Inhibarea receptorului de hidrocarburi arii restabilește disfuncția endotelială mediată de sulfatul de indoxil în inelele aortice de șobolan

Abstract:Thesulfat de indoxil toxină uremică(IS), ridicat înboală cronică de rinichi(CKD), este cunoscut că contribuie la progresia bolii cardiovasculare. IS activează receptorul de hidrocarburi arii (AhR) care mediază stresul oxidativ șidisfuncție endotelialăprin activarea căii CYP1A1. Prezentul studiu examinează inhibarea AhR cu antagonistul, CH223191, privind afectarea mediată de IS a funcției endoteliale vasculare și perturbarea echilibrului redox. Efectele acute ale IS asupra relaxării dependente de endoteliu au fost evaluate în inelele aortice de la șobolani Sprague Dawley expuși la următoarele condiții: (1) martor; (2) IS (300µM); (3) IS + CH223191 (1µM); (4) IS + CH223191 (10µM). Ulterior, țesuturile au fost evaluate pentru modificări ale expresiei markerilor redox. IS a redus nivelul maxim de relaxare dependentă de endoteliu (Rmax) cu 42% (p < 0.001) compared to control, this was restored in the presence of increasing concentrations of CH223191 (p < 0.05). Rings exposed to IS increased expression of CYP1A1, nitro-tyrosine, NADPH oxidase 4 (NOX4), superoxide, and reduced eNOS expression (p < 0.05). CH223191 (10 µM) a restabilit expresia acestor markeri la nivelurile de control (p < 0.05). These findings demonstrate the adverse impact of IS-mediated AhR activation on the vascular endothelium, where oxidative stress may play a critical role in inducing disfuncție endotelialăîn sistemul vascular al inimii şirinichi. Inhibarea AhRar putea oferi o terapie incitantă nouă pentru BCV înSetarea CKD. 

Cuvinte cheie:receptor de hidrocarbură arii; sulfat de indoxil; disfuncție endotelială; boală cronică de rinichi; boala cardiovasculara; stresul oxidativ

Contribuție cheie: sulfatul de indoxil (IS), cea mai studiată toxină uremică legată de proteine ​​și un agonist puternic al receptorului de hidrocarburi arii (AhR), este cunoscut că joacă un rol patologic înProgresia BRCșiLeziuni legate de CKDîn alte țesuturi, cum ar fi sistemul vascular. Acest studiu demonstrează că inhibarea AhR ex vivo poate preveni disfuncția endotelială indusă de IS și modificările asociate ale echilibrului redox, realizând un potențial nouțintă pentru terapia CKD

Serviciul de asistență al Wecistanche-Cel mai mare exportator de cistanche din China:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Cumpărați pentru mai multe detalii despre specificații:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

CLICK AICI PENTRU A OBȚINE EXTRACT NATURAL DE CISTANCHE ORGANIC CU 25% ECHINACOSIDE ȘI 9% ACTEOSIDE PENTRU INFECȚIA RINCHILOR

1. Introducere

CKD afectează 10% din populația globală, impactând nu numai sistemele de sănătate, ci și plasând o povară grea economică și de productivitate asupra țărilor din întreaga lume [1,2]. Riscul de boli cardiovasculare (BCV) este crescut la pacienții cu boală renală cronică (IRC) [3]. La acești pacienți, acumularea de toxine uremice circulante legate de proteine ​​(PBUTS) nedializabile, cum ar fi sulfatul de indoxil (IS), nu numai că demonstrează o mortalitate crescută prin BCV [4], dar și prezice evenimente cardiovasculare adverse la pacienții cu insuficiență cardiacă cronică [4]. 5]. IRC și nivelurile crescute de IS exacerba, de asemenea, complicațiile cardiovasculare, cum ar fi hipertrofia miocardică, dislipidemia, inflamația cronică [6], precum și disfuncția endotelială, evidențiată de dilatația mediată de fluxul arterial brahial (FMD) anormală corelată cu nivelurile serice de IS [7,8] . Alte studii au observat că îngustarea microvasculaturii la pacienții cu CKD este asociată cu scăderea ratei estimate de filtrare glomerulară [9]. Mai mult, studiile pe animale au raportat că IS, indiferent dacă este crescută într-un model de CKD sau este administrată exogen, contribuie la afectarea vasorelaxării dependente de endoteliu [10,11].

