Căile dependente și independente de receptorul de hidrocarburi arii arii mediază efectele anti-îmbătrânire ale curcuminei Partea 2

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

2.2.6. Cultivarea EC umană primară

EC primar uman (Lonza, Köln, Germania) a fost cultivat în mediu bazal endotelial complet (EBM) (Lonza, Köln, Germania) suplimentat cu 1 ug/mL hidrocortizon, 12ug/mL extract de creier bovin, 50ug/ ml gentamicină, 10ng/mL factor de creștere epidermică umană și 10% (o/v) ser fetal de vițel la 37 de grade și 5% CO, până la a treia trecere. După detașarea cu 0,05 procente (o/o) Tripsină/EDTA (Thermo Scientific, Schwerte, Germania), celulele au fost cultivate în vase de cultură de 6 cm sau plăci de cultură cu 6 godeuri timp de cel puțin 18 ore înainte de transfecție sau tratament.

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

2.2.7. Transfecția tranzitorie a CE

Celulele au fost transfectate așa cum s-a descris anterior [65]. Pe scurt, EC a fost transfectată utilizând reactiv SuperFectTransfection (Qiagen, Hilden, Germania) conform instrucțiunilor producătorului. Supraexprimarea sau knockdown-ul AhR a fost atins după 24 sau, respectiv, 48 de ore. Eficienţa transfecţiei la supraexpresie a fost de aproximativ 40 %.

2.2.8. Testul de răni zgârieturi de EC

Pentru investigarea capacității de migrare a EC, au fost efectuate teste de zgârietură așa cum s-a descris anterior [66]. În detaliu, rănile au fost plasate într-un monostrat celular cu o racletă celulară de-a lungul unei linii de urmărire. După leziune, celulele neatașate au fost îndepărtate prin spălare blândă.extract de salsa cistancheTratamentul cu curcumină a fost efectuat direct după fixarea plăgii. Cur-chimen a fost dizolvat în DMSO și utilizat la concentrația finală de 7,5 uM. Migrarea EC a fost cuantificată prin colorarea celulelor cu 5 ug/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Carl Roth, Karlsruhe, Germania) în PBS timp de 5 minute după ce celulele au fost fixate cu 4 procente (v/v)paraformaldehidă timp de 15 min la temperatura camerei. Imaginile au fost realizate folosind un microscop fluorescent Zeiss AxioVision Observer D1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germania)) folosind o 200-măsire. Celulele migrate în rană de la linia de urmărire au fost numărate automat utilizând funcția de analiză a particulelor din Image]1.52a]67I după ce nucleele suprapuse au fost separate.

Cistanche poate anti-imbatranire

2.2.9. Imunocolorarea EC

EC a fost fixat cu 4 procente (o/v) paraformaldehidă timp de 15 minute la temperatura camerei. După permeabilizare și blocare în 0,3% (o/o)Triton-X 100 și 3% (o/u)ser de capră normal în PBS, celulele au fost incubate cu un anticorp de iepure împotriva AhR(1:100, Abcam, Cambridge, Regatul Unit) sau Nrf2 (clona D1Z9C, 1:100, Cell Signaling Technology, Frankfurt, Germania) diluat în 1% (o/v) ser normal de capră în PBS peste noapte la 4 C. Apoi, celulele au fost spălate cu PBS și incubat cu un IgG anti-iepure de capră cuplat Alexa 594-(1:500, Invitrogen, Darmstadt, Germania) timp de 1 oră la temperatura camerei.cistanche stemPentru colorarea cu actină, celulele au fost incubate cu Alexa FluorTM 488 Phalloidin (1:70, Invitrogen, Darmstadt, Germania) timp de 20 de minute la temperatura camerei. Nucleii au fost contracolorați cu 0,5 ug/mL DAPI în PBS timp de 5 minute la temperatura camerei și celulele au fost montate cu ProLong'MDiamond Antifade Mountant (Invitrogen, Darmstadt, Germania). Imaginile fluorescente au fost realizate folosind un microscop fluorescent Zeiss AxioVision Observer D1, cu o mărire de 400× sau 200×.

2.2.10. qPCR în celule

ARN-ul celular total a fost izolat prin combinarea lizei în TRIzolTM cu procesarea în aval folosind Kit-ul RNeasy Mini (Qiagen (Hilden, Germania)) conform instrucțiunilor producătorului. Sinteza cADN-ului a fost efectuată utilizând kitul de transcripție inversă QuantiTect9 (Qiagen （Hilden, Germania)）cu 1 ug ARN conform instrucțiunilor producătorului. Nivelurile relative de transcriere au fost determinate prin PCR utilizând amestecul 2x SYBR③ Green qPCR Master Mix și un termociclator Rotor-Gene Q (Qiagen (Hilden, Germania)). Transcriptul pentru proteina ribozomală L32 (rpl32) a fost folosit ca referință, iar expresia relativă a fost calculată prin metoda AC [68]. Au fost utilizate următoarele perechi de primeri care se întind intr-un intron:capital (număr de acces al genei NM_000499.5):5'-TCGCTACCTACCCAACCCTT-3',5'-TGTGTCAAACCCAGCTCCAA-3';ahr(genă numărul de acces NM_001621.5):5'-CGTGGGTCAGATGCAGTACA-3',5'ACCAGGGT-CAAAATTGGGCT3';sod2(numărul de acces al genei NM{_000636.4):5'-GCCCTGGAACCTCAC ATCAA -3';5'-AGCAACTCCCCTTGGGTTC-3';rpl32(număr de acces al genei NM_000994.4):5'-GTGAAGCCCAAGATCGTCAA-3',5'-TTGTTGCACATCAGCACGCAC{{ 41}}'.

2.3.Șoarecii

2.3.1.Linii de șoarece și reproducere

Femeie 8-12-în vârstă de 8-12-săptămână („tânăr”) și 18-lună („bătrân”) cu deficiență de AHR B6.129-AHRtmlBra/J (Schmidt și colab., 1996; referit aici ca AHR-KO)șoarecii au fost crescuți ca heterozigoți în unitatea de animale a IUF. Pentru control au fost utilizați perechi de tip sălbatic. Șoarecii au fost crescuți și ținuți în condiții specifice fără patogeni pe un ciclu lumină-întuneric de 12/12 ore și au primit alimente standard (ssniff"MZ, SSNIFF, Soest, Germania) ad libitum. 2.3.2.qPCR la șoareci

ARN-ul total a fost izolat din țesuturile organelor a trei șoareci cu deficit de WT și trei AHR cu TriZol[. Apoi, 400 ng de ARN au fost transcrise invers folosind transcriptaza inversă M-MLV (Promega, Madison, WI, SUA) și primeri hexameri aleatori. Nivelurile de expresie genică au fost măsurate în duplicat pentru fiecare țesut de șoarece pe un Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Germania), în volum final de 15 μL, care conține 7,5 μL Rotor Gene SybrGreenTM (Biorad, Feldkirchen, Germania), 1 uM din fiecare primer. ,1,5 μL cADN și apă fără RNază. Eficiența primerului a fost între 90 la sută și 146 la sută. Vezi tabelul S2 pentru secvențele și eficiența primerului. Nivelurile de expresie au fost calibrate la expresia RPS6 ca genă de întreținere în aceeași probă folosind {{ 14}}Metoda CT [69].

