Potențialul antifungic al metaboliților secundari implicați în interacțiunea dintre agenții patogeni din citrice și Cistanche

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Citricele au un impact important asupra economiei mondiale deoarece au cea mai mare producție în comparație cu alte fructe; de exemplu, producția globală de portocale pentru 2018/19 este estimată să ajungă la 54,3 milioane de tone. Factorul major care afectează calitatea citricelor este postrecoltareaboli fungice,în special, mucegaiul verde cauzat de Penicillium digitatum care este responsabil pentru 90 la sută din pierderile de citrice în perioada postrecoltare1,3. Pentru a controla bolile post-recoltare, fungicidele sintetice sunt utilizate pe scară largă, provocând probleme de sănătate și de mediu. În plus, unele tulpini de ciuperci au dezvoltat rezistență la fungicidele utilizate în mod obișnuit. La fel deantifungicrezistența devine o preocupare semnificativă, căutarea de noi compuși bioactivi are un rol important în a ocoli utilizarea pe scară largă a fungicidelor7. Microorganismele sunt una dintre principalele surse de produse naturale cu activități biologice utile, adică potențialeantifungice, antibiotice, agenți anticancerigen, agenți tensioactivi. Cu toate acestea, pe lângă potențialul genetic și diversitatea microbilor, multe gene microbiene biosintetice nu sunt activate în condițiile nenaturale de cultivare utilizate în laborator și doar câteva părți ale metaboliților sunt accesibile10. Sunt implementate mai multe strategii pentru a depăși limitările în descoperirea produselor naturale din surse microbiene, adică abordarea OSMAC10,11, utilizarea modificărilor epigenetice și co-cultivarea14. Co-culturile care imită mediile naturale, manifestând competiție microbiană pentru spațiu limitat și nutrienți, s-au dovedit a fi o forță ecologică majoră care ar putea activa grupuri de gene tăcute și mecanisme de apărare care pot duce la producerea de metaboliți secundari bioactivi. 1 Institutul de Chimie, Universitatea Campinas, CP 6154, 13083-970, Campinas, SP, Brazilia. 2 Centrul pentru Științe Naturale și Umane, Universitatea Federală ABC, 09210-580, Santo André, SP, Brazilia. 3Departamentul de Chimie Biomoleculară, Institutul Leibniz pentru Cercetarea Produselor Naturale și Biologia Infecțiilor – Institutul Hans Knöll, Jena, Germania. 4Catedră de chimie a produselor naturale, Universitatea Friedrich Schiller Jena, 07743, Jena, Germania. relevante pentru a permite nu numai identificarea de noi compuși, ci și pentru investigarea evenimentelor chimice care guvernează interacțiunile dintre microorganismele din natură. Până în prezent, nu există informații despre modul în care ciupercile patogene din citrice interacționează cu alte microorganisme din același mediu și care sunt mecanismele de atac și apărare împotriva microorganismelor endofitice sau a altor fitopatogeni. Aceste informații pot duce la descoperirea de noi metaboliți secundari implicați în interacțiunile microbiene și pot oferi mai multe cunoștințe despre importanța ecologiei microbiene în timpul procesului de infecție. Aici arătăm o interacțiune între Penicillium digitatum și Penicillium citrinum, cu scopul de a căuta noiantifungiccompuși care ar putea fi utilizați pentru a controla bolile post-recoltare. Având în vedere acest scop, strategia de co-cultură și MSI au fost aplicate pentru a induce producția de metaboliți secundari și pentru a oferi informații inițiale cu privire la rolul lor biologic pe baza distribuției lor spațiale în interacțiune. Metaboliții de interes au fost izolați și toate structurile au fost elucidate pe baza experimentelor de spectrometrie de masă și RMN. Inca,antifungicau fost efectuate teste și analize de microscopie confocală pentru a investiga potențialul metaboliților fungici ca noi.antifungicagenţi.