IS este derivat din metabolismul triptofanului care se acumulează progresiv în serul stadiilor 2-5 avansate ale CKD; afinitatea sa mare de legare la albumină împiedică eliminarea acesteia chiar și după dializă [4,12]. Studiile anterioare au identificat IS ca un agonist endogen la receptorul de hidrocarburi arii (AhR), un factor de transcripție dependent de ligand citosol care este exprimat constitutiv și implicat în numeroase procese biologice, cum ar fi stresul oxidativ, inflamația, remodelarea vasculară și aterogeneza [13, 14]. Activarea AhR mediată de IS induce enzima, citocromul P450 1A1 (CYP1A1) în celulele endoteliale și aceasta este asociată cu producția crescută de specii reactive de oxigen (ROS) [14,15]. Mai mult, s-a observat o expresie crescută a CYP1A1 în sângele pacienților cu CKD [16]. Inhibarea activării AhR mediată de IS cu antagonişti selectivi cum ar fi acidul 2-metil-2H-pirazol-3-carboxilic (2-metil-4-o-toli- lazo-fenil)-amida (CH223191) [17] s-a raportat că inversează inflamația indusă de IS și producerea de ROS pentru a controla nivelurile în celulele endoteliale [14,15].

Se știe că AhR joacă un rol în menținerea echilibrului redox genomic prin activarea elementelor xenobiotice de fază I și a elementelor de răspuns antioxidant de fază II (ARE) Activarea AhR declanșează un sistem de detoxifiere celulară, care este împărțit în enzime de fază I, cum ar fi CYP1A1 implicate în producția de ROS. Generarea continuă de ROS duce la interacțiunea sa cu factorul de transcripție antioxidant factorul eritroid 2-factorul înrudit (Nrf2), în plus, activarea AhR stimulează și Nrf2 [18,19]. Nrf2 împreună cu factorul de transcripție proto-oncogene c-Maf se leagă de expresia care induce ARE a enzimelor anti-oxidative de fază II NAD(P)H: chinona oxidoreductaza (NQO1) și glutation S-transferaza (GSTA1/2). CYP1A1 și NRF2 joacă un rol homeostatic în menținerea unui echilibru între pro- și anti-oxidanți [18,19].

Opțiunile de tratament care limitează efectele dăunătoare ale PBUT, cum ar fi IS, sunt limitate. Adsorbantul oral AST-120, care elimină precursorii toxinei uremice din intestin, cum ar fi indolul, reduce formarea și nivelurile circulante de IS și alte PBUT derivate din indol. AST-120 a fost utilizat în studii clinice mici, cu un oarecare succes [20–22], care a fost aprobat în mai multe țări asiatice. Cu toate acestea, studiile clinice mari de fază III EPPIC-1 și -2 (Evaluarea prevenirii progresiei în CKD) au demonstrat că AST-120 nu și-a îndeplinit obiectivul principal [23]. Acest lucru ridică necesitatea unor strategii alternative care să poată preveni mecanismul de acțiune al IS. In vitro, AhR s-a dovedit a fi o țintă eficientă a cărei inhibare poate bloca acțiunile din aval ale IS și potențial alți metaboliți ai triptofanului [13,14] și poate oferi utilitate terapeutică în reducerea riscului de BCV în CKD și atenuarea progresiei acestuia.

