Imunitatea instruită indusă de BCG îmbunătățește răspunsurile la vaccinarea acelulară împotriva pertussis într-un studiu clinic explorator randomizat

INTRODUCERE

Pertussis este o boală respiratorie acută foarte transmisibilă cauzată de bacteria Bordetella pertussis și a reapărut ca o problemă gravă de sănătate publică, în ciuda acoperirii vaccinale mari1. Ani de zile, boala a fost controlată în țările industrializate prin vaccinare cu vaccinuri pertussis cu celule întregi (wPs) care au fost implementate în anii 1940-1950. Aceste vaccinuri au fost extrem de eficiente și au indus protecție pe termen lung.

Cu toate acestea, preocupările ridicate de reactogenitate și siguranță au condus la înlocuirea lor în anii 1990-2000 cu vaccinuri acelulare împotriva pertussis (aPs). Vaccinurile de rapel aP, inclusiv vaccinurile combinate care conțin toxoid tetanos și difteric (Tdap), fie cu sau fără poliovirus inactivat (IPV) (Tdap-IPV), au fost introduse la scurt timp după aceea. Vaccinurile aP sunt acum utilizate pe scară largă pentru a stimula imunitatea copiilor preșcolari, adolescenților și adulților. În ciuda acestor măsuri și a profilului lor de siguranță îmbunătățit, mai multe studii au arătat că imunitatea indusă rămâne suboptimă2 și scade în timp3. În plus, durata protecției după doze repetitive de aP se scurtează progresiv4–6. Nevoia tot mai mare de strategii de vaccinare noi și îmbunătățite a condus la explorarea de noi adjuvanți care vizează imunitatea înnăscută și sporesc imunitatea specifică la aPs7-9.

Vaccinurile combinate pot stimula imunitatea. Vaccinurile combinate sunt o combinație de mai multe vaccinuri diferite de prevenire a bolilor care oferă mai multe protecții pacienților în același timp, reducând stresul și durerea de a primi mai multe injecții. În același timp, vaccinul combinat poate îmbunătăți și imunitatea celui vaccinat, deoarece poate stimula mai multe răspunsuri imune și poate produce mai mulți anticorpi și celule imunitare, îmbunătățind eficient capacitatea de a preveni multe boli diferite. Îmbunătățirea imunității este foarte importantă în viața noastră de zi cu zi. Cistanche poate crește imunitatea. Polizaharidele din carne pot regla răspunsul imun al sistemului imunitar uman, pot îmbunătăți capacitatea de stres a celulelor imunitare și pot spori efectul de sterilizare a celulelor imune.

Faceți clic pentru a afla ce este cistanche

Vaccinul Bacille Calmette-Guérin (BCG) protejează împotriva infecțiilor micobacteriene, cum ar fi tuberculoza10, precum și împotriva infecțiilor secundare cu agenți patogeni neînrudiți în modelele de șoarece1. La oameni, aceste efecte benefice nespecifice au fost legate de reducerea mortalității infantile11,12 și au fost validate în studii clinice randomizate10,13. BCG induce modificări pe termen lung în celulele imune înnăscute care le îmbunătățesc răspunsul la stimularea cu agenți patogeni neînrudiți. Acest proces numit imunitate antrenată, implică reprogramarea epigenetică a monocitelor și persistă până la un an după vaccinarea BCG14. Relevanța clinică a imunității antrenate a fost demonstrată la om prin studii care utilizează BCG ca prototip pentru inducerea imunității antrenate și vaccinare sau infecția umană experimentală ca perturbare imună secundară15–17. Există dovezi acumulate că vaccinarea BCG modulează răspunsurile imune adaptative la vaccinuri. Dintre opt studii care au fost evaluate într-o revizuire recentă, cinci au arătat răspunsuri umorale îmbunătățite specifice vaccinului18.

Eforturile de a delimita efectele de interacțiune ale vaccinurilor BCG și pertussis sugerează că imunitatea antrenată indusă de BCG poate avea un efect pozitiv asupra răspunsului imun la pertussis. La șoareci, vaccinarea anterioară cu BCG a îmbunătățit răspunsurile imune umorale și Th1 după vaccinarea aP, dar nu a vaccinării wP19. La oameni, un studiu la scară populațională a arătat că administrarea concomitentă de BCG cu vaccinarea pertussis a redus mortalitatea la sugari20, comparativ cu primirea secvenţială a vaccinurilor. Din câte cunoștințele noastre, niciun studiu până în prezent nu a investigat într-un studiu controlat randomizat dacă imunitatea antrenată modulează răspunsurile imune la vaccinurile pertussis sau a comparat momentul administrării vaccinării BCG în raport cu o a doua vaccinare sau provocare.

Aici, am testat dacă vaccinarea BCG are un impact asupra răspunsului imun adaptativ la o vaccinare și dacă imunitatea antrenată este asociată cu aceste răspunsuri. Arătăm că imunitatea antrenată indusă de BCG îmbunătățește anticorpul specific aP, răspunsurile celulelor Th1 specifice aP și răspunsurile celulelor B cu memorie totală la 2 săptămâni după imunizarea Tdap-IPV. Aceste creșteri au fost corelate pozitiv cu biomarkeri de imunitate antrenați crescuti, inclusiv IL-1 și IL-6. Descoperirile noastre evidențiază rolul imunității antrenate induse de vaccinarea BCG în potențarea imunității la vaccinurile pertussis.

REZULTATE

Design de studiu

Seventy-five healthy female volunteers were randomized to one of three cohorts to receive BCG and Tdap-IPV vaccines in different orders21. We chose to enroll only women since gender-specific effects of pertussis vaccines have been reported 22. The median age of the volunteers was 23, with no significant difference in age between cohorts (Kruskal–Wallis test; P = 0.6), as previously reported21. Two subjects were excluded from analysis for having a high anti-pertussis toxin IgG concentration before Tdap-IPV vaccination (>100 UI/ml), indicând infecția recentă cu pertussis23,24 (Fig. 1a).

Pentru a identifica schimbările în răspunsul la vaccinul TdapIPV care sunt asociate cu imunitatea instruită, cohorta „instruită cu BCG” a primit BCG cu 3 luni înainte de TdapIPV. Am inclus, de asemenea, două cohorte de control pentru a ține cont de momentul vaccinării BCG. Cohorta „BCG plus Tdap” a primit ambele vaccinări în membre opuse în același timp, iar cohorta „Tdap-IPV” a primit Tdap-IPV mai întâi și BCG 3 luni mai târziu (Fig. 1b). Sângele a fost recoltat în mai multe momente înainte și după vaccinări. Marcajele temporale sunt definite în raport cu valoarea inițială a vaccinării Tdap-IPV (-M3=3 luni înainte, -M3 plus W2 = 3 luni înainte plus 2 săptămâni, D0=valoarea inițială a Tdap-IPV sau vaccinări concomitente BCG și Tdap-IPV, W2=2 săptămâni după aceea, M3 plus W2=3 luni plus 2 săptămâni după aceea, Y1=1 an după aceea). Rezultatele primare au fost specificate ca creșteri ale răspunsurilor imune adaptive la 2 săptămâni sau la 1 an după vaccinarea Tdap-IPV.