2.4.Analize in silico

Modelarea omologiei CeAhR LBD

Modelul structural al C. elegans AhR LBD (reziduuri 267-372) a fost generat prin modelare de omologie. Structurile cu raze X ale domeniilor PASB ale membrilor familiei bHLH-PAS omologi care împărtășesc cea mai mare identitate de secvență (aproximativ 20 la sută) cu CeAhR PASB au fost utilizate ca șabloane: ciclurile circadiene de ieșire a locomotorii kaput (CLOCK, PDB: 4F3L), proteina 3 care conține domeniul PAS neuronal (NPAS3, PDB:5SY7), factorii inducibili de hipoxie 20(HIF2o, PDB:3H82,4ZP4,3F1N) și lo(HIFlo, PDB:4H6J). Modelul a fost obținut cu MODELLER[70-72].Cistanche tubulosa beneficii și efecte secundareModelul optim a fost selectat dintre cele 10 generate, pe baza celui mai bun SCORE DOP [73]. Calitatea modelelor a fost evaluată folosind PROCHECK [74]. Structurile secundare au fost atribuite de DSSPcont [75]. Cavitatea de legare din LBD-urile modelate a fost caracterizată folosind serverul CASTp[76]. Vizualizarea modelelor a fost realizată folosind PYMOL[77].

2.5.Analiza statistică

Dacă nu se specifică altfel, analizele statistice au fost efectuate în GraphPad Prism (Versiunea 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, SUA). Pentru testele duratei de viață/sănătate, analiza statistică a fost făcută folosind OASIS[53]. Analiza statistică a datelor microarray a fost efectuată în R (R Foundation (Viena, Austria)). Boxploturile au fost create în GraphPad Prism (Versiunea 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, SUA) și arată mediana (linia), 25-75-a percentila (caseta) și 10-90-a percentila (mustati).

3. Rezultate

3.1. Curcumina promovează durata sănătății într-o manieră dependentă și independentă de AhR

Pierderea ahr-1 promovează sănătatea și durata de viață a C.elegans în condiții bazale[14] și are un impact negativ asupra trăsăturilor legate de vârstă ca răspuns la modulatorii AhR de la mamifere, cum ar fi benzo[a]pirenul (BaP), UVB. lumină și microbiotă [25]. Polifenolii dietetici, cum ar fi cur-chimenul, formează un grup important de modulatori AhR de mamifere cu efecte pro-longevitate la C. elegans [78,79] și astfel am investigat efectul de extindere a duratei de viață al curcuminei pentru ahr-ul său-1 dependenţă. Curcumina a prelungit în mod reproductibil și semnificativ durata de viață și de sănătate a C. elegans într-un mod dependent de ahr-1-(Figura 1A, B). Anterior, am arătat că pierderea ahr-1 extinde, de asemenea, durata de viață în modelele pentru boala Huntington și boala Parkinson, cu supraexpresia musculară a poliglutaminei predispuse la agregare (poliQ40) și respectiv a -sinucleinei (-syn), în timp ce la crescând în același timp conținutul lor de agregate proteice [25]. Interesant, tratamentul cu curcumină a crescut numărul de agregate poliQ40 și -syn în aceeași măsură cu pierderea funcției ahr-7 (Figura 1C). Curcumina a promovat, de asemenea, durata de viață și capacitatea locomotorie în aceste modele de boală (Figura 1DE), dar efectele pierderii ahr-1 și suplimentarea cu curcumină au fost adiționale în PolyQbackground (Figura 1D), dezvăluind funcții de protecție independente AHR-1- de curcumină cel puțin în acest fond compromis.

Figura 1. Curcumina promovează sănătatea într-un mod dependent și independent de AHR-1-. Curbele de durată de viață (A) și de sănătate (B) ale nematozilor tratați cu DMSO sau curcumină în greutate și ahr-1. Curbele de supraviețuire arată date cumulate pentru 290-300 viermi/condiție în 5 experimente. Test statistic: test de rang-log, # semnificație vs. DMSO,*semnificație vs.wt, Bonferronip-valoare<0.05.(c) quantification="" of="" aggregates="" in="" 10-day-old="" polyq;wt="" and="" poly="" air-1="" (left="" panel)="" or="" 7-day-old="" async;wt="" and="" an;ahr-1="" (right="" panel).="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 59-111="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05><0.05 vs.dmso.(d,e)life/health="" span="" of="" polyq;wt="" and="" polyq;ahr-1.survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 180="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,significance="" vs.="" dmso,="" *="" significance="" vs.="" wt,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.2.ugt-45 Mediază efectele anti-îmbătrânire ale curcuminei și epuizării ahr-1