În timp ce majoritatea studiilor in vitro care evaluează inhibarea AhR utilizează siRNA sau inhibitori cu molecule mici, cum ar fi antagonistul pur AhR CH223191 [17], nu au fost efectuate studii ex vivo care să evalueze efectul acestui antagonist asupra relaxării endoteliale pentru a determina „dovada principiului”. Scopul prezentului studiu a fost de a evalua efectul inhibării AhR asupra țesutului aortic izolat pentru a preveni afectarea indusă de IS a funcției vasculare dependente de endoteliu prin atenuarea stresului oxidativ mediat de IS și a expresiei genei CYP1A1 asociate cu activarea AhR și, în plus, să examineze efecte asupra sistemului antioxidant.

2. Rezultate

2.1. Efectul inhibării receptorilor de hidrocarburi arii asupra relaxării dependente de endoteliu afectată de IS

Inelele aortice de la șobolani sănătoși au fost expuse la IS (10–30{0 µM) pentru a determina doza optimă de IS care provoacă afectarea relaxării endoteliale. IS la 300 µM, dar nu 10 µM sau 100 µM a redus semnificativ relaxarea dependentă de endoteliu (Rmax) la acetilcolină (ACh) comparativ cu controlul cu 32% (p < 0,05; Figura 1A), iar această concentrație a fost folosit în experimente ulterioare. În experimentele ulterioare în prezența inhibitorului AhR, CH223191 (1 și 10 pM), a fost prevenită afectarea Rmax indusă de IS (42%) (p <0,001, Figura 1B, Tabelul 1). În inelele aortice stimulate numai cu IS, potența ACh (-pEC50) a fost redusă față de control (p < 0,01) și a fost restabilită în prezența CH223191 (p < 0,05; Tabelul 1). Pentru a determina dacă inhibitorul AhR singur a afișat vreun efect intrinsec asupra relaxării dependente de endoteliu, inelele aortice au fost incubate doar cu CH223191 și nu au prezentat niciun efect asupra valorilor Rmax sau -pEC50 (Tabelul 1, de asemenea Figura suplimentară S1).

Figura 1. Efectul CH223191 asupra reactivității vasculare. (A) Expunerea inelelor aortice la IS (300 µM) a redus relaxarea dependentă de endoteliu stimulată de ACh (p < 0,05; N=6). (B) Preincubarea cu CH223191 (1 uM și 10 uM) a prevenit reducerea relaxării dependente de endoteliu indusă de IS (p < 0,001; N=10). Punctele de date exprimate ca medie ± SEM

2.2. Efectul IS asupra endoteliului și sintaza de oxid nitric endotelial

La finalizarea răspunsurilor de relaxare funcțională la ACh, secțiunile de țesut din aceste inele aortice au fost analizate prin imunohistochimie pentru celule endoteliale și expresia endotelială de oxid nitric sintaza (eNOS). Nu a existat nicio modificare a celulelor endoteliale determinate prin colorare pentru antigenul celulei endoteliale de șobolan {{0}} (RECA-1) în cele patru condiții examinate (Figura 2A). Cu toate acestea, secțiunile inelului aortic colorate pentru eNOS au demonstrat că expunerea la IS a redus semnificativ expresia eNOS cu 75% din suprafața luminală endotelială (p < 0.01), în timp ce în prezența CH223191 această reducere a fost prevenită în prezență. de 10 uM CH223191 (Figura 2B–F; p <0,05).

Figura 2. IS reduce expresia eNOS fără pierderea celulelor endoteliale. (A) Colorarea markerului de celule endotelialeRECA-1 în inelele aortice tratate cu IS în absența și prezența CH223191. (B) Expresia endotelialNOS redusă în prezența IS a fost prevenită cu CH223191. Imagini reprezentative ale colorării eNOS în țesutul de control (C), tratat cu (D) IS, IS în prezența (E) 1 uM și (F) 1{{10}} uM CH223191. Săgețile indică o colorare pozitivă. Date exprimate ca medie 土 SEM din=10 experimente. ** p < 0,01 în comparație cu țesutul martor, #fp < 0,05 în comparație cu țesutul expus ISMagnification X400.