În total, am evaluat 31 de rezultate imunologice în trei cohorte de vaccinare. Am folosit un imunotest multiplex pe bază de perle pentru a măsura concentrațiile de anticorpi de IgG împotriva toxinei pertussis (PT), hemaglutinină filamentoasă (FHA), pertactină (PRN), precum și toxoid difteric (DIPH) și toxina tetanos (TET)25. Celulele B totale și celulele B specifice PRN au fost măsurate direct în sânge total prin citometrie în flux utilizând PRN marcat fluorescent (Fig. 1 suplimentară). Răspunsurile celulelor T Th1 și Th17 împotriva antigenelor pertussis au fost măsurate prin stimularea celulelor mononucleare din sângele periferic (PBMC) fie cu PRN, PT, fie FHA timp de 7 zile și măsurarea IFN, IL22 și IL{12}} secretate prin ELISA26.

Vaccinarea BCG îmbunătățește răspunsurile citokinelor celulelor imune la stimuli neînrudiți, un fenomen care a fost explicat prin două mecanisme biologice diferite. Primul proces se numește imunitate heterologă și depinde de activarea nespecifică a celulelor T27,28. Al doilea proces numit imunitate antrenată are ca rezultat creșterea producției de citokine proinflamatorii de către celulele imune înnăscute14. Am definit rezultatele secundare pentru cohorta BCGtrained ca modificări ale producției de citokine a PBMC după stimularea cu Candida albicans (C_alb), Staphylococcus aureus (S{_aur), Bordetella pertussis (Bp) ucisă de căldură (Bp) sau lipopolizaharidă (LPS). Ca și în studiile anterioare16,21, am cuantificat citokinele Th1/17 IFN , IL-22 sau IL{-17 după 7 zile ca citire pentru imunitatea heterologă sau citokinele derivate din monocite IL-10 , IL-6, IL{-1 sau TNF după 24 de ore ca citire pentru imunitatea antrenată (Fig. 1b). Producția de citokine ca răspuns la Mycobacterium tuberculosis (Mtb) sonicat a fost măsurată pentru a cuantifica imunitatea anti-micobacteriană.

Vaccinarea anterioară BCG îmbunătățește răspunsurile imune adaptative induse de Tdap-IPV

Pentru a cuantifica efectele imunității antrenate asupra vaccinării Tdap-IPV, pentru fiecare obiectiv primar, am construit un model liniar cu efecte mixte cu timpul de eșantionare, apartenența la cohortă, precum și interacțiunea timpului și a cohortei ca covariate. Am examinat două contraste: (i) diferențele în comparație cu valoarea inițială (D0) în cadrul fiecărei cohorte (efecte post-vaccinare, Tabelul suplimentar 1) și (ii) diferențele între cohorte în amploarea acelor modificări (diferențial). efecte, Tabelul suplimentar 2). Toate cohortele au înregistrat creșteri semnificative ale răspunsurilor anticorpilor la cei cinci antigeni după imunizarea Tdap-IPV. Concentrațiile de anticorpi au rămas mai mari decât valoarea inițială până la un an după vaccinare (Y1), cu excepția TET, care a scăzut în cohortele BCGtrained și BCG plus Tdap (Fig. 2a suplimentară).

Toate cohortele au avut un număr semnificativ crescut de PRN circulant plus celule B la 2 săptămâni după imunizare, care au fost în principal celule B de memorie (MBC) (Figura suplimentară 3a). Nu am observat diferențe între cohorte (Tabelul suplimentar 2 și Fig. 3b suplimentar). În comparație cu cohorta Tdap-IPV, cohorta antrenată cu BCG a afișat modificări log1{{10}} (W2/D0) pentru răspunsurile IgG pentru PT, FHA și PRN. Un model similar a fost observat la compararea acestor răspunsuri cu cohorta BCG plus Tdap (Fig. 2a). Am observat, de asemenea, concentrații crescute de IgG specifice pertussis în cohorta instruită cu BCG la 2 săptămâni după vaccinare (Figura 2b suplimentară), deși diferența dintre valorile absolute a fost mai puțin pronunțată decât diferența de creșteri care sunt relativ la valoarea de bază la D0.

În plus, subiecții din cohorta instruită cu BCG au afișat răspunsuri totale MBC semnificativ crescute, inclusiv MBC-uri cu schimbarea clasei IgG (Fig. 2b și Fig. 4 suplimentară). Subiecții din cohorta instruită cu BCG au prezentat, de asemenea, secreție crescută de IFN ca răspuns la stimularea cu toate cele trei antigene pertussis. În schimb, au fost observate creșteri semnificative pentru un singur antigen pertussis în cohorta Tdap-IPV (PT) și două antigene pertussis în cohorta BCG plus Tdap (PT și FHA, Fig. 2c și Fig. 5 suplimentară). De asemenea, am observat o tendință în care creșterile producției de IFNg au fost mai mari în cohorta instruită cu BCG decât în ​​celelalte cohorte, deși acest lucru nu a atins o semnificație statistică (Tabelul suplimentar 2 și Fig. 5b suplimentară). Răspunsurile IL-22 și IL-17 specifice pertussis au fost slabe pentru toate cohortele (Tabelul suplimentar 1). În total, aceste constatări indică răspunsuri îmbunătățite cu anticorpi specifici pertussis, răspunsuri MBC cu comutare IgG totale îmbunătățite și răspunsuri IFN mai largi specifice pertussis în cohorta instruită cu BCG în comparație cu celelalte două cohorte.

Am explorat relațiile dintre creșterile rezultatelor primare care au fost îmbunătățite în cohorta instruită cu BCG. Pentru această analiză exploratorie, corelațiile dintre anticorpi, celule B și citokine au fost calculate pentru fiecare cohortă. Cohorta instruită cu BCG a afișat multe corelații pozitive semnificative și mai puternice din punct de vedere cantitativ între aceste răspunsuri, în timp ce cohortele Tdap-IPV și BCG plus Tdap au afișat corelații mai slabe sau inverse, modelul cel mai puternic corespunzând modificărilor răspunsurilor IFN (Fig. 3a). Coeficienții de corelație între răspunsurile la BCGtrained au fost semnificativ mai mari decât cei din cohortele de control, indicând în totalitate inducerea unui răspuns imun adaptativ specific pertussis mai înalt coordonat în cohorta instruită cu BCG (Fig. 3b).