În căutarea posibililor efectori ai curcuminei dependenți de ahr-1-aval, am adoptat abordări direcționate și imparțiale. Am examinat expresia genelor țintă AhR de mamifere clasice și ne-am concentrat pe genele Cyp, deoarece curcumina modifică expresia CyplA1 și CyplB1 în celulele de mamifere [80,81]. Cu toate acestea, cuantificarea a 47 de cyps diferiți în C.elegans prin PCR semi-cantitativă în timp real (qPCR) a arătat că numai cyp-13B1 a fost reglat în mod semnificativ fie de epuizarea ahr-1, fie de curcumină într-o manieră dependentă de ahr-1-(Figura S1A-B), în timp ce celelalte trei cyps(adică, cyp-13A5, cyp-13A8 și cyp-42A1) au fost crescut de curcumină numai în absența ahr-1(Figura S1). Aceste date, împreună cu alte lucrări [25, 82], sugerează că cyps nu sunt, probabil, țintele majore ale CeAhR. Acest lucru este susținut și de analiza noastră transcriptomică la mutanții de tip sălbatic și ahr-1. Într-adevăr, în concordanță cu rolul AHR-1 în determinarea neuronală [37,38,40,41], modificările expresiei genelor între mutanții de tip sălbatic și ahr-1 au arătat o îmbogățire în procesele legate de dezvoltarea neuronală. și diferențierea și nicio modificare majoră în genele clasice de detoxifiere (Figura 2A). Analiza qPCR a unora dintre genele cele mai sus și jos reglate între ahr-1(jul45) și sălbatic (atf-2 , K04H4.2, egl-46, T20F5.4, ptr-4, dyf{-7,clec{-209, C01B4.6, C01B4.7, F56A4.3)mai ales au confirmat dependența lor de ahr-1-în condițiile bazale (Figura 2B), dar nici UVB [25] și nici curcumina (Figura 2C) nu au afectat în mod semnificativ expresia acestor gene. Ne-am întrebat dacă modificările de expresie în aceste gene sunt conservate evolutiv și am evaluat expresia lor în diferite țesuturi (de exemplu, creier, ficat, intestin și sânge) de tip sălbatic și de 8- și 18-lună. AhR KO soareci. Unele gene au arătat o tendință pentru o expresie crescută la șoarecii tineri (omologi atf{-2) sau bătrâni (omologi lpr{-4/5) într-o manieră specifică țesutului, dar nu au fost nici un model evident, nici modificări conservate. observate (Figura S2). Aceste rezultate reflectă posibile diferențe specifice speciei sau activitate transcripțională AhR dependentă de țesut la mamifere, trecută cu vederea de analiza transcriptomică a animalelor întregi la C. elegans. O examinare amănunțită a genelor cele mai diferențiate exprimate între C. elegans de tip sălbatic și ahr-1(jul45) a arătat că expresia multora dintre aceste gene este afectată la C.elegans în timpul îmbătrânirii și de către modulatorii AhR de mamifere dietetice ( de exemplu, quercetină și resveratrol)[25], sugerând astfel un rol pentru AHR-1 în expresia genelor modulate cu polifenoli. În conformitate cu acest scenariu, datele din microarray au arătat că majoritatea genelor exprimate în mod diferențial la tratamentul cu curcumină au fost într-adevăr reglate într-un mod dependent de ahr-1-(Figura 2D; Tabelul 1).extract de cistanche tubulosaDin 47 de gene modificate de curcumină în mod sălbatic (43 reglate în sus și 4 în jos), doar 5 au fost, de asemenea, induse de curcumină în ahr-1(ju145). Printre genele reglate de curcumină într-un mod dependent de AHR-1-s-au numărat enzimele de fază Il și, interesant, unele dintre ele (ugt{-9 și ugt{-29), au fost reglementate în aceeași direcție de curcumină sau prin pierderea ahr-1 (Tabelul 1). Astfel, am verificat expresia acestora și pe cea a ugt-urilor suplimentare(ugt-45 și ugt{-57) care au fost exprimate diferențiat atunci când s-a aplicat o analiză statistică mai puțin restrictivă necorectată pentru comparații multiple. Dintre genele examinate, ugt-45 a fost crescută în ahr{-1(ijul45) și prin tratamentul cu curcumină (Figura 3A,B). De asemenea, am observat modificări în expresia unor gene de detoxifiere între tipul sălbatic și Șoarecii AhR KO într-un mod dependent de țesut. Expresia diferențială a acelor gene a fost cea mai mare în creier, unde Ugt2a3 (ugt-9 și ugt{-29 în C.elegans) a fost în jos- și Hpgds (gst-4 în C. elegans) a fost reglat în sus (Figura S3A). Nu a existat nicio schimbare în expresia nici uneia dintre genele testate în probele de ficat de la șoareci (Figura S3B). În conformitate cu datele C,elegans, omologul murin ugt-45 Ugt3a2 a arătat o tendință spre supraexpresie în intestinele șoarecilor Ahr KO (Figura S3C). În special, ugt-45 ARNi a prevenit efectele benefice asupra duratei de viață și de sănătate promovate de curcumină (Figura 3C, D) sau epuizarea ahr{-1 (Figura 3E, F), ceea ce indică faptul că cele două intervenții se pot baza pe semnalizare modulată în aval pentru a le provoca activitatea anti-îmbătrânire.

Figura 2. Genele reglate diferențial de curcumină sunt în primul rând reglementate într-o manieră dependentă de ahr-1-. (A) Îmbogățirea ontologiei genelor (GO) pentru procesele biologice după fuziunea termenului GO în ahr-1 vs. (B, C) Expresia celor mai puternice gene reglate în jos și în sus între wt și ahr-1 [25]a fost evaluată prin qPCR în wt vs.ahr-1(B) și DMSO-vs . nematozi tratați cu curcumină (C). Boxploturile arată date din 3 experimente. Expresia este prezentată în raport cu greutatea tratată cu DMSO (linie întreruptă). Test statistic:1-mod ANOVA cu testul de comparații multiple al lui Tukey,*valoare-p<0.05 vs.wt.="" (d)venn="" diagram="" of="" differentially="" expressed="" genes="" on="" the="" microarray.="" the="" number="" of="" genes="" that="" were="" differentially="" up-or="" down-regulated="" between="" the="" indicated="" conditions="" is="" shown="" in="" red="" and="" blue,="" respectively.="" the="" numbers="" in="" the="" interchanges="" refer="" to="" the="" genes="" that="" occurred="" in="" both="" comparisons.="" the="" values="" in="" the="" lower="" right="" corner="" show="" the="" number="" of="" genes="" on="" the="" array="" that="" were="" not="" differentially="">

Figura 3.ugt-45 este necesară pentru prelungirea duratei de viață a mutanților curcuminei și ahr-1. (A, B) Expresia genei a fost evaluată prin qPCR în greutate față de ahr-1(A) și DMSO față de nematozi tratați cu curcumină (B). Boxploturile arată date din 3 experimente. Expresia este prezentată în raport cu greutatea tratată cu DMSO (indicată ca o linie întreruptă). Test statistic: 2-Mod ANOVA cu testul de comparații multiple Sidak, *valoare p<0.05vs.wt,><0.05 vs.="" dmso.="" (c,d)effect="" of="" ugt-45="" rnai="" on="" the="" curcumin-mediated="" life/health="" span="" extension="" in="" the="" wt.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" "significance="" vs.="" dmso,*="" significance="" vs.control="" rnai,="" bonferroni=""><0.05.(e,f)effect of="" ugt-45="" rnai="" on="" ahr-1-mediated="" life/healthspan="" extension.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,#="" significance="" vs.="" wt,*="" significance="" vs.="" control="" rnai,="" bonferroni=""><>

