Ziua 3 CM a îmbunătățit semnificativ activitatea metabolică în HUVEC, în timp ce utilizarea CM în vârstă din ziua 14 a redus semnificativ activitatea metabolică a HUVEC (Figura2A). După ce am observat acest lucru, am testat apoi impactul pro-angiogenic al CM din zilele 3 și 14 asupra HUVEC-urilor însămânțate pe Matrigel. După cum era de așteptat, ziua 3 CM din grupul de schele activat de genă în mod semnificativ (p < 0.05) enhanced HUVEC tubule formation capacity and their branching (Figure 2B). Cu toate acestea, nu a avut loc o creștere suplimentară a activității angiogene cu ziua 14 CM comparativ cu cea din ziua 3 CM. De asemenea, ziua 14 CM din ambele grupuri a prezentat o eficiență pro-angiogenică similară (Figura2C). În mod colectiv, descoperirea noastră indică faptul că schela activată de genă accelerează tranzitoriu răspunsul pro-angiogenic al ADSC.

TGF pro-fibrotic- 1. ** și * indicăp < 0.01 and p < 0.05 respectively. Data represent mean ± deviație standard (n = 3).

Figura 2. Bioactivitatea paracrină pro-angiogenică a scheletului CM activat cu gene încărcate de ADSC. (A) CM produs de schele activate cu gene încărcate de ADSC-uri pe parcursul celor 14 zile au demonstrat capacitatea de a controla temporar activitatea metabolică a HUVEC. (B) Ziua 3 CM din grupul de schelă activată de genă a îmbunătățit semnificativ formarea tubulilor endoteliali și ramificarea acestuia în comparație cu cea a grupului de schelă fără gene. (C) Formarea tubulilor și ramificarea celulelor endoteliale la 6 h după expunerea la CM din ADSC-uri schelă activată de genă însămânțată și fără genă, * indică p < 0.05. Datele reprezintă medii! abatere standard (n=3)

2.2.2. Vindecarea și maturarea fibroblastelor dermice

Una dintre concluziile studiului de angiogeneză este că, pe măsură ce schela activată cu gene încărcate de ADSC se maturizează, nu mai promovează angiogeneza. În plus, în ziua 14, potența lor angiogenă a fost similară cu cea a grupului de schele fără gene (Figura 2B, C). Prin urmare, am investigat influența zilei în vârstă de 14 CM asupra închiderii plăgii fibroblastelor dermice. Similar cu rezultatul studiului de angiogeneză, ambele grupuri au demonstrat niveluri similare de închidere a plăgii fibroblastice în ziua 14 CM. Mai exact, ambele grupuri au vindecat rana cu aproximativ 40% în 12 ore (Figura 3A). Această descoperire a arătat că în timpul maturării, grupul de schele activat de genă susține, dar nu promovează închiderea plăgii fibroblastelor dermice.

Cu toate acestea, deoarece fibroblastele au fost stimulate cu CM în vârstă, am studiat dacă influențele exprimării proteinelor matricei implicate în maturarea plăgii. După cum era anticipat, fibroblastele dermice stimulate cu CM din grupul de schele fără gene au exprimat din abundență proteina colagen I pro-fibrotic (Figura 3B). Dimpotrivă, fibroblastele stimulate cu CM din grupul de schelă activată de genă au demonstrat o expresie cu 50 procente mai mică (p < 0,05) a proteinei colagenului I. Între timp, ambelor grupuri le lipsea expresia colagenului anti-fibrotic și nu s-au observat diferențe între cele două grupuri. Luate împreună, implică faptul că schela activată de genă îmbunătățește răspunsul modulator al plăgii ADSC în timpul maturării.

Figura 3. Influența paracrină asupra vindecării și maturizării dermice. (A) Ziua în vârstă de 14 CM din ambele grupuri au exercitat niveluri similare de activitate de închidere a rănilor în fibroblastele dermice adulte umane cu aproximativ 40 procente în 12 ore. (B) CM din schela activată de genă a redus semnificativ expresia de colagen pro-fibrotic pe fibroblaste. " indică p < 0,05 Datele reprezintă media=abaterea standard (n=3). În Figura 3B, GAS și GFS reprezintă schelă activată de genă și, respectiv, schelă fără genă

2.3. Scaffoldul activat de gena B-Klotho îmbunătățește regenerarea membranei de subsol cu ​​un răspuns anti-fibrotic îmbunătățit în ADSC-urile umane

După ce am observat stimularea controlată a schelei activate de gene a funcționalității ADSC-urilor, în cele din urmă am investigat răspunsul ADSC-urilor la regenerarea matricelor și proteinelor dermice. Schela activată de genă a îmbunătățit puternic regenerarea membranei bazale a ADSC. În mod specific, schela activată de genă a promovat în mod semnificativ depunerea componentelor membranei bazale laminină și colagen IVFigura 4A). După analiza semi-cantitativă, am observat, de asemenea, că depunerea matricei a urmat o tendință în raport cu grupul de schele fără gene. Tendința observată a fost fibronectina (1,0-ori) < laminină (2,1-ori, p < {{1{0}}.05) < colagen IV (8.8-ori, p < 0,01). Odată ce a fost determinată capacitatea de regenerare a membranei bazale, am evaluat apoi expresia proteinelor esențiale pentru vindecarea calitativă superioară, cum ar fi cicatrizarea redusă. ADSC-urile de pe schela activată de genă au demonstrat o expresie semnificativ redusă (p < 0,05) a proteinei contractile a-SMA asociate cu cicatrice. Expresia a-SMA în ADSC-uri a fost mai mică cu 50 la sută față de grupul de schelă fără gene (Figura 4B). În cele din urmă, după ce am observat expresia redusă a-SMA, am evaluat expresia elastinei proteinei matricei elastice. ADSC-urile de pe schela activată de genă au demonstrat o expresie calitativă relativ superioară a elastinei prin depunerea unei rețele fibroase mature de elastină în comparație cu ADSC-urile de pe schela fără genă (Figura 4B).

Figura 4. Depunerea proteinelor matricei de vindecare a rănilor de către ADSC-uri în schela activată de genă în ziua 14. (A) ADSC-urile din schela activată de genă au demonstrat o regenerare semnificativă. funcționarea membranei bazale în comparație cu ADSC-urile din schela fără gene. ADSC-urile au depus în principal o rețea relativ matură de proteine ​​de colagen IV, urmate de laminină și fibronectină. (B) ADSC-urile din schela activată de genă au exprimat, de asemenea, de 2-ori mai puțin proteina SMA în comparație cu ADSC-urile din genă. -schela liberă. În legătură cu subsol mem. regenerarea branelor, ADSC-urile din schela activată de genă au depus o matrice elastică calitativ mai bună. Toate imaginile au fost capturate printr-un obiectiv de 20x folosind un microscop Olympus IX73* și * indică p < 0.01 și, respectiv, p < 0,05. Bară de scară 50um. Datele reprezintă deviația standard medie (n=3).-SMA și fibronectina au fost dublu imunocolorate.

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950