Producția de citokine IL-1 și IL-6 este asociată cu răspunsuri imune adaptative specifice pertussis

Cohorta instruită cu BCG a afișat răspunsuri MBC cu comutare IgG totale și IFN specifice pertussis. În plus, în comparație cu cohortele Tdap-IPV și BCG plus Tdap, cohorta instruită cu BCG a afișat, de asemenea, răspunsuri mai mari de anticorpi pertussis. Deoarece vaccinarea BCG la oameni poate crește producția de citokine a celulelor imune circulante ca răspuns la stimularea heterologă, la săptămâni sau luni după vaccinare27, am evaluat dacă aceste răspunsuri citokine induse de BCG au fost asociate cu modificări ale răspunsurilor imune specifice pertussis după vaccinarea Tdap-IPV. La două săptămâni și 3 luni după vaccinarea BCG, a existat un răspuns anti-micobacterian semnificativ îmbunătățit, caracterizat printr-o producție crescută de IL-22 și IFN în comparație cu valoarea inițială a vaccinării BCG (Fig. 6a, b suplimentară).

În general, cohorta instruită cu BCG nu a prezentat o producție crescută de imunitate heterologă sau citokine antrenate asociate imunității, așa cum sa observat anterior (Figurile suplimentare 6 și 8)21. Cu toate acestea, deoarece inducerea producției de citokine a variat între indivizi, am calculat modificări între 2 săptămâni după BCG și 3 luni după BCG în comparație cu valoarea inițială a BCG (Figurile suplimentare 7 și 9). Corelațiile Pearson au fost calculate pentru a determina puterea asocierii dintre aceste măsurători la fiecare punct de timp. La trei luni după vaccinarea BCG, adică la momentul inițial Tdap-IPV, răspunsurile citokinelor la stimularea in vitro au fost foarte corelate. Răspunsurile heterologe ale citokinelor asociate imunității au fost corelate negativ cu răspunsurile antrenate ale citokinelor asociate imunității, iar dintre acestea, corelațiile dintre IL-6 și IL{-1 au fost cele mai puternice (Fig. 4), așa cum a fost descris anterior16. Modelele de corelare la 2 săptămâni după vaccinarea BCG au fost similare pentru citokinele heterologe asociate imunității, dar corelațiile dintre citokinele antrenate asociate imunității au fost mult mai slabe, cu excepția răspunsurilor IL-10. Luate împreună, aceste rezultate indică activarea imună înnăscută coordonată la 3 luni, dar nu la 2 săptămâni după imunizarea cu BCG în cohorta instruită cu BCG.

Apoi, am explorat dacă variațiile răspunsurilor la citokine ale cohortei antrenate de BCG au fost asociate cu modificări ale obiectivelor imune adaptive TdapIPV. Am examinat modificările producției de citokine la 2 săptămâni și 3 luni după vaccinarea BCG. Am descoperit că creșterile citokinelor heterologe asociate imunității au avut tendința de a fi slab și negativ corelate cu obiectivele primare atât la 2 săptămâni (Figura 10 suplimentară) cât și la 3 luni după vaccinarea BCG (Fig. 5a). În schimb, creșterile citokinelor antrenate asociate imunității la 3 luni după vaccinarea BCG, în special IL-1 /IL{{-6 ca răspuns la stimularea LPS, au fost corelate semnificativ pozitiv cu răspunsurile de anticorpi PRN și FHA, producția de IFN în răspunsul la stimularea PT și răspunsurile MBC totale comutate cu IgG (Fig. 5b, c).

În conformitate cu aceasta, nu am observat modificări în abundența relativă a numărului de celule din sângele periferic (Figura suplimentară 11a), nici modificările abundenței celulare la 3 luni după vaccinarea BCG nu au fost corelate pozitiv cu obiectivele pertussis (Figura suplimentară 11b). Creșterile producției de IL-1 ca răspuns la stimularea LPS (IL1b. LPS) la 3 luni după vaccinarea BCG au arătat o asociere puternică cu răspunsuri multiple Tdap-IPV și a fost selectată pentru a determina cât de mult din variația fiecărui răspuns ar putea explica . A fost calculată varianța totală explicată (Rsq prezis) pentru fiecare rezultat, iar modificările IL-1 ar putea explica până la 60% din variația răspunsului (Fig. 5d). În general, aceste rezultate evidențiază faptul că răspunsurile antrenate ale citokinelor asociate imunității la 3 luni după vaccinarea BCG sunt corelate cu creșterea răspunsurilor de anticorpi specifici pertussis și a producției de IFN, precum și a răspunsurilor MBC totale comutate cu IgG.

DISCUŢIE

Inducerea imunității antrenate la om are loc la săptămâni până la luni după vaccinarea BCG14 și poate afecta răspunsul la imunizarea ulterioară la om16,17. Aici, arătăm că imunitatea antrenată care este indusă de vaccinarea BCG cu 3 luni înainte, dar nu concomitent cu, o doză de rapel de Tdap-IPV, mărește răspunsurile IgG pertussis și modulează răspunsurile celulare specifice pertussis. Mai multe studii au investigat efectele de interacțiune ale BCG și ale altor vaccinuri, cele mai multe dintre aceste studii raportând un efect pozitiv al BCG asupra răspunsurilor imune pentru pertussis20,21,29,30. Cu toate acestea, după cunoștințele noastre, niciun studiu până în prezent nu a investigat momentul vaccinării BCG cu privire la răspunsul la pertussis sau a studiat care caracteristici ale răspunsului imunitar antrenat indus de BCG sunt corelate cu răspunsul îmbunătățit la vaccin.

Subiecții din toate cele trei cohorte au montat răspunsuri umorale anti-pertussis și PRN plus celule B la 2 săptămâni după vaccinare cu TdapIPV. Deși răspunsurile la anticorpi PRN au fost mult mai mari în cohorta instruită cu BCG, nu am observat un model similar în răspunsurile celulelor B specifice PRN. Acest lucru ar putea fi explicat printr-o inducere mai rapidă a anticorpilor în cohorta instruită cu BCG, care se acumulează în timp datorită timpului lor lung de înjumătățire.