3.3. AHR-1 și curcumina protejează în mod independent împotriva stresului oxidativ

Proprietățile benefice ale polifenolilor sunt adesea atribuite capacității lor de a proteja împotriva speciilor reactive de oxigen (ROS)|83,84]. Deoarece AhR este implicat în procesele mediate de stresul oxidativ [85-87], ne-am întrebat dacă curcumina poate avea un impact asupra fiziologiei animalelor prin răspunsurile antioxidante reglate de AhR. Am observat că mutanții ahr-1 produc mai multe ROS mitocondriale (mt) și au un potențial redus al membranei mitocondriale (Figura 4A, B), doi parametri corelați cu longevitatea [88,89]. Deși în conformitate cu paradigma mitohormesis ahr-1(jul45) produce puțin mai mult mtROS și trăiește mai mult, aceste animale au fost mai sensibile la stresul oxidativ decât tipul sălbatic. Mai exact, efectele dăunătoare induse de juglonă și H2O2 asupra săriturii, motilității și supraviețuirii animalelor au fost semnificativ mai puternice în ahr-1(jul45) în comparație cu tipul sălbatic (Figura 4C-F). Aceste date sugerează că epuizarea AHR-1 are efecte motorii benefice în condiții bazale, în timp ce prezența sa este necesară pentru protecția la stres oxidativ, decuplând astfel doi parametri corelați adesea cu vârsta, și anume durata de viață și rezistența la stres. În schimb, curcumina a îmbunătățit semnificativ rezistența la H, O și juglonă atât la mutanții de tip sălbatic, cât și la ahr-1 (Figura 4E, F), sugerând că curcumina provoacă un răspuns antioxidant independent de ahr-1-. În concordanță cu reglarea necuplată a duratei de viață și a rezistenței la stres oxidativ, tăcere ugt-45 nu a afectat sensibilitatea la stresul oxidativ nici pentru mutanții ahr-1, nici pentru animalele tratate cu curcumină (Figura 4G).comentarii cistanche tubulosaAstfel, curcumina are efecte pro-longevitate prin ahr-1 și ugt-45, dar protejează împotriva stresului oxidativ prin mecanisme independente de ahr-1-.

3.4. Nrf2/SKN-1 Mediază efectele independente de AhR ale curcuminei

Pentru a evalua în continuare diafonia AhR-curcumină în caracteristicile suplimentare legate de vârstă, am măsurat capacitatea de migrare în EC primară umană - un semn distinctiv pentru funcționalitatea vaselor, care scade odată cu vârsta [90] și este redusă de activarea AhR [14]. În conformitate cu activitatea anti-îmbătrânire a suprimării ahr-1 și a curcuminei, supraexpresia AhR a fost inhibată semnificativ, în timp ce curcumina a crescut, capacitatea de migrare a EC umană primară (Figura 5A). De remarcat, inducerea capacității de migrare de către curcumină a fost comparabilă în celulele transfectate cu vectorul de expresie cu vectori goale sau AhR (Figura 5A). Cu toate acestea, migrarea celulelor tratate cu curcumină a fost redusă semnificativ de supraexprimarea AhR: curcumina induce în celulele goale transfectate cu vector până la 60 de celule migrate pe câmp de mare putere, în timp ce în celulele care supraexprimă AhR doar până la 25 de celule pe câmp de mare putere (Figura). 5A). Aceste date sugerează că efectul pro-migrator al curcuminei este modulat de mecanisme independente de AhR, dar posibil și de o reducere a activității AhR. Apoi am determinat distribuția intracelulară AhR și expresia cVplal în EC umană tratată cu curcumină, curcumina nu a afectat translocarea AhR-nucleară (Figura 5B) sau expresia ciplală (Figura 5C). În căutarea căilor modulate de curcumină într-o manieră independentă de AhR, ne-am întors la profilele transcriptomice ale nematodelor pentru a găsi factori de transcripție care reglează genele semnificativ modulate prin pierderea ahr-1 sau prin tratamentul cu curcumină la animalele sălbatice (Tabelul 1). ). Această căutare in silico a identificat factorul de transcripție redox SKN-1, ortologul Nrf2 uman (factorul nuclear eritroid 2-factor 2 asociat), a cărui activare de către curcumină [91] este adesea raportată ca un posibil mediator al activitatea sa antioxidantă [92,93]. În consecință, prototipul genei dependente de C.elegans Nrf2/SKN-1-gst-4, este supraexprimat în mutantul alhr{-1 [25] și indus de curcumină în tipul sălbatic și chiar mai mult în mutanții ahr-1 (Figura 5D). Mai mult, curcumina a crescut stabilizarea și translocarea nucleară a Nrf2 în EC umană primară (Figura 5E) și a indus expresia superoxid dismutază de mangan (Sod2) - o genă țintă clasică Nrf2 - în celulele transfectate cu un vector gol sau în celulele în care AhR este redus la tăcere de shRNA (Figura 5F). Lipsa inducției Sod2 de către AhR shRNA în EC se poate datora unei reduceri parțiale (50 la sută) a expresiei (Figura S3D), care poate să nu fie suficientă pentru a declanșa activarea Nrf2 sau a factorului de transcripție suplimentar (TF), care , în C.elegans, ar putea fi de acord cu inducerea gst-4 [94]la epuizarea completă a AhR. Interesant, Hpgds, un omolog al lui C.elegans gst-4, a fost crescut semnificativ în creierul șoarecilor AhR KO (Figura S3A), dar nu este o țintă a Nrf2. O dovadă suplimentară pentru o posibilă semnalizare independentă a Nrf2/SKN{-1 activată de epuizarea ahr{-1 este că activarea gst{-4 de către curcumină este complet suprimată de ARN-7 pielii în C.elegans de tip sălbatic, în timp ce mutanții ahr-1 încă induc gst{-4 în ciuda epuizării-1 a pielii (Figura 5G, H). Cu toate acestea, pielea-1 ARNi a redus rezistența la stresul oxidativ atât la tipul sălbatic, cât și la ahr-1(ju145) (Figura 5I). În mod neașteptat, atenuarea pielii-1 nu a afectat rezistența la juglonă a animalelor tratate cu curcumină (Figura 5I). Datele noastre dezvăluie un scenariu complex în care curcumina promovează diferite caracteristici anti-îmbătrânire, bazându-se fie pe semnalizare dependentă de AhR, fie independentă de AhR, dar dependentă de Nrf2/SKN-1-(și suplimentară).

Figura 4. AHR-1 și curcumina protejează în mod independent împotriva stresului oxidativ. (A) Imagini reprezentative (stânga) și cuantificarea intensității DSRed (dreapta) în nematozi colorați cu MitoSOX sau ahr-1. Boxploturile arată date reunite de la 129-135 viermi/condiții în 3 experimente. (B) Potențialul membranei mitocondriale a fost evaluat prin colorarea TRME la nematozi de vârste indicate. Sunt prezentate imagini reprezentative (stânga) și cuantificarea fluorescenței TMRE (dreapta). Boxploturile arată date reunite din 3 experimente. (C,D) Activitatea de pompare faringiană (C) și motilitatea (D) a mutanților wt și ahr-1 după tratamentul cu H2O2. Boxploturile arată date reunite de la 39-54(C) sau 35-36 viermi/condiție (D) în 3-4experimente.*p-valoare<0.05 vs.wt,$=""><0.05 vs.control="" treatment,="" statistical="" test:="" 1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (e)pharyngeal="" pumping="" of="" curcumin-treated="" nematodes="" after="" h,="" o,="" treatment.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 32="" worms/conditions="" in="" 2experiments.="" *=""><0.05><0.05cur vs.="" dmso="" treatment,="" $=""><0.05 h2o2="" vs.="" control="" statistical="" test:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.(f)influence="" of="" curcumin="" on="" juglone-induced="" toxicity.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 500="" worms/condition="" in="" 20="" experiments.="" *significance="" alhr-1="" vs.wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05.(g) effect="" of="" ugt-45="" rnai="" in="" curcumin-fed="" wt="" and="" ahr-1="" worms.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 150="" worms/condition="" in="" 6experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05. no="" statistical="" significance="" was="" observed="" in="" ugt-45="" vs.="" control="" rnai-treated="">