2.3. Efectul IS și CH223191 asupra pro- și anti-oxidative

Se știe că activarea AhR indusă de IS de expresie genică crește CYP1A1. Am descoperit că IS (3{{10}}0 µM) a crescut semnificativ expresia CYP1A1 în inelele aortice după 1 și 4 ore de aproape nouă, respectiv șapte ori, comparativ cu condițiile de control (p < 0,05, Figura 3). CH223191 la 1 și 10 µM a redus expresia genei CYP1A1 mediată de IS după 1 oră de stimulare IS la niveluri similare observate în inelele expuse de control, în timp ce după 4 ore de stimulare IS, doar 10 µM CH223191 a reușit să reducă semnificativ nivelurile CYP1A1 (p < 00.001). , Figura 3). La examinarea căii antioxidante, IS în absența și prezența CH223191 nu a reușit să inducă o modificare a expresiei genelor a Nrf2, NQO1 și GSTA1/2 (vezi figura suplimentară S2)

2.4. Efectul IS și CH223191 asupra markerilor stresului oxidativ și inflamației

Pentru a examina în continuare modificările echilibrului redox, țesuturile din experimentele funcționale au fost analizate pentru a examina modificările markerilor de stres oxidativ, și anume nicotinamidă adenin dinucleotide fosfat (NADPH) oxidaza 4 (NOX4), expresia superoxidului și nitro-tirozină. Țesuturile expuse la IS au demonstrat o creștere cu 180% a expresiei NOX4 (Figura 4; p < 0.001). În prezența CH223191 (1 și 10 uM), expresia NOX 4 a fost redusă semnificativ în comparație cu IS (Figura 4; p <0.001). Expunerea la IS a crescut nivelurile de expresie ale nitro-tirozinei, un marker al leziunii celulare și al colorării inflamației cu 90% în comparație cu martor (Figura 5; p < 0,05), în timp ce în prezența CH223191 (10 µM), expresia nitro-tirozinei a fost redusă. înapoi la nivelurile de control (Figura 5; p < 0,05). Expresia moleculei reactive a speciei de oxigen, superoxidul, a fost determinată prin colorare cu dihidroetidiu (DHE). Expunerea la IS a crescut colorarea cu DHE cu 430% comparativ cu martor (Figura 6; p < 0,001), în timp ce în prezența CH223191 la ambele doze, expresia superoxidului a fost redusă înapoi la nivelurile de control, așa cum se arată în Figura 6; (p < 0,001

Expresia genică a markerilor inflamatori a fost, de asemenea, examinată în aorta stimulată cu în absența și prezența fie a CH223191. IS a produs o creștere nesemnificativă de 111 și, respectiv, 55% a expresiei genei factorului de necroză tumorală a (TNFa) și a moleculei de adeziune a celulelor vasculare-1VCAM-1), la 4 ore. În prezența CH223191, nivelurile de expresie ale ambelor gene au fost reduse semnificativ, așa cum se arată în Figura 7 (p < 0.05).

Figura 6. CH223191 a prevenit expresia superoxidului indusă de IS. (A) Cuantificarea colorației DHE în inelele aortice tratate cu S în absența și prezența CH223191. Imagini reprezentative ale exprimării superoxidului în țesutul de control (B), tratat cu IS (C), IS în prezența (D) 1 uM și (E) 1{{10}} M CH223191Date exprimate ca SEM mediu din N=10 experimente. *** p < 0,001 comparativ cu țesutul martor#### p < 0,001 comparativ cu țesutul expus IS. Mărire x200.

Figura 7. Efectul inhibiției IS și Ahk asupra expresiei genelor inflamatorii. Expunerea inelelor aortice la IS a crescut nesemnificativ (A) TNFa și (B) expresia genei VCAM-1 la 4 ore. În prezența CH223191, expresia TNFx și VCAM-1 a fost prevenită. Date exprimate ca medie 土 SEM din=6 experimente. # p < 0.05 în comparație cu țesutul expus IS.