Cu toate acestea, deoarece concentrațiile de anticorpi nu au fost măsurate înainte de 2 săptămâni după vaccinare, nu a fost posibilă estimarea diferențelor de cinetică între cohorte. Pe lângă răspunsurile crescute ale anticorpilor PRN, am constatat, de asemenea, că răspunsurile anticorpilor FHA și PT au fost mai mari în cohorta instruită cu BCG. Din păcate, nu am putut măsura răspunsurile celulelor B specifice PT și FHA din cauza legăturii nespecifice ridicate a FHA și PT la celulele B. Cu toate acestea, este promițător că răspunsurile totale IgG MBC au fost crescute în cohorta instruită cu BCG și că aceste creșteri au fost corelate cu creșteri ale răspunsurilor anticorpilor. De asemenea, am constatat că răspunsurile IFN ca răspuns la restimularea antigenului pertussis au fost îmbunătățite în cohorta instruită cu BCG. Deși aceste modificări au fost relativ mici, am observat o tendință în care modificările W2–D0 au fost mai mari decât în ​​celelalte cohorte. Studii suplimentare cu mai mulți subiecți pot ajuta la validarea acestui model, care a fost confirmat într-un studiu la șoarece19. În mod similar, s-a demonstrat că vaccinarea BCG neonatală potențează răspunsurile Th1 la toxoidul tetanic31.

Creșterile anticorpilor pertussis, răspunsurile MBC IgG totale și răspunsurile IFNg pertussis au fost strâns corelate între ele în cohorta instruită cu BCG, sugerând activarea coordonată a funcțiilor efectoare și de memorie. În plus, creșterea anticorpilor pertussis, a răspunsurilor MBC comutate cu IgG totale și a IFN ca răspuns la restimularea PT în cohorta antrenată cu BCG au fost asociate cu răspunsuri înnăscute, în special IL-1 și IL{-6. Aceste rezultate sunt în concordanță cu un studiu uman anterior din grupul nostru în care am studiat efectul BCG asupra vaccinării împotriva gripei17. Importanța căii IL-1/IL{-6 ca biomarker al imunității antrenate a fost, de asemenea, evidențiată într-un model de infecție virală experimentală după vaccinarea împotriva febrei galbene16. În general, nu am observat corelații între anumiți stimuli microbieni și rezultatele primare, ceea ce sugerează că modificările generale ale căilor de răspuns la citokine și nu o anumită condiție de stimulare sunt legate de o reacție sporită la vaccinarea pertussis. Deși ne așteptăm ca răspunsul predominant IL-6 și IL-1 la stimularea microbiană să fie derivat din monocite și celule dendritice16, celulele B pot contribui, de asemenea, la producția de citokine32 și nu putem exclude contribuția lor potențială.
O întrebare cheie a fost cât timp persistă imunitatea antrenată indusă de BCG după vaccinare. In vitro, semnăturile imunității antrenate induse de BCG la oameni au fost identificate încă de la 2 săptămâni și până la 1-an după vaccinare14. Studiile clinice la oameni care și-au propus să traducă aceste constatări în capacitatea de răspuns in vivo au limitat fereastra de observație la până la 5 săptămâni după vaccinarea BCG15–17. Am observat o inducție mai slabă a citokinelor IL-6 și IL{-1 asociate imunității antrenate decât în ​​studiile anterioare16, așa cum a fost raportat anterior21. Variațiile de la lot la lot în producția de vaccin BCG pot influența inducerea imunității antrenate și pot explica efectul pe care l-am observat în acest studiu 33.

Mai mult, au fost observate și variații între tulpinile BCG care influențează imunogenitatea și eficacitatea clinică a acestora34-36. În ciuda acestui fapt, demonstrăm totuși că răspunsurile heterologe IL-1 și IL{-6 la 3 luni după vaccinarea BCG, adică în momentul vaccinării Tdap-IPV, dar nu la 2 săptămâni după vaccinarea BCG, sunt asociate cu pertussis intensificat. imunitatea umorală și celulară. Aceste constatări implică faptul că imunitatea antrenată continuă să se dezvolte în ultimele 2 săptămâni după vaccinarea BCG și subliniază că „răspunsul” funcțional de bază al celulelor imune înnăscute circulante poate fi critic pentru dezvoltarea unui răspuns la vaccin mai puternic.

Acest studiu demonstrează că vaccinarea anterioară cu BCG poate spori capacitatea de răspuns la antigenele vaccinului aP. În mod surprinzător, nu am observat acest efect pentru TET și DIPH. Acest lucru poate fi explicat prin faptul că toți adulții au primit în prealabil o vaccinare de rapel cu Td-IPV, dar nu și cu aP la vârsta de 9 ani, așa cum se recomandă în programul național de imunizare. În conformitate cu aceasta, am constatat că concentrațiile inițiale de anticorpi ale antigenelor aP au fost foarte corelate între subiecții din studiul nostru, dar nu au fost corelate cu DIPH și TET, ceea ce sugerează că imunitatea umorală la aceste componente nu este sincronizată cu antigenele aP (suplimentar Fig. 12). Nivelurile inițiale de anticorpi DIPH și TET au fost puternic intercorelate, ceea ce este în concordanță cu administrarea lor concomitentă în vaccinuri. Astfel, variațiile imunității preexistente împotriva diferitelor componente ale vaccinului pot juca un rol în capacitatea vaccinării BCG și a imunității antrenate de a influența răspunsul la un Tdap-IPV.

Although our study was not designed to investigate vaccine efficacy, a major question is whether the enhanced antibody response that we observed in the BCG-trained cohort may translate into better clinical protection. There is much debate about the correlates of protection against pertussis37. Nonetheless, PT antibodies have previously been used to correlate with clinical protection against disease (>25 UI/ml)29. Folosind acest prag, seroprotecția aproape completă a fost atinsă la 2 săptămâni după TdapIPV în cohortele instruite cu BCG și BCG plus Tdap, în timp ce o parte din subiecții din cohorta Tdap-IPV nu au fost seroprotejați (Figura 13 suplimentară).

Pe lângă anticorpi, imunitatea celulelor T și în special răspunsurile Th1 și Th17 au fost, de asemenea, evidențiate ca importante pentru protecția împotriva pertussis la modelele animale2,38. Am descoperit că cohorta instruită cu BCG a afișat IFN crescut ca răspuns la restimularea antigenului pertussis, care este o citire pentru imunitatea Th1 și, prin urmare, poate sugera o protecție clinică îmbunătățită împotriva pertussis. În cele din urmă, obiectivele imunologice actuale care vizează cuantificarea imunității adaptative specifice pertussis, cum ar fi celulele T, celulele B sau răspunsurile umorale, nu au fost încă validate ca corelate imunologice de protecție. Există mai multe posibilități pentru a înlătura acest decalaj de cunoștințe, de exemplu, prin efectuarea de studii epidemiologice sau prin utilizarea modelului recent stabilit de infecție umană controlată pentru B. pertussis39.

O limitare a studiului nostru explorator este că populația de studiu a fost formată din adulți care au fost pregătiți în copilărie cu vaccinul DTP cu celule întregi, despre care se știe că influențează răspunsul adaptativ la pertussis decenii după amorsare și afectează inducerea imunității celulelor T în răspuns la o vaccinare de rapel40. Astfel, va fi important să se stabilească dacă descoperirile noastre se traduc la copiii născuți în era vaccinării de rutină a AP pediatrice. În plus, deoarece am inclus doar femei, va fi important să se stabilească dacă există diferențe cu bărbații. În acest studiu explorator, am măsurat punctele finale de imunogenitate anti-pertussis, inclusiv răspunsurile anticorpilor, răspunsurile totale și PRN plus celulele B și răspunsurile celulelor T specifice antigenului. Valorile P nu au fost corectate pentru teste multiple din cauza naturii vizate a răspunsurilor imune evaluate. Important este că acest studiu a fost efectuat pe voluntari de origine vest-europeană (olandeză), iar studiile viitoare ar trebui să investigheze dacă efecte similare pot fi găsite în populații cu medii genetice diferite. O altă limitare este că doar un subset de citokine a fost măsurat. Deși acest lucru a fost adecvat pentru ipotezele specifice pe care am urmărit să le testăm, o profilare mai cuprinzătoare și imparțială a citokinelor și a altor răspunsuri poate oferi noi perspective.

În concluzie, în studiul de față, raportăm că vaccinarea BCG administrată cu 3 luni înainte de vaccinarea Tdap-IPV îmbunătățește semnificativ imunitatea anti-pertussis și că biomarkerii imunității antrenate sunt cele mai fiabile corelații ale acestor răspunsuri îmbunătățite de vaccinare. Vor fi necesare studii de validare suplimentare pentru a evalua aceste constatări în diverse populații de studiu și sunt necesare studii imunologice și genetice suplimentare pentru a valida mecanic rolul căilor IL-1 și IL{-6. În total, delimitarea funcției imune înnăscute de bază, care poate fi modulată de BCG, va fi esențială pentru înțelegerea modului de ghidare a răspunsurilor imune adaptative induse de vaccin către o imunogenitate superioară și protecție împotriva bolii.

METODE

Studiu clinic

Acest studiu deschis, randomizat, unic, a fost efectuat la Centrul Medical al Universității Radboud (Nijmegen, Țările de Jos) în perioada 2015 martie - 2 iulie01621. Protocolul de studiu este înregistrat la studiile clinice. gov (NCT02771782) și a fost aprobat de Comitetul de etică medicală Arnhem-Nijmegen. Voluntarii au fost recrutați folosind panouri de buletin și la Universitatea Radboud din Nijmegen și au primit compensații moderate. Au fost incluși voluntari care nu au fost vaccinați anterior cu BCG sau recent cu vaccinuri pertussis. Criteriile de excludere au fost (i) vaccinarea anterioară cu BCG sau vaccinarea recentă cu vaccinuri care conțin pertussis, (ii) alergie la neomicină, polimixină sau reacție alergică la vaccinarea anterioară cu vaccinuri antidifterie, tetanos, pertussis sau polio, (iii) utilizarea de vaccinuri sistemice. alte medicamente decât contraceptivele orale și (iv) sarcină sau antecedente de boli rezultate din imunodeficiență. Mărimea cohortei a fost determinată pe baza studiilor anterioare efectuate de grupul nostru în care am investigat efectele vaccinării BCG asupra răspunsurilor imune înnăscute16. Randomizarea între brațele de studiu a fost efectuată cu un algoritm bazat pe software. Toți subiecții au avut antecedente de amorsare cu pertussis cu celule întregi în primul an de viață. Au fost incluse șaptezeci și cinci de femei voluntare. După obținerea consimțământului informat scris, sângele a fost recoltat în tuburi de acid etilendiaminotetraacetic (EDTA) sau heparină de litiu (LiHep) și s-au administrat vaccinări. Hemoleucograma completă a fost obținută folosind un analizor de hematologie Sysmex XN-450. Subiecții au primit BCG Danish 1331 (Staten Serum Institut, Copenhaga, Danemarca; 0,1 ml intradermic) și Tdap-IPV (Boostrix Polio, GlaxoSmithKline; 0,5 ml intramuscular). Serurile au fost păstrate la -20 de grade până la analiză, iar sângele integral a fost procesat pentru analize ulterioare, așa cum este descris mai jos. Ghidurile Consolidated Standards of Reporting Trials (CONSORT) au fost utilizate pentru a pregăti acest manuscris (Figura suplimentară 14).

Analiza serologică

Serurile au fost analizate pentru concentrațiile de anticorpi IgG specifici PT-, FHA-, PRN-, TET- și DIPH utilizând un imunotest multiplex pe bază de bile fluorescente25. Antigenele au fost cuplate covalent la microsfere MicroPlex carboxilate activate cu coduri de culoare distincte (sferele) (Luminex, Austin, Texas, SUA). Următoarele antigene au fost utilizate pentru cuplare: PT înalt purificat (Institutul de Vaccin din Țările de Jos), FHA (Kaketsuken, Kumamoto, Japonia), P.69 PRN exprimat și purificat dintr-un construct de E. coli41, toxoid difteric (Institutul de Vaccin din Țările de Jos) și tetanos toxină (T3194, Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, SUA). După o etapă de spălare în PBS, 12,5 × 106 granule carboxilate/ml au fost activate în PBS care conține 2,5 mg de 1-etil{3-({{{20}} clorhidrat de dimetil aminopropil)-carbodiimidă (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, SUA) și 2,5 mg de N-hidroxisulfosuccinimidă (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, SUA). Antigenii pentru cuplare au fost diluați în PBS la o concentrație de 10 ug de PT, FHA sau PRN, 100 ug de DT sau 25 ug de TET per 12,5 × 106 perle activate și incubate timp de 2 ore la temperatura camerei în întuneric sub rotație constantă. După trei etape de spălare, granulele cuplate cu antigen au fost depozitate la întuneric în PBS conţinând 0,03% (greutate/vol) azidă de sodiu şi 1% (greutate/vol) albumină serică bovină la 4 grade până la utilizare. Serurile diluate 1/200 și 1/4000 în PBS conținând 0,1% (vol/vol) Tween 20 și 3% (greutate/vol) BSA au fost incubate cu perle cuplate cu antigen într-o placă de filtrare 96-godeu timp de 45 de minute la temperatura camerei la 750 pm în întuneric. Serurile de referință într-o serie de diluții, serurile de control al calității și martorii au fost incluse pe fiecare placă.

Standardul de referință intern pentru pertussis a fost calibrat față de OMS 1st IS Part 06/140 și diluat în serie de 4-ori peste 6 godeuri (1/200 până la 1/204800). Standardul de referință intern pentru DIPH și TET a fost calibrat față de DI-3 și TE-3 NIBSC WHO și diluat în serie de 4-ori peste 8 godeuri (1/50 până la 1/819200). După incubare, godeurile au fost spălate de 3 ori cu PBS, incubate cu anticorp de capră anti-IgG uman marcat cu R-ficoeritrină (Jackson Immunoresearch Laboratories, West-Grove, PA, SUA) timp de 30 de minute și spălate. Bilele au fost incluse în PBS și intensitatea mediană a fluorescenței (MFI) a fost obținută pe un Bio-Plex LX200. MFI a fost convertit în UI/mL prin interpolare dintr-o curbă standard logistică a parametrilor 5-utilizând software-ul Bioplex Manager 6.2 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, SUA) și exportat în Microsoft Excel.