CISTANCĂ DE IRBĂ

Materiale și metode

Cultura ciupercilor.Tulpina P. digitatum (PD) utilizată în studii este depusă la Colecția Spaniolă de Cultură de Tip (CECT) sub codul de acces CECT20796. Tulpina P. citrinum (PC) a fost furnizată de Sylvio Moreira Citrus Center (Cordeirópolis, SP, Brazilia). P. digitatum și P. citrinum au fost cultivate pe agar comercial dextroză de cartofi (PDA) (Acumedia). PDA a fost autoclavat la 103 KPa (121 grade) timp de 15 minute. Plăcile PDA au fost păstrate la 25 de grade timp de 7 zile în întuneric. Sporii au fost recoltați prin spălarea suprafeței de agar cu apă distilată sterilă și diluarea la o concentrație finală de 106 sau 105 spori ml-1.

Condițiile de creștere în co-cultura fungice soluția de spori (106 spori mL-1) a fost inoculată, pe părțile opuse. Plăcile au fost incubate în întuneric la 25 de grade timp de 7 zile.

Pentru analizele MSI și microscopia confocală, co-cultura in vitro a fost preparată prin plasarea unei lame de microscop steril în placa Petri, urmată de turnarea a 11 ml de PDA22, iar inoculurile au fost făcute deasupra lamei de microscop. Plăcile au fost incubate în întuneric la 25 de grade timp de 72 de ore. Pentru co-cultura in vivo, portocalele mature (Citrus sinensis) au fost sterilizate la suprafață și rănite23. O bucată mică de PDA care conține P. citrinum a fost inoculată în locul plăgii. Portocalele infectate și de control au fost păstrate în pahare sterile de 500 ml, la întuneric la 25 de grade. După 10 zile, fructele au fost rănite pe regiunea ecuatorială opusă a inoculului de P. citrinum și infectate cu soluție de 106 spori mL-1 de P. digitatum. Fructele au fost păstrate mai mult de 5 zile în întuneric la 25 de grade.

Analiza MSI (Mass Spectrometry Imaging) și generarea de imagini MS.

După perioada de incubare, lamelele de microscop au fost îndepărtate din vasele Petri și puse într-un desicator cu vid, timp de 1 oră, pentru deshidratarea completă a agarului (Angolini și colab., 2015). Analizele MSI au fost efectuate direct pe microscopul care conține co-cultura, în mod pozitiv, folosind o sursă de ionizare electrospray de desorbție (DESI) Prosolia Model Omni Spray 2D®-3201) cuplată la un Thermo Scientific QExactive® Hybrid Quadrupole-Orbitrap Spectrometru de masă. Datele MSI au fost achiziționate cu o putere de rezoluție în masă de 70.000 la m/z 200. Configurația DESI utilizată a fost aceeași stabilită de lucrarea anterioară22. Imaginile au fost generate cu o lățime de bin de Δm/z=± 0,07 folosind software-ul de conversie a datelor Firefly (versiunea 2.1.05) și procesate folosind software-ul BioMap (versiunea 3.8.0.4) dezvoltat de Novartis Institutes for BioMedical Research. În BioMap, scalarea culorilor a fost ajustată la o valoare fixă ​​în timpul procesării fiecărei imagini. Spectrele MS au fost procesate cu software-ul Xcalibur (versiunea 3.0.63) dezvoltat de Thermo Fisher Scientific.

Extragerea metaboliților din experimentele de co-cultură.

Întregul conținut al coculturii in vitro a fost tăiat în bucăți mici și transferat într-un balon Erlenmeyer. Extracția a fost efectuată folosind metanol. Baloanele au fost supuse cu ultrasunete timp de 1 oră într-o baie cu ultrasunete și filtrate în vid. Solventul a fost îndepărtat sub presiune redusă și extractul final a fost depozitat la -20 grade.

Pentru co-cultura in vivo, cojile de portocală au fost tăiate (2 cm×2 cm) în zona de interfață dintre microorganisme și extracția a fost efectuată cu 5 ml de metanol timp de 1 oră în baia cu ultrasunete. Extractele au fost filtrate, uscate sub N2 și depozitate la -20 grade.

Analiza prin spectrometrie de masă (MS).