Figura 5. Curcumina activează Nrf2/SKN-1 independent de AhR.(A) Analiza plăgii zgârieturi în EC primară umană tratată cu curcumină (cur) sau DMSO transfectată cu un vector gol (EV) sau un vector de expresie pentru AhR uman. Panoul superior: poze reprezentative; linia întreruptă reprezintă începutul migrației. Bară de scară: 100 um. Panoul inferior: cuantificare; diagramele cu casete arată datele 4-6experimentelor. Test statistic:1-mod ANOVA,*p<0.05><0.05 ys.dmso.(b,c)human="" primary="" ec="" were="" treated="" with="" cur="" or="" dmso.="" (b)representative="" immunostainings:="" ahr="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin="" (green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control="" (-con),="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.scale="" bar:50="" um.(c)="" relative="" capital="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr.="" mean="" expression="" in="" the="" dmso-treated="" controls="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" from="" 7="" experiments.="" (d)pgst-4:gfp="" expression="" in="" dmso-and="" curcumin-treated="" (cur)wt="" and="" alr-1="" worms.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 118-138="" worms/conditions="" in4=""><0.05><0.05 vs.="" dmso="" treatment,="" statistical="" test:1-way="" anova.(e)representative="" immunostaining="" images="" of="" human="" primary="" ec="" treated="" with="" cur="" or="" dmso:="" nrf2="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin(green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control(-="" con)="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.="" scale="" bar:="" 50="" um.(f)="" human="" primary="" ec="" was="" transfected="" with="" an="" empty="" vector(ev)or="" an="" expression="" vector="" for="" an="" shrna="" targeting="" the="" human="" ahr="" transcript="" (shahr).="" relative="" sod2="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr,="" and="" mean="" expression="" in="" the="" ev="" transfected="" cells="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" of="" 7experiments.=""><0.05 vs.="" respective="" control.="" (g,h)="" post-4:gfp="" expression="" in="" dmso-or="" cur-treated="" wt="" and="" ahr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skin-1="" rnai.="" representative="" images(g)="" and="" gst-4-driven="" gfp="" quantification(h)="" are="" shown.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 103-189="" worms/conditions="" in="" 4="" experiments.="" (i)="" juglone="" stress="" survival="" in="" curcumin-="" or="" dmso-treated="" wt="" and="" alhr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skn-1="" rnai.="" kaplan="" meier="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 100="" worms/condition="" in="" 4="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,="" #significance="" curcumin="" vs.="" dmso,="" $="" significance="" skn-1="" vs.="" con="" rnai,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.5. Curcumina și prooxidanții prezintă efecte opuse asupra activității AHR-1

În concordanță cu efectul anti-îmbătrânire al scăderii expresiei/activității AhR, datele noastre sugerează că curcumina poate prelungi durata de viață a C.elegans prin suprimarea căilor reglate AHR-1-prin reducerea expresiei/activității AHR-1 sau acționând. pe căi de semnalizare comune în aval. Prin urmare, am încercat să cuantificăm activitatea AHR-1 la C.elegans, dar numeroase încercări de a evalua expresia AHR-1 și localizarea subcelulară utilizând anticorpi (împotriva AhR de mamifer sau anticorpi personalizați împotriva CeAhR) sau marcați fluorescent. reporterii (OP562, UL1709, ZG93) nu au oferit dovezi semnificative. Având în vedere că AHR-1 se leagă de XRE-uri in vitro [35], ne-am gândit să folosim expresia genetică determinată de XRE ca citire pentru activitatea AHR-1. Astfel, am apelat la celulele Cos7 derivate de la maimuță, care nu exprimă AhR endogen și, prin urmare, nu prezintă activitate endogenă AhR [95,96] și pot fi exploatate pentru a monitoriza inducția luciferazei condusă de XRE ca citire pentru AHR-1 activitate (Larigot et al.; depus împreună cu acest studiu). Când celulele Cos7 au fost co-transfectate cu vectori care exprimă C.elegans AhR/alr-1, ARNT/aha{-1 și un promotor XRE cuplat cu luciferază al genei umane CYPIA1 [64] AHR{ {27}} a arătat activitate scăzută în condiții bazale (tratate cu vehicul). De notat, tratamentul cu curcumină sau alte nutraceutice care promovează îmbătrânirea sănătoasă în C.elegans, cum ar fi luteina [97] și resveratrolul [98,99], a suprimat semnificativ activitatea AHR-1 (Figura 6A-C). În schimb, BaP și leflunomida, activatori AhR cunoscuți la mamifere, nu au afectat activitatea AHR-1 (Figura 6A,B) la concentrațiile pe care le-am folosit. În special, activitatea AHR-1 a fost abolită în celulele Cos7 transfectate cu un vector care exprimă alela ahr{-1(jul45) în loc de alela de tip sălbatic (Figura 6A-C), sugerând că jul45 este un adevărat alela de pierdere a funcției și că intensitatea luciferazei măsurată se datorează AHR funcțional-1.

