Pe baza farmacologiei de rețea și a experimentelor pe animale pentru a explora efectul glicozidei feniletanoid din Cistanche Tubulosa asupra efectului nefropatiei diabetice

Rezumat: Obiectiv Să exploreze efectulCistancheglicozide feniletanol(CPhGs) activatboli renale diabetice(DKD) bazat pe farmacologia de rețea și experimente pe animale. Metode Metoda UHPLC-QE-MS a fost utilizată pentru a analizacomponentele chimice ale CPhG. Bazele de date TCMSP și Swiss Target Prediction au fost utilizate pentru a verifica componentele de bază. Bazele de date OMIM și GeneCards au fost utilizate pentru a obține ținte legate de DKD. După obținerea țintelor comune, site-ul web STRING a fost folosit pentru a construi o rețea de interacțiune cu proteine. Baza de date DAVID a fost utilizată pentru analiza căii GO, KEGG și software-ul Cytoscape a fost utilizat pentru a construi rețeaua „CPhGs core component-target-pathway”. Zece șobolani au fost selectați aleatoriu ca grup normal, iar șobolanii rămași au fost hrăniți cu hrană bogată în zahăr și grăsimi și au primit o singură injecție intraperitoneală de STZ pentru a stabili un model DKD. Aceștia au fost împărțiți în grupul model, grupul dapagliflozin (1 mg/kg) și CPhG în doză mare și medie și mică (500, 25{{40}}, 125 mg/kg), 10 animale în fiecare grup, intervenție medicamentoasă timp de 6 săptămâni, s-au observat condiții generale, s-a determinat greutatea corporală și s-a testat glicemia în fiecare săptămână; Urina de 24 de ore a fost colectată după ultima doză. Detectează proteina totală din urină pe 24-oră (24-UTP); colectează sânge din aorta abdominală și sacrifică-l, separă serul și detectează azotul ureic (BUN), acidul uric (UA), colesterolul total (TC), trigliceridele (TG) și hipertensiunea arterială. Nivelurile de lipoproteine ​​de înaltă densitate (HDL) și de lipoproteine ​​de densitate joasă (LDL), colorarea HE și colorația Masson au fost folosite pentru a observa modificări patologice în țesutul renal, ELISA a fost folosit pentru a detecta IL-1 , IL{{17} }, și nivelurile de TNF- și Western blot a fost utilizat pentru a detecta țesutul renal. Expresia proteinei JAK2, p-JAK2, STAT3, p STAT3, SOCS3. Rezultate Un total de 699 de componente au fost detectate prin tehnologia UHPLC-QE-MS. După screening, s-au obținut 16 componente de bază ale CPhG și 323 de ținte aferente. CPhG și DKD au împărtășit 99 de ținte. Țintele cheie au fost STAT3, SRC, EGFR etc. Analiza căii KEGG a analizat 151 de căi de semnalizare, arătând că calea de semnalizare IL-17, calea de semnalizare PI3K/Akt, calea de semnalizare TNF etc. pot juca un rol cheie în tratamentul DKD de către CPhG. CPhG pot crește greutatea corporală a șobolanilor DKD (P<0,01), reduce consumul de apă (P<0,01), reglează metabolismul glucozei și lipidelor, reduc 24-nivelurile UTP și BUN (P<0,01) și îmbunătățesc țesutul renal . Leziunile patologice au redus expresia proteinei p-JAK2/JAK2 și p-STAT3/STAT3 în țesutul renal (P<0,01) și a crescut expresia proteinei a SOCS3 (P<0,01). Concluzie CPhG intervin în DKD prin mai multe componente, mai multe ținte și mai multe căi, posibil prin inhibarea JAK2/

Calea de semnalizare STAT3.

Cuvinte cheie: Cistanche feniletanol glicozidă; nefropatie diabetica; UHPLC-QE-MS; farmacologia de rețea; experiment pe animale; Calea de semnalizare JAK2/STAT3

CÂT TIMP TREBUIE PENTRU CISTANCĂ PENTRU PACIENȚI DE RINCHI?