Extractele au fost diluate în metanol și analizate pe un spectrometru de masă Thermo Scientific QExactive® Hybrid Quadrupole-Orbitrap. Analizele au fost efectuate în modul pozitiv cu un interval m/z de 115–1500, tensiunea capilară de 3,4 kV, temperatura capilară de intrare de 280 grade, lentilă S 100V. S-au injectat 5 uL din probă. Faza staționară: Coloana Termo Scientific Accucore C18 2.6 µm (2.1mm×100mm). Faza mobilă: 0,1% acid formic (A) și acetonitril (B). Profil de eluent (A/B): 95/5 până la 2/98 în 15 minute, țineți apăsat timp de 5 minute, până la 95/5 în 1,2 minute și țineți apăsat timp de 7,8 minute. Timpul total de rulare a fost de 29 de minute pentru fiecare cursă, iar debitul a fost de 0,2 mLmin-1. Volumul de injectare: 5 µL.MS/MS a fost efectuat prin disociere indusă de coliziune (CID) cu un interval m/z de 100-800 și energia de coliziune a variat de la 10 la 50V. Probele au fost infuzate direct prin electrospray cu un debit de 5,0 µL min-1. Datele MS și MS/MS au fost procesate cu software-ul Xcalibur (versiunea 3.0.63) dezvoltat de Thermo Fisher Scientific.

BENEFICIAȚI SUPLIMENTUL CISTANCHE: ÎMBUNĂȚĂȚI IMUNITATEA

Separarea metaboliților (analiza HPLC).

Separările metaboliților secundari au fost realizate utilizând o coloană Phenomenex Luna 5µm Phenyl-Hexyl (25{{10}}×4,6 mm) și un SHIMADZU HPLC LC-20AT, echipat cu CBM{{6} }Un modul magistrală de comunicații, un detector de matrice de fotodiode SPD-M20A și SIL-20Un autosampler. Faza mobilă: apă (0,1% acid formic) (A) și acetonitril (B). Profil eluant (A/B): 65/35 până la 50/50 în 50 min, până la 40/60 în 20 min. Timpul total de rulare a fost de 70 min și debitul de 1,0 ml min-1. Volumul de injectare a fost de 5 uL. Purificarea HPLC preparativă a fost efectuată pe o coloană Phenomenex Luna 5 um Phenyl-Hexyl (250 x 10 mm) utilizând o pompă HPLC binară Waters 1525 echipată cu detector de matrice fotodiode Waters 2998 și colector de fracțiuni Waters III folosind aceleași condiții de gradient optimizate. Debitul a fost stabilit la 4,7 mLmin-1 și volumul de injecție a fost de 200 µL.

Spectroscopie RMN.

Experimentele 1H RMN, 13C RMN și 2D au fost efectuate pe un Bruker Avance III 500 (1H 500,13MHz și 13C 125,7MHz) și Bruker Avance III 600 (1H 600,17MHz). Cloroformul deuterat (CDC13; 7,23 ppm), dimetil sulfoxid (DMSO; 2,50 ppm și 39,51 ppm) și tetrametilsilan (TMS; 0,0 ppm) au fost utilizați ca solvent și referință internă. Deplasările chimice (δ) au fost exprimate în (ppm) iar constantele de cuplare (J) în Hertzi (Hz).

Analiza rețelelor moleculare.

O rețea moleculară pentru metaboliții P. citrinum a fost creată folosind fluxul de lucru online la Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) (http://gnps.ucsd.edu). Datele au fost filtrate prin eliminarea tuturor vârfurilor MS/MS în plus /-17 Da din precursorul m/z. Spectrele MS/MS au fost filtrate prin fereastră alegând numai primele 6 vârfuri din fereastra plus /−50Da pe tot spectrul. Datele au fost apoi grupate cu MS-Cluster cu o toleranță de masă părinte de 0.2 Da și o toleranță de ioni de fragment MS/MS de 0.2Da pentru a crea spectre de consens. În plus, spectrele de consens care au conținut mai puțin de 2 spectre au fost aruncate. Apoi a fost creată o rețea în care marginile au fost filtrate pentru a avea un scor cosinus peste 0,65 și mai mult de 2 vârfuri potrivite. Marginile ulterioare dintre două noduri au fost păstrate în rețea numai dacă fiecare dintre noduri a apărut în topul celorlalte 10 cele mai asemănătoare noduri. Spectrele din rețea au fost apoi căutate în bibliotecile spectrale ale GNPS. Spectrele bibliotecii au fost filtrate în același mod ca și datele de intrare. Toate potrivirile păstrate între spectrele de rețea și spectrele bibliotecii trebuiau să aibă un scor peste 0,5 și cel puțin 5 vârfuri potrivite.

Teste antifungice.

O soluție stoc a extractului de cocultură a fost preparată în metanol și diluată în continuare în PDA la concentrația de 0.5 mgmL-1. 15 ml din soluția rezultată au fost turnați într-un vas Petri, urmat de inocularea a 15 ul dintr-o soluție de 105 spori ml-1 P. digitatum pe centrul plăcii de agar. De asemenea, a fost efectuat un test de control. Plăcile au fost incubate în întuneric la 25 de grade timp de 96 de ore. Pentruantifungicteste, 2,5 ml de PDA au fost suplimentați cu 6, 9 și 10 (400 pgmL-1) și fiecare soluție a fost turnată într-o microplacă 6-godeu. 5 ul dintr-o soluție de 105 spori ml-1 P. digitatum au fost inoculate pe centrul fiecărei plăci de agar. Controalele negative au fost efectuate în trei exemplare. Microplaca a fost incubată în întuneric la 25 de grade timp de 96 de ore. Pentru determinarea concentrației minime inhibitorii (MIC) a compușilor 1 și 4, a fost efectuat un test de microdiluare a bulionului conform recomandărilor Clinical and Laboratory Standards Institute (2008)24 cu puține modificări. Soluțiile stoc de 1 și 4 au fost preparate în apă (5 procente metanol) și diluate în continuare în mediu YES într-un interval de concentrații de la 600 ug ml-1 la 1 ug ml-1. 195 ul din fiecare soluție au fost transferați pe o microplacă de 96-godeuri, urmată de inocularea a 5 ul dintr-o soluție de 105 spori ml-1 P. digitatum. Testele au fost făcute în dublu exemplar, iar controalele în trei exemplare. Itraconazolul (100 ugmL-1) a fost utilizat ca martor pozitiv. S-au efectuat controale negative cu metanol în DA. Microplăcile au fost incubate în întuneric la 25 de grade timp de 96 de ore.

Microscopie confocală cu scanare cu laser.

După perioada de incubare, lamelele microscoapelor au fost îndepărtate din placa Petri. Probele de cocultură in vitro au fost colorate cu roșu Congo (0,25% g/v în apă) timp de 20 de minute și spălate pentru scurt timp în apă distilată. Probele au fost analizate cu un microscop Leica TCS SP5. Excitația a fost de către linia de emisie de 543 nm a laserului He-Ne și a fost colectată lumina emisă între 570 și 680 nm.

BENEFICIUCISTANCHE: ÎMBUNĂTĂȚI IMUNITATEA

Rezultate si discutii

MSI dezvăluie potențiale antifungice în interacțiunea dintre P. digitatum și P. citrinum.

Pentru a căuta noiantifungiccompuși cu potențial de a proteja citricele și de a controla bolile postrecoltare, am aplicat o strategie de co-cultură care implică P. digitatum și un alt agent patogen al citricelor, P. citrinum. Co-cultura este o strategie inspirată din natură în care competiția dintre microorganisme poate induce producerea de noi metaboliți. În lucrările anterioare, co-cultivarea dintre Trichophyton rubrum și Bionectria ochroleuca a indus producerea unui nou analog sulfatat al PS-990, sugerând că acest compus este sulfatat în continuare în timpul interacțiunii fungice26. De asemenea, un alt exemplu de compus derivat din interacțiunea cu ciuperci este tetrapeptida ciclo-(L-leucil-trans-4-hidroxi-L-prolil-D-leucil-trans{-4-hidroxi-L-prolină) izolată din bulionul de cocultură de Phomopsis sp. K38 și Alternaria sp. E33; tetrapeptida ciclică a prezentat activitate inhibitorie moderată până la mare împotriva ciupercilor fitopatogeni în comparație cu fungicidul comercial triadimefon27. Astfel, experimentele de co-cultivare reprezintă o abordare viabilă pentru a găsi compuși care pot inhiba principalii fitopatogeni din citrice, în special, mucegaiul verde cauzat de P. digitatum.