Izolarea PBMC, stimularea și detectarea citokinelor

PBMC-urile au fost izolate prin centrifugare cu gradient de densitate Ficoll și resuspendate la 5 × 106 / ml în mediu de cultură RPMI (mediu Roswell Park Memorial Institute; Invitrogen, CA, SUA) suplimentat cu gentamicină, Glutamax (GIBCO) și piruvat. În total, 100 ul au fost alicote per godeu în plăci 96-godeuri cu fund rotund (Corning) și stimulate cu unul dintre RPMI (martor negativ), lipopolizaharidă Escherichia coli (LPS; 10 ng/ml, Sigma-Aldrich), Mycobacterium tuberculosis H37Rv sonicat (5 ug/ml), Staphylococcus aureus ucis termic (1 × 106 /ml, izolat clinic), Candida albicans ucis termic (1 × 106 /ml, tulpină UC820) și Bordetella pertussis ucis termic ( 1 ug/ml, tulpină B1917), PT (2 ug/ml), PRN (4 ug/ml, ReagentProteins, PFE-031) și FHA (2 ug/ml). PT și FHA au fost oferite cu amabilitate de AM Buisman la Institutul Național de Sănătate Publică și Mediu (RIVM, Bilthoven, Țările de Jos). Celulele au fost incubate la 37 de grade și 5% CO2 timp de 24 de ore pentru detectarea IL-1, IL{-6, IL{-10 și TNF sau 7 zile pentru IFN, IL{{31} } și IL-17. Supernatanții au fost depozitați la -20 de grade. Citokinele au fost măsurate în supernatante de cultură PBMC utilizând kituri de test imunosorbent legat de enzime (ELISA) de la sistemele de cercetare și dezvoltare (IL-1, TNF, IL17, IL-22) sau Sanquin (IL-6, IL -10, IFN ) conform instrucțiunilor producătorului.

Citometrie în flux cu celule B

Colorarea celulelor B a fost efectuată direct pe sânge integral cu un panou de colorare a anticorpilor (Tabelul suplimentar 3) care include PRN marcat fluorescent pentru detectarea celulelor B specifice antigenului. Pentru a marca celulele B specifice PRN, PRN (ReagentProteins, PFE-031) a fost conjugat cu fluoresceină (kit de marcare a anticorpilor FITC, Pierce) conform protocolului producătorului (PRN-FITC). În total, 1–2 ml de sânge integral proaspăt extras colectat în tuburi LiHep au fost diluați în tampon FACS (PBS plus 0.{{10}}9% NaN3 plus 0,2% albumină serică bovină, Calbiochem) și celulele au fost peletizate și apoi spălate de două ori cu tampon FACS. Celulele au fost resuspendate în tampon FACS și apoi colorate cu cocktail de anticorpi pentru fenotiparea celulelor B timp de 15 minute, fixate (FACSLysing, BD Biosciences) și după o altă spălare cu tampon FACS au fost analizate în decurs de 1 oră de la colorare. Citometria în flux a celulelor B specifice antigenului PRN din sângele integral a fost efectuată pe un citometru în flux LSRII (BD Biosciences) cu setări standardizate de instrument42. Datele de citometrie în flux au fost analizate cu Infinicyte (Versiunea 2.0, Cytognos). Per probă, 2 × 106 celule au fost achiziționate în poarta limfocitelor (Fig. 1a suplimentară). Limfocitele au fost închise după îndepărtarea dubletelor și a resturilor. Celulele B au fost identificate ca CD45 plus CD19 plus și au fost identificate celule B specifice PRN-FITC. Subseturile de celule B au fost identificate folosind o strategie de pornire adaptată43. Am încercat să detectăm celulele B specifice PT prin citometrie în flux, dar nu am reușit din cauza fondului ridicat cauzat de colorarea nespecifică.

Statistici

Valorile citokinelor și anticorpilor au fost transformate log10-pentru a ține cont de distribuția lor neregulată. Analiza răspunsurilor la rezultatul primar sau secundar a fost analizată într-un model de regresie cu efecte mixte folosind pachetul „lme4” 44 R. Pentru fiecare rezultat, formula modelului (în notația R) este:

Comparațiile au fost calculate cu pachetul „means” 45 R și am examinat două contraste. În primul rând, am examinat dacă obiectivele primare au fost semnificativ diferite în comparație cu valoarea inițială a vaccinării Tdap-IPV în cadrul fiecărei cohorte (efectele post-vaccinare au fost definite ca W2-D0 în cadrul fiecărei cohorte, Tabelul suplimentar 1). Apoi, am examinat diferențele dintre cohorte în amploarea acelor modificări (efecte diferențiale, Tabelul suplimentar 2, definit ca (W2c1 – D{{10}}c1) – ​​(W2c2 – D0 c2) unde c1 și c2 se referă la cohorte diferite pentru o comparație dată). Modificările citokinelor imunitate heterologe sau antrenate în cohorta instruită cu BCG au fost analizate în mod similar. Valorile P sunt raportate folosind metoda gradelor de libertate Kenward-Roger. Parametrii statistici sunt raportați direct în figuri și legendele figurilor. Datorită designului studiului explorator și a răspunsurilor imune vizate evaluate, nu a fost efectuată nicio corecție de testare multiplă. S-au efectuat corelații în perechi cu valorile modificării log10-fold față de linia de bază. Estimarea varianței explicată prin măsurătorile citokinelor pe variabilele de rezultat primar a fost efectuată utilizând pachetul R „caret” 46. Pentru a ține seama de potențiala supraajustare, de 10 ori repetate, a fost efectuată validarea încrucișată de 4-ori. Am analizat titrurile de anticorpi seroprotectori împotriva PT, TET sau DIPH cu un test exact Fisher. Asociațiile dintre starea de seroprotecție și cohortă au fost determinate prin examinarea reziduurilor unui test chi-pătrat. Valorile de prag pentru seroprotecția la PT au fost 25 UI/ml18 și 0,1 UI/ml pentru DIPH și TET37).

Rezumat raportare

Mai multe informații despre proiectarea cercetării sunt disponibile în Rezumatul de raportare a cercetării în natură, legat de acest articol.

DISPONIBILITATEA DATELOR

Datele care susțin concluziile acestui studiu sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere rezonabilă.

DISPONIBILITATEA CODULUI

Codul R care susține concluziile acestui studiu este disponibil de la autorul corespunzător, la cerere rezonabilă.

REFERINȚE

1. Tan, T. şi colab. Pertussis pe tot globul: tendințe epidemiologice recente din 2000 până în 2013. Pediatr. Infecta. Dis. J. 34, e222–e232 (2015).

2. Warfel, JM, Zimmerman, LI & Merkel, TJ Vaccinurile pertussis acelulare protejează împotriva bolilor, dar nu reușesc să prevină infecția și transmiterea într-un model de primate non-umane. Proc. Natl Acad. Sci. SUA 111, 787–792 (2014).

3. Huang, LM și colab. Răspunsurile la doza primară și la o doză de rapel de vaccinuri acelulare, componente și de celule întregi împotriva pertussis au fost inițiate la vârsta de 2 luni. Vaccine 14, 916–922 (1996).

4. Klein, NP, Bartlett, J., Rowhani-Rahbar, A., Fireman, B. și Baxter, R. Protecție în scădere după a cincea doză de vaccin pertussis acelular la copii. Noua Engl. J. Med. 367, 1012–1019 (2012).

5. Misegades, LK et al. Asociația pertussis copilăriei cu primirea a 5 doze de vaccin pertussis în funcție de timp de la ultima doză de vaccin, California, 2010. JAMA 308, 2126–2132 (2012).

6. Hendrikx, LH, Berbers, GA, Veenhoven, RH, Sanders, EA & Buisman, răspunsurile IgG AM după vaccinarea de rapel cu diferite vaccinuri pertussis la copiii olandezi de 4 ani: efectul conținutului de antigen al vaccinului. Vaccin 27, 6530–6536 (2009).

7. Misiak, A. et al. Adăugarea unui agonist TLR7 la un vaccin antipertussis acelular îmbunătățește răspunsurile Th1 și Th17 și imunitatea protectoare într-un model de șoarece. Vaccin 35, 5256–5263 (2017).

8. Dunne, A. şi colab. Un nou agonist TLR2 de la Bordetella pertussis este un adjuvant puternic care promovează imunitatea protectoare cu un vaccin antipertussis acelular. Imunol mucoase. 8, 607–617 (2015).

9. Sugai, T. şi colab. O oligodeoxinucleotidă care conține CpG ca adjuvant eficient care contrabalansează răspunsul imun Th1/Th2 în vaccinul difterie-tetanos-pertussis. Vaccine 23, 5450–5456 (2005).

10. Colditz, GA și colab. Eficacitatea vaccinului BCG în prevenirea tuberculozei. Meta-analiză a literaturii publicate. JAMA 271, 698–702 (1994).

11. Kristensen, I., Aaby, P. & Jensen, H. Vaccinări de rutină și supraviețuire a copiilor: un studiu de urmărire în Guineea-Bissau, Africa de Vest. BMJ 321, 1435–1438 (2000).

12. Hirve, S. et al. Efectele nespecifice și diferențiate de sex ale vaccinărilor asupra supraviețuirii copiilor în zona rurală de vest a Indiei. Vaccin 30, 7300–7308 (2012).

13. Aaby, P. şi colab. Studiu randomizat de vaccinare BCG la naștere la copii cu greutate mică la naștere: efecte nespecifice benefice în perioada neonatală? J. Infectează. Dis. 204, 245–252 (2011).

14. Netea, MG et al. Imunitate antrenată: un program de memorie imună înnăscută în sănătate și boală. Science 352, aaf1098 (2016).

15. Walk, J. et al. Rezultatele infecției umane controlate cu malarie după vaccinarea BCG. Nat. comun. 10, 874 (2019).

16. Arts, RJW et al. Vaccinarea BCG protejează împotriva infecției virale experimentale la oameni prin inducerea citokinelor asociate cu imunitatea granulată. Cell Host Microbe 23, 89–100 e105 (2018).

17. Leentjens, J. et al. Vaccinarea BCG îmbunătățește imunogenitatea vaccinării gripale ulterioare la voluntari sănătoși: un studiu pilot randomizat, controlat cu placebo. J. Infectează. Dis. 212, 1930–1938 (2015).

18. Zimmermann, P. & Curtis, N. Influența BCG asupra răspunsurilor la vaccin - o revizuire sistematică. Expert Rev. Vaccines 17, 547–554 (2018).

19. Broset, E. şi colab. Vaccinarea BCG îmbunătățește răspunsurile imune DTaP la șoareci și este asociată cu o incidență mai scăzută a pertussis în studiile epidemiologice ecologice. EBioMedicine 65, 103254 (2021).

20. Aaby, P., Andersen, A., Ravn, H. & Zaman, K. Administrarea concomitentă a vaccinurilor BCG și difterie-tetanos-pertussis (DTP) poate reduce mortalitatea infantilă mai mult decât programul OMS de BCG mai întâi și apoi DTP. O re-analiză a datelor de supraveghere demografică din Bangladeshul rural. EBioMedicine 22, 173–180 (2017).

21. Blok, BA şi colab. Efectele imunologice interacționate, nespecifice ale vaccinărilor antipoliomielite inactivate cu bacilul calmette-guerin și tetanos-difterie-pertussis: un studiu explorator, randomizat. Clin. Infecta. Dis. 70, 455–463 (2020).

22. Aaby, P., Ravn, H., Fisker, AB, Rodrigues, A. & Benn, CS Este difteria-tetanos-pertussis (DTP) asociată cu o mortalitate crescută a femeilor? O meta-analiză care testează ipotezele efectelor nespecifice diferențiale de sex ale vaccinului DTP. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 110, 570–581 (2016).

23. van der Lee, S. et al. Creșterea ratei de achiziție a Bordetella pertussis la adolescenți în timpul epidemiei din 2012 din Țările de Jos și dovezi pentru persistența prelungită a anticorpilor după infecție. Supravegherea euro. https://doi.org/10.2807/1560-7917. ES.2017.22.47.17-00011 (2017).

24. Berbers, G. et al. Circulația pertussis și protecția slabă împotriva difteriei în rândul adulților de vârstă mijlocie din 18 țări europene. Nat. comun. 12, 2871 (2021). 25. van Gageldonk, PG, van Schaijk, FG, van der Klis, FR & Berbers, GA Dezvoltarea și validarea unui imunotest multiplex pentru determinarea simultană a anticorpilor serici împotriva Bordetella pertussis, difterie și tetanos. J. Immunol. Metode 335, 79–89 (2008).

26. Schure, RM et al. Răspunsurile celulelor T înainte și după cea de-a cincea vaccinare acelulară consecutivă împotriva pertussis la copiii olandezi de 4-ani. Clin. Imunol vaccin. 19, 1879–1886 (2012).

27. Mathurin, KS, Martens, GW, Kornfeld, H. & Welsh, RM Imunitate heterologă mediată de celule T CD4 între micobacterii și poxvirusuri. J. Virol. 83, 3528–3539 (2009).

28. Lertmemongkolchai, G., Cai, G., Hunter, CA și Bancroft, GJ Activarea prin observator a celulelor CD8 plus T contribuie la producerea rapidă de IFN-gamma ca răspuns la agenții patogeni bacterieni. J. Immunol. 166, 1097–1105 (2001).

29. Zimmermann, P. et al. Influența imunizării neonatale cu Bacil Calmette-Guerin (BCG) asupra răspunsurilor vaccinale heterologe la sugari. Vaccin 37, 3735–3744 (2019).

30. Ritz, N., Mui, M., Balloch, A. & Curtis, N. Efectul nespecific al vaccinului Bacille CalmetteGuerin asupra răspunsului imun la imunizările de rutină. Vaccin 31, 3098–3103 (2013).

31. Libraty, DH et al. Vaccinarea BCG neonatală este asociată cu răspunsul imun T-helper 1 îmbunătățit la vaccinurile heterologe pentru sugari. Teste Vaccinol. 3, 1–5 (2014). 32. du Plessis, WJ et al. Răspunsul funcțional al celulelor B la stimularea antigenică: un raport preliminar al tuberculozei latente. PLoS ONE 11, e0152710 (2016).

33. Biering-Sorensen, S. et al. Variația creșterii în producția de vaccin BCG și asocierea cu răspunsul imun. Un studiu observațional în cadrul unui studiu randomizat. Vaccin 33, 2056–2065 (2015).

34. Ru, H. şi colab. Impactul Genome Region of Difference 4 (RD4) asupra virulenței micobacteriene și a eficacității BCG. Față. Celulă. Infecta. Microbiol. 7, 239 (2017). 35. Cho, T. şi colab. O revizuire a vaccinului BCG și a altor abordări pentru eradicarea tuberculozei. Zumzet. Vaccin. Imunalt. 17, 2454–2470 (2021).

36. Brosch, R. şi colab. Plasticitatea genomului BCG și impactul asupra eficacității vaccinului. Proc. Natl Acad. Sci. SUA 104, 5596–5601 (2007).

37. Plotkin, SA Corelate de protecție indusă de vaccinare. Clin. Vaccin. Imunol. 17, 1055–1065 (2010).

38. Ross, PJ și colab. Contribuția relativă a celulelor Th1 și Th17 în imunitatea adaptivă la Bordetella pertussis: spre proiectarea rațională a unui vaccin acelular îmbunătățit împotriva pertussis. PLoS Pathog. 9, e1003264 (2013).

39. de Graaf, H. et al. Investigarea colonizării și imunității Bordetella pertussis: protocol pentru un model de infecție umană controlată de pacienți internați. BMJ Open 7, e018594 (2017).

40. da Silva Antunes, R. et al. Polarizarea Th1/Th17 persistă după vaccinarea cu celule întregi împotriva pertussis, în ciuda rapelurilor acelulare repetate. J. Clin. Investig. 128, 3853–3865 (2018).

41. Hijnen, M., van Gageldonk, PG, Berbers, GA, van Woerkom, T. & Mooi, FR Factorul de virulență Bordetella pertussis P.69 pertactina își păstrează proprietățile imunologice după supraproducție în Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 41, 106–112 (2005).

42. Kalina, T. et al. Standardizarea EuroFlow a setărilor instrumentelor citometrului de flux și a protocoalelor de imunofenotipizare. Leucemie 26, 1986–2010 (2012).

43. Blanco, E. şi colab. Distribuția asociată vârstei a subgrupurilor normale de celule B și celule plasmatice în sângele periferic. J. Alergie Clin. Imunol. 141, 2208–2219. e2216 (2018).

44. Bates, D., Machler, M., Bolker, BM & Walker, SC Montarea modelelor liniare cu efecte mixte folosind lme4. J. Stat. Softw. 67, 1–48 (2015).

45. Lenth, R. Emmeans: mediu marginal estimat, alias cele mai mici pătrate, medie (2018).

46. ​​Kuhn, M. Construirea modelelor predictive în R folosind pachetul caret. J. Stat. Softw. 28, 1–26 (2008).

MULȚUMIRI

Dorim să mulțumim Anne-Marie Buisman (RIVM) pentru furnizarea de antigene PT și FHA care au fost utilizate pentru experimentele de restimulare PBMC. Mulțumim tuturor voluntarilor care au participat la proces. Această lucrare a fost susținută de Institutul Național de Sănătate Publică și Mediu (RIVM), Țările de Jos (proiectul SPR S112200). MGN a fost susținut de un Grant ERC Advanced (#833247) și un grant Spinoza de la Organizația Olandeză pentru Cercetare Științifică.

CONTRIBUȚII AUTORULUI

Conceptualizare: BAB, MGN, RvC și DAD; metodologie: ES, MJE, GAMB, PGMvG, BAB și LCJdB; investigație: ES, MJE, GAMB, PGMvG, BAB, LCJdB și JG; analiza formală: JG; scriere-schimba originală: JG și DAD; scriere recenzie și editare: toate.

INTERESE CONCURENTE

MGN are un brevet în Nanobiologics pentru a inhiba imunitatea instruită licențiat la TTxD și un brevet în nanobiologie pentru a stimula imunitatea antrenat licențiat la TTxD. Toți ceilalți autori raportează niciun conflict potențial. Toți autorii au trimis Formularul ICMJE pentru dezvăluirea potențialelor conflicte de interese.

INFORMAȚII SUPLIMENTARE

Informații suplimentare Versiunea online conține materiale suplimentare disponibile la https://doi.org/10.1038/s41541-022-00438-4.

Corespondența și cererile de materiale trebuie adresate lui Dimitri A. Diavatopoulos.

Retipăririle și informațiile privind permisiunile sunt disponibile la http://www.nature.com/reprints

Nota editorului Springer Nature rămâne neutră cu privire la revendicările jurisdicționale din hărțile publicate și afilierile instituționale.

Acces deschis

Acest articol este licențiat în baza unei licențe internaționale Creative Commons Atribution 4.0, care permite utilizarea, partajarea, adaptarea, distribuirea și reproducerea în orice mediu sau format, atâta timp cât acordați un credit corespunzător autorilor originali. ) și sursa, furnizați un link către licența Creative Commons și indicați dacă s-au făcut modificări. Imaginile sau alte materiale ale terților din acest articol sunt incluse în licența Creative Commons a articolului, cu excepția cazului în care se indică altfel într-o linie de credit a materialului. Dacă materialul nu este inclus în licența Creative Commons a articolului și utilizarea dorită nu este permisă de reglementările legale sau depășește utilizarea permisă, va trebui să obțineți permisiunea direct de la deținătorul drepturilor de autor.

For more information:1950477648nn@gmail.com