Boala diabetică de rinichi (DKD), ca una dintre cele mai importante complicații microvasculare ale diabetului zaharat, nu este doar factorul principal care duce laboală cronică de rinichidar și principala cauză a bolii renale în stadiu terminal (IRST) la nivel mondial. Motivul [1-2]. Tratamentul clinic al DKD implică în principal controlul zahărului din sânge, tensiunii arteriale și lipidelor din sânge și, în al doilea rând, protejarea funcției renale, evitarea utilizării medicamentelor nefrotoxice și îmbunătățirea stilului de viață [3-4]. Cu toate acestea, din cauza patogenezei complexe a DKD și a lipsei unor ținte specifice de intervenție, opțiunile de tratament actuale au limitări și nu sunt eficiente. Incidența DKD în stadiu terminal este încă în creștere. Prin urmare, este de mare importanță să găsiți medicamente naturale eficiente.

Cistanche Deserticola Y． C． Ma sauCistanche C.Tulpinile cărnoase uscate aleCistanche tubulosa (Schenk) Wightcu frunze solzoase [5] au fost înregistrate pentru prima dată în „Shen Nong’s Materia Medica” și au fost listate ca fiind de top. Ele sunt cunoscute sub denumirea de „ginseng din deșert” [6]. Sunt dulci, sărate și calde. , revine la meridianele rinichilor și intestinului gros și are efecte de hrănire a yang-ului rinichilor, de reumplere a esenței și a sângelui, umezirea intestinelor și laxativ. Cercetările arată că glicozidele feniletanoide (CPhG) sunt unul dintre principalele sale ingrediente active și sunt responsabile pentru dezvoltarea sa.

Baza materială pentru exercitarea efectelor farmacologice; Extractul de Cistanche are efecte antidiabetice [7-8], anti-cancer hepatic [9], protecție renală [{10-11], neuroprotectoare [12-13] și alte efecte farmacologice, dar în prezent, CPhG nu sunt eficiente în tratarea DKD. Efectele și mecanismele sale sunt neclare.

Acest studiu a folosit metode de farmacologie de rețea și de andocare moleculară [14], luând CPhG-urile ca obiect de cercetare, prezicând și analizând principalele sale ingrediente active și potențialele ținte pentru tratamentul DKD și apoi stabilind o combinație de streptozocină (STZ) indusă de streptozocină (STZ). Modelul de șobolan DKD hrănit cu furaj lipidic a fost folosit ca subiect de cercetare in vivo, pentru a oferi referință pentru extinderea clinică și aplicarea tratamentelor conexe și cercetări ulterioare privind mecanismul de acțiune.

1 Material

1.1 Animale

70-șobolanii masculi SD în vârstă de o săptămână, cu nivel SPF, greutate corporală (240±20) g, au fost achiziționați de la Centrul de experimente cu animale al Universității de Medicină Xinjiang [Licența de utilizare experimentală a animalelor nr. SYXK (nouă) {{4} }], la Animalele au fost crescute adaptiv timp de 1 săptămână la o temperatură de (22 ± 2) grade, o umiditate relativă de 50% până la 70% și un ciclu alternativ de lumină și întuneric de 12 ore/12 ore. Experimentul a fost aprobat de Comitetul de etică a animalelor al Centrului pentru animale experimentale medicale al Universității Medicale din Xinjiang (numărul de etică IACUC-20220127-19).