În co-cultivarea efectuată atât în ​​mediul portocaliu (in vivo) cât și în mediul sintetic (in vitro) am observat vizual o inhibare a creșterii la distanță lungă între P. citrinum și P. digitatum. Într-o interacțiune cu ciuperci, genele silențioase pot fi activate și metaboliții dăunători pot fi dezamorzați de la un partener la altul16,28. Metaboliții induși de tese sunt de obicei localizați în zona de confruntare în medii solide de co-culturi16. Cu toate acestea, abordările obișnuite utilizate pentru detectarea și elucidarea metaboliților, cum ar fi spectrometria de masă cuplată la cromatografia lichidă (LC-MS) sau gazoasă (GC-MS) nu oferă informații despre distribuția spațială a moleculelor.

Informațiile despre distribuția spațială moleculară pot fi obținute prin imagistica prin spectrometrie de masă (MSI), un instrument puternic care generează imagini pentru fiecare ion detectat în spectrul de masă16. Utilizarea MSI pentru a înțelege sistemele microbiene și metaboliții lor secundari nu este nouă, iar studiile în care această tehnică a fost aplicată cu succes pot fi găsite în literatură30. De exemplu, MSI a fost aplicat pentru a investiga interacțiunea dintre Bacillus subtilis 3610 și Streptomyces coelicolor A3. Imagistica DESI a coculturii bacteriene a dezvăluit 57 de semnale localizate spațial în coloniile bacteriene, ceea ce a condus la identificarea unor metaboliți secundari, cum ar fi surfactina și plipastatin31. Mai mult, analiza MSI a mai arătat că S. coelicolor are producerea anumitor metaboliți secundari inhibată în prezența B. subtilis, dezvăluind o interacțiune între bacterii31.

Prin urmare, pentru a detecta metaboliții secundari implicați în interacțiunea dintre agenții patogeni din citrice, am aplicat DESI-MSI direct pe suprafața agarului de cocultură, pentru a vizualiza difuzia compușilor în zona de confruntare. Semnalele MSI au fost obținute pentru ionii [M plus H] plus la m/z 519,1857, m/z 503,1908, m/z 475,1590, m/z 460,1960, m/z 459,1645, m/z 625,3942, m/z 609, m/z 609, m/z z 527,2862, m/z 511,2894 şi m/z 448,2938 (Figurile S1-S10). Am observat că toți ionii menționați au fost detectați și concentrați în zona de confruntare dintre ciuperci (Fig. 1). Acești compuși pot fi legați de interacțiunea ciupercă-ciupercă și ar putea fi agenți antimicrobieni potențial noi. Ionii la m/z 625, 609, 527, 511 și 448 au fost produși de P. citrinum, în timp ce ionii la m/z 519, 503, 475, 460 și 459, păreau a fi un contraatac al lui P. digitatum , dezvăluind războiul chimic între acești doi agenți patogeni din citrice. Ionii detectați in vitro prin analizele MSI au fost detectați și în extractele co-culturii in vivo (Fig. S11–S20) folosind portocale ca substrat (Fig. 2).

Pentru a caracteriza metaboliții implicați în interacțiune, a fost obținut un extract de cocultură dintr-un experiment de cultivare la scară și compușii de interes, detectați inițial prin analize MSI, au fost izolați prin HPLC preparativă și caracterizați prin spectrometrie de masă în tandem și analize RMN.

Prin masele exacte obținute prin analizele DESI-MSI (Tabelul 1), a fost posibilă confirmarea prezenței alcaloizilor indolici produși de P. digitatum. Ioni [M plus H] plus la m/z 519,1857, m/z 503,1908, m/z 475,1590, m/z 460,1960 și m/z 459,1645 care corespund respectiv triptoquialaninei A (1), triptoquialaninei (2), triptoquialaninei (2), triptoquialaninei (2). 3), 15-dimetil-2-epi-fumichinazolina A (4) și deoxitriptoquialanona (5) (structuri chimice reprezentate în Fig. 3). Acești compuși fac parte din calea biosintetică a triptoquialaninelor32 și au fost detectați anterior în timpul analizei DESI-MSI a portocalelor infectate cu boala mucegaiului verde23. Compusul 1 a fost raportat ca metabolit secundar major produs de P. digitatum33. Cu toate acestea, ștergerea acelei gene, responsabilă de reglarea biosintezei 1, a arătat că 1 nu este implicat în patogenitatea P. digitatum împotriva citricelor, deoarece capacitatea de infecție a mutanților nu a fost modificată34. Rolul biologic exact al triptoquialaninelor este încă necunoscut34 și acest studiu oferă o nouă activitate biologică a triptoquialaninelor cu implicarea acestor alcaloizi în interacțiunea fungică. MS/MS ionului [M plus H] plus la m/z 625,3951 a dat la fragmente la m/z 594,3533, 576,3427, 449,2430 și 431,2325 (Fig. S21), același model de fragmentare obținut pentru cirinină A (6) într-un studiu care implică cocultură între P. citrinum și Pseudoalteromonas sp. OT5919. De asemenea, baza de date GNPS a sugerat că ionul la m/z 625 ar putea fi citrinină A. Spectrul de masă în tandem obținut pentru acest compus a împărtășit cinci fragmente în comun cu spectrul de masă în tandem de 6 depus în baza de date (Fig. S22). În plus, împărtășește un model de fragmentare MS/MS similar cu citrinina A raportată de Moree și colab. (2014). Citrinadinele au fost raportate ca fiind mai produse în situații de co-cultură și concentrate în interfețele de co-cultură, sugerând un răspuns defensiv al P. citrinum împotriva altor microorganisme. Analiza rețelelor moleculare a compușilor izolați a arătat că o altă citrină este implicată în co-cultură. interacţiune. Am observat că ionul la m/z 609, detectat inițial prin analiza MSI, este grupat în același grup de compus 6 (m/z 625) (Fig. S23), sugerând că acest compus este un metabolit asemănător cirininei. Într-o analiză a rețelelor moleculare, metaboliții înrudiți sunt grupați în aceleași grupuri, deoarece au un spectru MS/MS similar.

Masa exactă obținută pentru ionul [M plus H] plus la m/z 609,4010 corespunde unui compus cu formula moleculară C35H53N4O5. Modelul de fragmentare a dat fragmente la m/z 578,3583, 464,2905, 451,2586 și 433,2482 (Fig. S24 suplimentară). Spectrele 1H RMN și 1H-1H COZY obținute pentru metabolitul purificat (Figurile S25–S26 și Tabelul S1) au prezentat semnale similare ale unei deoxicitrinadine A sintetizate care a fost raportată de Bian și colab. (2013)37. Semnalul caracteristic epoxid la δH 4,0 a fost absent în acest derivat și un semnal pentru hidrogen vinilic a putut fi observat la δH 6,9, indicând lipsa grupării epoxid și prezența unei duble legături în comparație cu cirinina A37. Este prima dată când deoxicitrinadina A (7) este raportată în literatură ca metabolit secundar produs de un microorganism.