Apoi am căutat să investigăm dacă curcumina reduce activitatea AHR-1 prin legarea directă sau modularea indirectă. Până în prezent, nu au fost identificați liganzi ai C.elegans AHR-1 și, deoarece nu există informații disponibile despre LBD, am efectuat o analiză in silico pentru a-l caracteriza. Cele două izoforme AHR-1, la și 1b, au fost aliniate și, deși diferite ca lungime, secvența lor de domeniu PASB este identică. Această secvență a fost apoi aliniată la domeniul PASB al Drosophila melanogaster și la cele ale a două AhR de la vertebrate pentru care au fost generate anterior modele structurale, și anume șoarecele (Mus musculus)[100] și peștele zebră (Danio rerio)[101](Figura 6D). Alinierea a arătat diferențe clare între specii, cu principala particularitate a delețiilor secvenței nevertebrate în cea mai variabilă regiune din domeniul PAS, corespunzătoare regiunii flexibile, inclusiv pachetul elicoidal (helicele C, D, E) și buclele scurte care leagă. aceste elemente (Figura 6D,E). Aceste ștergeri ar putea reduce spațiul disponibil în cavitatea de legare a acestor AhR. Apoi am generat un model 3D al AHR-1 PASB prin modelare de omologie. Acest model prezintă pliul PAS tipic, dar cu o spirală Do mai scurtă în comparație cu alte AhR. Cu toate acestea, cavitatea internă are unele particularități; contine mai multe reziduuri hidrofobe si este trunchiata in jumatate de niste lanturi laterale interne. În special, H365 și H274 sunt confruntate și ar putea forma o legătură de hidrogen în mijlocul cavității; în plus, lanțurile laterale Y332, L363 și L302 ar putea obstrucționa cavitatea, reducând spațiul intern disponibil pentru liganzi (Figura 6E). Această cavitate mică și trunchiată, cel mai probabil, nu permite legarea liganzilor mari (de exemplu, TCDD sau curcumină). Similar cu modelul structural AHR-1, un model al peștelui zebra zfAhRla a arătat că cavitatea LBD este trunchiată în comparație cu paralogii de legare a TCDD zfAhR1b și zfAhR2 [101]. Liganzii mici și flexibili, cum ar fi leflunomida, leagă și activează zfAhRla, dar concentrația de leflunomidă pe care am testat-o ​​nu a activat AHR-1 în sistemul nostru celular Cos7 (Figura 6B). Ne-am întrebat apoi dacă mutațiile în aminoacizii responsabili pentru cavitatea mică a LBD ar putea permite liganzilor clasici să activeze CeAhR. Reziduul CeAhR L363 (Figura 6D) corespunde cu A375 din mAhRb-I și V375 din Madrid, iar acest reziduu are un impact major asupra legării ligandului [102]. În mod similar, T386 al zfAhRla (Figura 6D), care se potrivește cu A375 în mAhRb-1 și A386 în zfAhR1b și zfAhR2, contribuie la lipsa legării TCDD a zfAhRla și, atunci când este mutat la alanină, se restabilește sensibilitatea Y296DDH. introdus [101]. Aminoacidul Y296 este deja o histidină în C.elegans (H274). Astfel, am mutat doar leucina la poziția L363 în vectorul CeAhR la o alanină (L363A) (Figura 6D, E indicată de o săgeată). Mai mult, am mutat histidina din apropiere în poziția H365 la glutamina (H365Q), care este Q377 la șoareci (Figura 6D, E indicată printr-o săgeată), deoarece probabil formează o legătură de hidrogen cu H274 și ar putea contribui la cavitatea mică a AHR{ {49}} (Figura 6E). Apoi am testat dacă liganzii AhR de mamifere afectează activitatea AHR-1 atunci când L363 și H365 sunt mutați. Cu toate acestea, aceste modificări, în loc să restabilească răspunsul la liganzii xenobiotici ca în peștele zebra [101], au abolit chiar și activitatea bazală AHR-1, similar cu alela ju145 (Figura 6F). Aceste rezultate arată diferențe clare între LBD-urile C.elegans și zebrafish, dar arată că LBD este fundamental pentru activitatea bazală AHR-1. Împreună cu studiile anterioare [35,38,82], rezultatele noastre sugerează că AHR-1 este puțin probabil să fie implicată în răspunsul clasic de transactivare indus de xenobiotice, care, prin urmare, poate să nu fie relevant pentru ahr{-1-reglementat. îmbătrânirea fiziologică. În schimb, compușii derivați din plante ar putea exercita efecte conservate, cel puțin parțial, prin suprimarea căilor modulate AHR-1-. Modelul nostru 3D sugerează că curcumina nu modulează activitatea AHR-1 legându-și LBD. Astfel, suprimarea activității AHR-1 de către curcumină s-ar putea datora efectului său antioxidant. În concordanță cu această posibilitate și cu sensibilitatea crescută a mutanților C.elegans ahr-1 la stresul oxidativ, am constatat că activitatea AHR-1 este într-adevăr crescută de agenții inductori de ROS. Și anume, celulele Cos7 tratate cu rotenonă pro-oxidantă au prezentat o activitate AhR crescută atunci când au fost transfectate fie cu C.elegans, fie cu AhR murin, dar nu atunci când au fost transfectate cu alela jul45 sau cu alela cu mutații LBD (Figura 6G, H).

În general, în timp ce activarea CeAhR protejează împotriva stresului oxidativ la începutul vieții, expresia sa scăzută contracarează îmbătrânirea și mediază efectul benefic anti-îmbătrânire al curcuminei (Figura 7). Curcumina poate ajuta astfel la echilibrarea activării redox TF într-o manieră dependentă de context și timp și poate favoriza suprimarea AhR direct prin efectul său antioxidant și/sau prin activarea Nrf2/SKN-1 (sau a altor TF), care pot concomitent. mediază activitatea anti-îmbătrânire a curcuminei.

Figura 6. Curcumina și pro-oxidanții au efecte opuse asupra activității AHR-1. (AC) Evaluarea activității AHR-1 după tratamentul cu compușii indicați în celulele Cos7 transfectate fie cu wt AHR-1(wt) fie cu AHR-1 purtând mutația punctiformă ju145 (ju145) și AHA-1, precum și o luciferază inductabilă de XRE. Boxploturile arată datele despre 3-5experimente.* valoarea p<0.05><0.05 vs.="" dmso/etoh,="" statistical="" test:="" 2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (d)="" alignment="" of="" the="" lbds="" from="" c.elegans,="" drosophila,="" and="" zebrafish="" ahrs.="" the="" color="" scheme="" for="" residues:="" red,="" acidic;="" blue,="" basic;="" purple,="" polar;="" yellow,="" cys;="" brown,="" aromatic;="" green,="" hydrophobic;="" orange,="" ser,="" thr;="" gray,="" pro;="" white,="" gly.="" (e)="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" to="" the="" ceahr="" pasb="" are="" indicated="" on="" top(light="" gray="" bars="" for="" helices="" and="" dark="" gray="" bars="" for="" β-strands)="" and="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" asterisks="" mark="" the="" amino="" acids="" likely="" contributing="" to="" the="" inability="" of="" ceahr="" to="" bind="" big="" ligands.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" the="" investigation="" of="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).i3dmodels="" of="" the="" ceahr="" (left)="" and="" the="" mahr="" (right)="" pasb="" domains="" were="" obtained="" by="" homology="" modeling,="" shown="" in="" a="" cartoon="" representation.="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" are="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" the="" colored="" internal="" area="" (blue="" for="" ceahr="" and="" yellow="" for="" mahr)defines="" the="" molecular="" surface="" of="" the="" binding="" cavity="" identified="" by="" castp.="" in="" the="" car="" model,="" the="" amino="" acids="" protruding="" into="" the="" binding="" cavity="" (asterisks="" in="" panel="" d)="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" blue="" sticks.="" the="" mahr="" amino="" acids="" corresponding="" to="" those="" displayed="" in="" the="" ceahr="" model,="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" yellow="" sticks.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" studying="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).="" (f)="" ahr="" activity="" in="" bap-or="" mnf-treated="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" an="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365o="" mutations="" (lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr),="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt,"=""><0.05 vs.dmso.(g)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" ahr-1(either="" wt="" or="" ju145)="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.*=""><0.05vs.wt, #=""><0.05 vs.="" dmso.(h)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365q="" mutations(lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr).boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt/ahr-1,="" #="" p-value=""><0.05 vs.="">