1.2 Reactivi și medicamente

CPhGs (batch number 201610, purity >80%) au fost furnizate de Xinjiang Hotan Dichen Co., Ltd. Dapagliflozin (număr de lot NB2248) a fost achiziționat de la AstraZeneca, Marea Britanie. Furajele bogate în zahăr și grăsimi (Cat. Nr. Boaigang-B1135DM) și STZ (Lotul Nr. 2021110307) au fost achiziționate de la Beijing Boai Port Biotechnology Co., Ltd.; microalbumină urinară (Lotul nr. 20220611), azot ureic (Lotul nr. 20220626), acid uric (Lotul nr. 20220613), colesterol total (numărul lotului 20220615), trigliceride (numărul lotului 20220616), lipoproteină cu densitate ridicată (numărul lotului 20220616) ), și lipoproteine ​​cu densitate joasă (număr de lot 20220615) au fost achiziționate de la Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute; interleukină-6 (IL{-6, numărul de lot JL20896), interleukina-1 (IL{-1, numărul de lot JL20884) și factorul de necroză tumorală- (TNF-, numărul de lot 13202 ) au fost achiziționate de la Shanghai Jianglai Biotechnology Co., Ltd.; Anticorp policlonal de iepure JAK2 (număr lot 22v9316), anticorp policlonal de iepure p-JAK2 (număr lot 78g9360), anticorp policlonal de iepure STAT3 (număr lot 15x8824), anticorp policlonal de iepure p-STAT3 (număr lot 74m1478), anticorp policlonal de iepure SOCS3 (nr. numărul 31d4841) au fost toate achiziționate de la Jiangsu Qianke Biotechnology Research Center Co., Ltd.; Anticorpul policlonal IgG de capră anti-iepure marcat cu HRP (număr de lot 20000758) a fost cumpărat de la Wuhan Mitaka Biotechnology Co., Ltd.; -anticorp monoclonal de iepure actină (număr de lot AC230205001), tampon de liză RIPA (număr de lot 20220416), truse de determinare a concentrației proteinei BCA (număr de lot 20230401) au fost achiziționate de la Beijing Solebao Technology Co., Ltd.

1. 3 Instrumente

Cromatografie lichidă de ultra-înaltă performanță Vanquish, spectrometru de masă de înaltă rezoluție Q Exactive Focus, centrifugă Heraeus Fresco17, cititor automat de microplăci FC (Thermo Fisher Scientific, SUA); râșniță JXFSTPRP-24 (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd.); Contor de apă pură Mingche D24 UV (Germania Merck Millipore Company); Coloana ACQUITY UPLC BEH C18 (1, 7 μm, 2, 1 mm×100 mm) (American Waters Company); glucometru Accu Chek Performa (Compania Elvețiană Roche); Criostat CM1850UV, microscop cu fluorescență vertical DM300 (Compania Leica, Germania); Contor vortex GL-88B (Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); balanță analitică electronică (Compania Bio-Rad, SUA).

2 metode

2. 1 Analiză UHPLC-QE-MS

2.1.1 Prepararea soluției de testare

Se cântăresc 100 mg CPhG, se adaugă 500 μL 80% metanol, se vortexează timp de 30 de secunde, se ultrasonică într-o baie de apă cu gheață timp de 1 oră, se lasă să stea la grade -40 timp de 1 oră, se centrifughează la 4 grade , 12 000 r/min timp de 15 min, se aspiră supernatantul, 0. Se filtrează printr-o membrană microporoasă de 22 μm și se păstrează la frigider de -80 grade.

2.1.2 Condiții cromatografice

Coloana ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm); acetonitril în fază mobilă (A) -1% acid formic (B), gradient de eluare (0 ~ 11 min, 15% ~ 75% A; 11 până la 12 minute, 75% până la 98% A; 12 până la 14 min, 98% A; 14 până la 14, 1 min, 98% până la 15% A; Debitul volumic 0 . 5 ml/min; temperatura coloanei 35 de grade; volum de injectare 5 μL.

2.1.3 Condiții de spectrometrie de masă

scanare completă ddMS2 modul de scanare completă; debitul volumic al gazului învelișului 45 arb; debit volumic gaz auxiliar 15 arb; temperatura capilară 400 grade ; energia de coliziune în modul NCE 15% ~ 30% ~ 45% ciclu; tensiune de pulverizare ± 4. 0 kV.

2.2 Cercetare în Farmacologie de Rețea

2. 2. 1 CPhG-uri

Verificarea țintei componentelor: Sortați componentele chimice analizate de UHPLC-QE-MS în funcție de conținutul relativ și ștergeți-le pe cele ale căror structuri chimice nu au fost încă determinate. Introduceți numărul de serie InChIKey al ingredientelor analizate în baza de date TCMSP pentru a obține parametrii farmacocinetici ai fiecărui ingredient. Pe baza condițiilor de biodisponibilitate orală (OB) > 30% și de asemănare cu medicamentul (DL) > 0,18, candidații care îndeplinesc cerințele vor fi examinați. Introduceți numărul SMILES al fiecărei componente în baza de date Swiss Target Prediction pentru a prezice ținta și a obține ținta componentei chimice CPhGs.

2. 2. 2 DKD

Screeningul țintei bolii Utilizați „nefropatie diabetică” ca termen de căutare pentru a căuta ținte ale bolii în bazele de date OMIM, GeneCards și NCBI.

2. 2. 3 Construcția rețelei componentă-țintă-boală

Țintele încrucișate ale componentelor și bolilor CPhG au fost obținute prin maparea software-ului R, iar software-ul Cytoscape 3.7.2 a fost utilizat pentru a construi un sistem de rețea component-țintă, în care plug-in-ul de analiză a detectat ținte de bază.

2. 2. 4 Construirea rețelei de interacțiune proteină-proteină (PPI)

Importați proteinele țintă de intersecție ale componentelor și bolilor în baza de date STRING, construiți o rețea de interacțiune proteină-proteină (PPI), ștergeți proteinele fără noduri conectate în rețea și setați nivelul de încredere al celui mai scăzut scor de interacțiune proteină la {{1} }.700. Construiți o rețea PPI, descărcați rezultatele în format TSV, importați-le în software-ul Cytoscape 3.7.2 și utilizați plug-in-ul de analiză pentru a analiza în continuare obiectivele principale.

2. 2. 5 GO, analiza KEGG

Utilizați secțiunea Adnotare funcțională din baza de date DAVID pentru a efectua o analiză de îmbogățire a țintelor de intersecție ale bolilor componente. Mai întâi setați parametrii de analiză, introduceți ținta de intersecție în caseta Gene List, selectați official-gene-symbol ca identificator țintă, selectați Gene List ca tip de date (List Type) și selectați „Homo Sapiens (Species)” ca tip de date. sursa țintă (Specia). Race)", începeți analiza după confirmarea parametrilor de analiză, obțineți rezultatele analizei GO și KEGG și apoi utilizați platforma de desen online ImageGP pentru a desena diagrama cu bule a rezultatelor analizei KEGG și GO. Software-ul Cytoscape 3.7.2 construiește componenta -Imaginea rețelei de cale țintă.

2. 2. 6 Andocare moleculară

Mai întâi descărcați diagrama structurii 3D a ingredientului activ în format SDF din baza de date PubChem, apoi descărcați diagrama structurii 3D a țintei de intersecție în format PDB din Baza de date globale a proteinelor (PDB) din SUA și, în final, încărcați-o în CB-Dock site web pentru andocare moleculară. Ecranați conformațiile de andocare dominante și vizualizați-le cu Pymol.

2.3 Experimente pe animale

2.3.1 Modelare, grupare și administrare de medicamente

10 șobolani au fost selectați aleatoriu ca grup normal și hrăniți cu hrană obișnuită, iar șobolanii rămași au fost hrăniți cu hrană bogată în zahăr și grăsimi. După 6 săptămâni, li s-a administrat o singură injecție intraperitoneală de 30 mg/kg STZ (0, 1 mmol/L STZ dizolvată în tampon cu citrat de sodiu cu pH 4, 5), iar 72 de ore mai târziu, s-a prelevat sânge din vena cozii. pentru a detecta glicemia a jeun (FBG). Dacă FBG este mai mare sau egal cu 16,7 mmol/L, modelul diabetului zaharat a fost stabilit cu succes [15]; continuare Au fost hrăniți cu hrană bogată în zahăr și grăsimi timp de 2 săptămâni. S-a stabilit că modelarea DKD are succes pe baza pozitivității glucozei din urină și a proteinei totale din urină pe 24-oră (24-UTP) mai mare sau egală cu 20 mg. Dintre aceștia, 3 au murit în timpul procesului de modelare și 7 nu au avut succes. , un total de 50 au avut succes. Șobolanii care au fost modelați cu succes au fost împărțiți aleatoriu în grupul model, grupul dapagliflozin (1 mg/kg) și grupurile cu doze mari, medii și mici (500, 250, 125 mg/kg) cu CPhG. Fiecare grup de administrare a fost administrat intragastric. Șobolanilor din grupul normal și grupul model li s-au administrat medicamentele corespunzătoare, iar șobolanilor din grupul normal și grupul model li s-a administrat aceeași cantitate de soluție salină normală prin gavaj, o dată pe zi, timp de un total de 6 săptămâni. În timpul perioadei de administrare, șobolanii din fiecare grup, cu excepția grupului normal, au continuat să li se administreze hrană bogată în grăsimi.

2.3.2 Detectarea indicatorului biochimic

După 6 săptămâni de intervenție CPhG, s-a colectat urină de 24-oră de la șobolani și s-a măsurat proteina totală din urină de 24-oră (24-UTP); sângele a fost colectat din vena coadă a postului pentru a detecta nivelurile FBG; S-a recoltat sânge din aorta abdominală, 4 grade, 1500 r/min. Se centrifugă timp de 10 minute pentru a separa serul și a detecta azotul ureic seric.

BUN), acid uric (UA), colesterol total (TC), trigliceride (TG), lipoproteine ​​de înaltă densitate (HDL), niveluri de lipoproteine ​​cu densitate joasă (lipoproteine ​​cu densitate joasă LDL).

2.3.3 Observarea morfologiei patologice a țesutului renal

Șobolanii au fost anesteziați cu pentobarbital de sodiu și sacrificați. Rinichii au fost desprinși, cântăriți, fixați cu paraformaldehidă 4%, deshidratați, transparenți, înmuiați în ceară, încorporați și secționați pentru colorarea cu hematoxilină-eozină (HE).

După colorarea Masson, morfologia țesutului a fost observată la microscop și a fost utilizat software-ul Image-Pro Plus 6.0 pentru a analiza densitatea optică integrată și a cuantifica suprafața relativă a fibrei de colagen.

2. 3. 4 ELISA

Metoda a fost folosită pentru a detecta nivelurile factorilor inflamatori serici la șobolani. Nivelurile de IL-6, IL-1 și TNF- au fost detectate conform instrucțiunilor trusei.

2. 3. 5 Metoda Western blot pentru a detecta expresia proteinelor asociate

A fost prelevat țesut de rinichi de șobolan, a fost adăugat lizat RIPA pentru a extrage proteina totală, iar concentrația a fost determinată prin metoda BCA.

După electroforeza pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă, transferați pe membrana PVDF și, după blocare, JAK2 (1: 2000), p-JAK2 (1: 1000), STAT3 (1: 2000), p -STAT3 (1: 2000), Anticorpi SOCS3 (1:2000), -actină (1:2000), se incubează la 4 grade peste noapte, se adaugă anticorp secundar IgG marcat cu HRP (1:5000) și se incubează la temperatura camerei timp de 1 oră, dezvoltat cu kit de electroluminiscență, expus prin imager cu gel de proteine, folosind software-ul Image J

Analiza cantitativă a pieselor. Folosind -actina ca referință internă, raportul dintre valoarea gri a benzii țintă și banda de referință internă este expresia relativă a proteinei.

2.4 Analiză statistică

Datele au fost procesate de software-ul SPSS 25.0, iar datele au fost exprimate ca (x±s). Analiza unidirecțională a varianței a fost utilizată pentru compararea între grupuri. P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.