Masele exacte obținute prin DESI-MSI pentru ionii [M plus H] plus la m/z 527,2862 și 511,2894 au indicat compuși cu compoziția elementară de C28H38N4O6 și, respectiv, C28H38N4O5. MS/MS a arătat că ionul la m/z 511 are o structură similară în comparație cu m/z 527, cu excepția absenței unui atom de oxigen. Fragmentarea ionului la m/z 527 a condus la fragmentele m/z 281, 247, 219, 182 și 120 (Fig. S27), în timp ce ionul la m/z 511 a dat la m/z 265, 247, 219, 166 , și 120 (Fig. S30). Același model de fragmentare a fost raportat pentru secvența tetrapeptidelor Phe-Val-Val-Tyr (8) din Penicillium canescens. Cu toate acestea, tetrapeptidele 8 și Phe-Val-Val-Phe (9) au fost raportate recent ca metaboliți secundari produși de Penicillium roqueforti. Analizele 1H și 13C RMN ale compușilor izolați (Figurile S28–S32 și Tabelele S2-S3) au confirmat rezultatele obținute prin MS/MS, concluzionand că ionii la m/z 527 și m/z 511 corespund cu 8 și, respectiv, 9. Producerea acestor tetrapeptide în războiul chimic fungic nu este surprinzătoare, deoarece peptidele mici sunt cunoscute pentru activitatea lor antimicrobiană40. Acesta este primul raport de 8 și 9 ca metaboliți secundari ai P. citrinum. Pentru ion [M plus H] plus la m/z 448,2938, masa exactă a sugerat un compus cu formula moleculară C28H38N3O2, aceeași compoziție a metabolitului secundar crisogenamidă A (10) (eroare=-4,6 ppm). Compusul 10 a fost izolat și analizele 1H și 13C RMN (Figurile S33–S34 și Tabelul S4) i-au confirmat structura; este primul raport că crisogenamida A este implicată într-o interacțiune fungică. Compusul 10 a fost raportat pentru prima dată ca un metabolit secundar al Penicillium chrysogenum nr. 005, o ciupercă endofitică asociată cu planta.Cistanche deserticola. De asemenea, 10 a fost raportat ca metabolit secundar al unei tulpini de P. citrinum42. Structurile metaboliților produși de P. citrinum sunt reprezentate în Fig. 4.

Teste antifungice.

Am investigatantifungicactivitatea metaboliților produși în cocultură și P. digitatum a fost inoculată în mediu de agar care conține extract de cocultură. În comparație cu controlul, am observat o reducere de 67 la sută a creșterii radiale a P. digitatum (Fig. S35), indicând faptul că metaboliții implicați în războiul fungic au potențial ca agenți antifungici. Pentru a confirma această ipoteză, am testat compușii izolați și am observat că compușii 6, 9 și 10 (400 µg mL-1) au redus cu 48%, 41% și, respectiv, 61% din creșterea radială a P. digitatum, în comparație cu martor. (Fig. 5), confirmând activitatea antifungică. S-a constatat că citrinadinele sunt implicate în răspunsul P. citrinum împotriva altor microorganisme în co-culturi, dar rolul lor biologic în mediile biologice este încă necunoscut până în prezent19. Compusul 6 a fost testat pentru activitatea ulcerului Anti-Buruli pe Mycobacterium ulcerans MN209, dar nu a fost observată nicio MIC interesantă43; de asemenea, a fost raportată activitatea de citotoxicitate a 6 împotriva celulelor leucemie și carcinom44. Rezultatele noastre sunt primul raport al activității antimicrobiene a citrinadinelor din literatură și pot oferi primele informații despre rolul biologic al acestor compuși în interacțiunile fungico-fungice. În plus, crisogenamida A nu a fost niciodată raportată ca agent antimicrobian până în prezent. Compusul 10 a prezentat un efect protector asupra neurocitelor împotriva morții celulare induse de stres oxidativ41, cu toate acestea, nu a fost raportată nicio altă activitate biologică pentru 10 în literatură. Testele antifungice care aplică D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr au arătat că această tetrapeptidă are activitate inhibitoare împotriva subtitlurilor B. și a fitopatogenului din soia Fusarium virguliforme38. În schimb, nicio inhibare a E. coli, B. subtilis și S. cerevisiae în prezența D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr sau D-Phe-L-Val-D-Val-L -Phe a fost observat39. Activitatea antifungică a triptoquialaninelor a fost de asemenea evaluată, deoarece acești compuși păreau a fi un răspuns chimic al P. digitatum împotriva P. citrinum în războiul chimic. Triptoquialaninele 1 și 4 au fost testate și au evidențiat o activitate antifungică împotriva P. citrinum. Compușii 1 și 4 au avut MIC de 300 pgmL-1, inhibând producția de spori de P. citrinum (Fig. S36). Din câte știm, este primul raport al activității antimicrobiene a triptoquialaninelor. Recent, 1 a fost demonstrat ca un compus insecticid împotriva Ae. larve de aegypti23; activitatea antifungică poate oferi o mai bună înțelegere a rolului triptoquialaninelor în mediul citrice-patogen odată ce acești compuși nu sunt necesari pentru virulența P. digitatum.

BENEFICIUCISTANCHE: Anti-bacterian

Războiul chimic modifică peretele celular P. digitatum în co-cultură.

Pentru a investiga acțiunea metaboliților secundari în timpulfungiceinteracțiunea, probele de cocultură au fost colorate cu roșu Congo și observate prin microscopie de scanare laser confocală. Roșu Congo este folosit în mod obișnuit pentru a colora polizaharidele care conțin legături 1,4 ca, de exemplu,fungicecomponenta peretelui celular chitina45,46. Hifele de P. digitatum au fost observate în zona de confruntare (probă) și comparate cu hifele aflate la distanță de regiunea interfeței (martor) (Fig. S37). Hifele de control au fost colorate omogen cu roșu Congo, în timp ce hifele din regiunea de interfață au prezentat un model de colorare modificat (Fig. 6), cu pete neregulate. Modele similare de colorare au fost obținute pentru ciupercile mutante knockout în care genele șterse au avut un rol în organizarea peretelui celular; ca rezultat, mutanții au prezentat pereți celulari defecte și colorare neregulată25,46,47. Cu toate acestea, colorarea anormală cu Calcofluor White a fost observată pentru P. ostreatus P89 tratat cu 36 de grade; distribuția chitinei și integritatea peretelui celular modificate la temperatură înaltă48. Aceste date arată că P. digitatum hyphae, în contact cu metaboliții difuzați în timpul coculturii, au un perete celular defect, deoarece Roșul Congo se leagă de structurile peretelui celular fungic. Peretele celular fungic este o țintă atractivă a antimicrobienelor, deoarece acestea nu sunt prezente în celulele de mamifere49,50. În concluzie, analiza microscopică și testele antifungice întăresc faptul că metaboliții implicați în interacțiunea fungică au potențial caantifungicagenți și poate fi mecanismul în natură pe care acești fitopatogeni l-au dezvoltat pentru a concura cu alte microorganisme pentru gazdă (Fig. 7).

Concluzii

Căutarea de noi antimicrobieni naturali este un domeniu promițător în cercetarea produselor naturale privind impactul economic al bolilor postrecoltare asupra agriculturii la nivel mondial. Mai mult, apariția tulpinilor de ciuperci rezistente la fungicide face descoperirea unor noiantifungicagenți pentru a înlocui compușii sintetici extrem de important. Folosind co-cultivarea între fitopatogeni care concurează pentru aceeași gazdă, P. digitatum și P. citrinum, am observat o interacțiune fungică. Prin tehnica MSI, am detectat metaboliți secundari dezamorsați în zona de interfață dintre microorganisme. Triptoquialaninele, citrinadinele, chirsogenamida A și tetrapeptidele au prezentat o mare activitate antifungică, confirmând că co-culturile și tehnica MSI sunt o combinație bună în căutarea de noi antimicrobieni naturali.

Până la această dată, nu au existat informații despre interacțiunea dintre ciupercile patogene din citrice. Datele noastre au relevat compuși care joacă un rol în ecologia microbiană a citricelor. În plus, am demonstrat că metaboliții studiați au un potențial mare caantifungicagenți deoarece pereții celulari fungici sunt una dintre țintele principale aleantifungiccompuși. Utilizarea compușilor identificați ca antifungice naturale în locul fungicidelor sintetice ar trebui investigată în continuare. Această lucrare deschide noi posibilități de cercetare și contribuie la sănătatea mediului și a omului, ajutând la căutarea unor strategii mai sigure pentru agricultură prin utilizarea compușilor obținuți din surse naturale.

BENEFICIUSUPLIMENT CISTANCHE: ÎMBUNĂTĂȚI IMUNITATEA