Figura 7. Modelul propus al căii de semnalizare AHR-1 în răspunsul lui C.elegan la pro-și antioxidanți. În condiții „normale” (panoul din mijloc), AHR-1 este activată de ROS intracelular. Aceasta duce la eliminarea chaperonelor din AHR citosolică-1 și la translocarea nucleară ulterioară a AHR-1. În nucleu, AHR-1 formează un heterodimer cu translocatorul nuclear AHR (AHA{ {7}}) și se leagă de XRE ale genelor țintă, ceea ce, la rândul său, duce la reducerea nivelurilor intracelulare de ROS. În aceste condiții, pierderea funcției ahr-1 duce la o durată de viață crescută. În prezența antioxidanților (panoul din stânga), concentrațiile intracelulare de ROS sunt scăzute, ceea ce duce la AHR-1 care se află în citoplasmă, legată de cofactorii săi. Inhibarea activității bazale AHR-1 duce la o durată de viață crescută. În prezența pro-oxidanților (panoul din dreapta) AHR-1 este activată de ROS excesiv, ceea ce are ca rezultat translocarea sa nucleară, formarea heterodimerului AHR{-1-AHA{-1 și inițierea transcrierea genei țintă. În ahr-1 KO, detoxifierea scăzută a ROS prin genele țintă induse de AHR-1- duce la o acumulare de ROS și face ahr-1 KO susceptibilă.

4. Discutie

AhR a fost descoperit inițial la mamifere pentru activitatea sa de răspuns xenobiotic indusă la legarea toxicilor de mediu sau a liganzilor endogeni, dar există și modulatori care nu se bazează pe legarea ligandului, dar sunt mult mai puțin investigați. C.elegans reprezintă un organism model unic pentru a investiga activitățile AhR independent de răspunsul său xenobiotic clasic, deoarece CeAhR nu leagă prototipurile de liganzi AhR [35,39]. Folosind acest model, am identificat o funcție conservată evolutiv pentru AhR în procesul de îmbătrânire [14] și am arătat că unii dintre modulatorii AhR de la mamifere (de exemplu, bacteriile, Bal și UVB) afectează parametrii de îmbătrânire prin AHR-1 într-un manieră dependentă de context [25]. Aici, am continuat descoperirile noastre anterioare cu o investigație mai mecanicistă a caracteristicilor de îmbătrânire reglementate de AhR între specii de polifenol curcuminul alimentar. Analizele noastre combinate in vivo, in vitro și in silico au dezvăluit un scenariu nou și complex: în timp ce curcumina promovează caracteristicile anti-îmbătrânire la nematozi și EC primară umană, cel puțin parțial într-o manieră dependentă de AhR, efectele sale antioxidante la ambele specii se bazează pe mecanisme independente de AhR, dar în primul rând dependente de Nrf2/SKN-1.

Am arătat pentru prima dată că curcumina a întârziat îmbătrânirea fiziologică a lui C.elegans într-un mod dependent de AHR-1-. În căutarea posibililor efectori ai curcuminei dependenți de ahr-1-aval, am folosit abordări direcționate și imparțial și am constatat că majoritatea genelor reglate diferențiat la tratamentul cu curcumină sunt reglementate într-un mod dependent de AHR-1-. Mai mult, multe dintre aceste gene au prezentat un model de expresie similar la animalele sărăcite și tratate cu curcumină AHR-1-, sugerând că curcumina promovează extinderea duratei de viață prin suprimarea activității AHR-1. În mod surprinzător, nici analiza țintită, nici analiza transcriptomică nu au indicat un rol major pentru genele ținte AhR clasice, cum ar fi cupele, care, în schimb, s-au găsit în mare parte sub-exprimate în neuroni (Larigot și colab.; prezentat împreună cu acest studiu). Interesant este că aceste descoperiri pot indica că transcriptomica întregului animal poate masca efectele specifice neuronale ale AhR, în acest caz specific prin genele cps. Am descoperit că printre genele exprimate diferențial, multe aparțin enzimelor de detoxifiere de faza II, cum ar fi intestinul-45, care a fost crescut atât de epuizarea ahr-1 (și în creierul șoarecilor AhR KO) și tratament cu curcumină pentru a media prelungirea duratei de viață a acestora. În schimb, tratamentul cu curcumină și epuizarea ahr-1 au crescut expresia unei alte enzime de detoxifiere de fază II, GST-4, prin mecanisme diferite: prima bazându-se pe, în timp ce a doua este în principal independentă de, Nrf2/ SKN-1, un TF redox clasic care induce GST-4 la stresul oxidativ la C.elegans [103]. Mai mult, în timp ce curcumina induce răspunsuri dependente de Nrf2/SKN-1-în C.elegans (expresia GST-4) și EC primară umană (expresia Sod2 și capacitatea de migrare), ea protejează, de asemenea, C.eleans împotriva stresului oxidativ în într-un mod independent-1-SKN. La C.elegans, curcumina nu poate prelungi durata de viață în pielea foarte bolnavă-1(zu67) mutanți [104], în timp ce GST-4 poate fi indusă într-o manieră independentă de SKN-1- prin semnalizarea EGF [94] și diafonia între calea EGF și AhR a fost raportată la mamifere [105].

Interesant, și spre deosebire de tulpina de tip sălbatic, am observat un efect independent de AHR-1-al curcuminei asupra duratei de sănătate în modelele de nematozi pentru boala Huntington și, respectiv, Parkinson. La aceste tulpini, tratamentul cu curcumină a crescut numărul de agregate proteice în aceeași măsură ca și deficitul de AHR-1, indicând fie un efect protector al agregării proteinelor în sine și/sau activarea cu curcumină a căilor de protecție împotriva agregării proteinelor, independent de a/ hr-1 epuizare. Influența curcuminei asupra agregării proteinelor este controversată: s-a demonstrat că inhibă formarea fibrilelor, dar și leagă speciile pre-fibrilare/oligomerice de proteine ​​amiloidogene, accelerând astfel agregarea acestora și reducând neurotoxicitatea generală [106]. De notat, cofeina, care protejează, de asemenea, împotriva caracteristicilor îmbătrânirii cardiovasculare [66,107], previne, de asemenea, paralizia indusă de A fără scăderea agregatelor A, dar prin activarea căii protectoare dependente de Nrf2/SKN-1-[108]. Va fi important să se evalueze dacă efectul protector indus de curcumină sau de epuizarea totală-1 în modelele de boală C.elegans este mediat de mecanisme care promovează îndepărtarea speciilor oligomerice/pre-fibrilare în agregate mai puțin toxice și/sau prin activarea altor mecanisme, cum ar fi Nrf2/SKN-1, care pot proteja în același timp împotriva proteotoxicității. De notat, enzimele de detoxifiere pot conține atât XRE, cât și ARE (elemente sensibile la antioxidanți), și a fost descrisă o interacțiune între semnalizarea reglată Nrf2/ARE și AhR/XRE [109]. Va fi astfel interesant de clarificat modul în care curcumina promovează diferitele sale efecte benefice anti-îmbătrânire prin echilibrul dintre semnalizarea reglată de Nrf2 și AhR.

Abordările noastre combinate au arătat că curcumina inhibă activitatea AHR-1. La mamifere, s-a sugerat că efectul inhibitor AhR al curcuminei este mediat de legarea directă a LBD [110] sau inhibarea proteinei kinazei C care fosforilează AhR[79]. Un alt studiu a indicat că activitatea transcripțională a AhR este dependentă de starea redox celulară și de structura cromatinei, care sunt ambele influențate de curcumină[111]. Deși AHR-1 nu leagă TCDD, se leagă XRE in vitro[36], dar studiile sistematice, care abordează potențialul hidrocarburilor poliaromatice sau al altor liganzi AhR de la mamifere de a modula AHR-1, lipsesc în primul rând din cauza lipsa instrumentelor adecvate pentru a evalua asta. Studiile noastre încearcă să umple acest gol și, exploatând celulele Cos7 care exprimă AHR-1 cuplate cu teste de luciferază (Larigot și colab.; prezentat împreună cu acest studiu) și modelarea in silico a C. elegans LBD, au arătat că curcumina suprimă AHR -1 activitate, dar probabil nu prin legarea LBD directă. Testul in vitro utilizat în studiul nostru a confirmat că CeAhR nu este activat prin semnalizarea clasică a xenobioticelor. Cu toate acestea, nu ar dezvălui activități datorate legării AhR la secvențele ADN, altele decât XRE „clasic” găsit în CYP1A1, cum ar fi XRE care răspunde la polifenol (quercetin) găsit în PON1 [112,113]. Imunocolorarea în EC primară umană argumentează, de asemenea, împotriva curcuminei care induce translocarea nucleară AhR, care, împreună cu efectul de promovare al capacității de migrare în celulele care supraexprimă AhR, poate indica, de asemenea, că curcumina suprimă activitatea AhR.

Propunem că efectul inhibitor al curcuminei, mai degrabă decât să se bazeze pe legarea AhR, implică capacitatea sa antioxidantă, care poate fi într-adevăr asociată sau chiar depinde de activarea Nrf2/SKN-1. AhR de mamifer este activat de ROS prin modificarea oxidativă independentă de LBD [85], dar datele noastre arată că inducerea activității AHR-1 de către rotenona pro-oxidantă necesită LBD. Un mecanism indirect de activare a AhR mediată de ROS este formarea puternicului ligand AhR FICZ[114]. Cu toate acestea, FICZ este o moleculă plană mare care, conform modelului nostru in silico, nu s-ar potrivi cu AHR-1 LBD. În timp ce mecanismul exact prin care activitatea AHR-1 este promovată de ROS și inhibată de curcumină (fie prin stingerea directă a ROS, fie indirect prin activarea Nrf2 sau a altor gene de reglare a antioxidanților) rămâne de stabilit, acest lucru este puternic susținut de noastre. constatări: AHR-1 este activată de rotenonă, iar mutanții ahr{-1 prezintă mai mult mtROS, un potențial redus al membranei mitocondriale și sunt mai sensibili la H, O și juglonă, precum și la UVB și BaP [25] , ambele produc ROS[115,116]. În acest context, este interesant de observat că mutanții ahr-1 prezintă o modificare ușoară a funcțiilor mitocondriale, care seamănă cu cele ale mitohormezei [117. Acest lucru sugerează că toată-1 epuizarea (și posibila curcumină prin inhibarea AHR-1) poate promova durata sănătății prin stres mitocondrial ușor, despre care se știe că prelungește durata de viață a lui C.elegan prin gene de detoxifiere modulate în mod similar în celălalt-1 {20}} mutanți [118,119]. Mai mult, dacă Nrf2/SKN-1 și mitocondriile joacă un rol în modularea activității AHR{-1 la tratamentul cu curcumină este o posibilitate interesantă care rămâne de validat.

În general, profitând de multiplele caracteristici oferite de nematodul C.elegans pentru studii in vivo, sugerăm că funcția ancestrală a AhR ar putea fi în reglarea enzimelor de fază-ll legate de răspunsurile antioxidante, mai degrabă decât xenobiotice. Spre deosebire de efectele dăunătoare induse de niveluri ridicate de ROS, efectele benefice promovate de deficiența AhR pot fi mediate de stresul mitocondrial ușor și/sau producția ușoară de ROS (mitohormeză), care se bazează, de asemenea, pe Nrf2/SKN-1. De asemenea, oferim dovezi puternice pentru interacțiunea dintre curcumină și AhR. Inhibarea curcuminei a semnalizării AhR este conservată evolutiv și probabil că nu este mediată de legarea la AhR LBD, ci mai degrabă prin proprietățile curcuminei de captare a ROS sau prin activarea Nrf2/SKN-1. Calea de semnalizare Nrf2 poate fi într-adevăr activată de curcumină în moduri diferite [91]. În cele din urmă, datele noastre au arătat că curcumina promovează efectele anti-îmbătrânire și într-o manieră independentă atât la C.elegans (expresie crescută a GST-4 și rezistență la stres oxidativ), cât și EC primară umană (expresie crescută de Sod2 și capacitatea de migrare). ), care ar putea explica, de asemenea, efectele aditive ale curcuminei și pierderea funcției AHR-1 asupra duratei de sănătate a animalelor care exprimă poliQ.

5. Concluzii

În concluzie, printr-o combinație originală de abordări in silico, vitro și in vivo, am arătat că, în timp ce activarea CeAhR protejează împotriva stresului oxidativ la începutul vieții, expresia sa scăzută contracarează îmbătrânirea și mediază efectul benefic anti-îmbătrânire al curcuminei (Figura 7) . Curcumina poate ajuta astfel la echilibrarea activității diferiților factori de transcripție implicați în răspunsurile de detoxifiere/antioxidanți (suprima AhR și activează Nrf2) în condițiile în care acestea sunt modificate (crește AhR și scad Nrf2/SKN-1), cum ar fi îmbătrânirea sau tulburări asociate vârstei. Munca noastră adaugă un alt nivel de complexitate activităților multifuncționale și specifice contextului deja vaste ale AhR, cu repercusiuni importante asupra sănătății organismului și asupra duratei de viață. Mai mult, deschide ușa către studii suplimentare, folosind sistemul nematozilor pentru a descoperi și investiga funcțiile ancestrale ale AhR, care sunt mai puțin probabil identificate la mamifere.

Acest articol este extras din Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants