Dihidroflavone benzilate și alcaloizi derivați de izochinolină din scoarța de Diclinanona Calycina (Annonaceae) și citotoxicitatea acestora

Pentru mai multe informații contacteazătina.xiang@wecistanche.com

Abstract: Diclinanona calycina RE Cartofi prăjiți cunoscut sub numele de „enviro”, este o specie din familia Annonaceae endemică în Brazilia. În căutarea noastră continuă pentru compuși bioactivi din plantele Annonaceae Amazon, scoarța de D.calycina a fost investigată prin tehnici de cromatografie clasică care au dat treisprezece compuși (alcaloizi și flavonoizi) descriși pentru prima dată în D. calycina, precum și în genul Diclinanona. Structura acestor compuși izolați a fost stabilită prin analiză extinsă folosind spectroscopie 1D/2D-RMN în combinație cu MS. Alcaloizii izolați au fost identificați ca aparținând subclaselor: izochinolină simplă, thali online (1); aporfină, anonaină (2); oxoaporfină, liriodenină (3); benziltetrahidroizochinoline, (S)-(plus)-reticulină(4); dehidro-oxonorreticulină (3,4-dihidro-7-hidroxi-6-metoxi{-1-izochinolinil)({3-hidroxi{-4-metoxifenil)-metanonă)(5 );( plus )-1Ng-oxid de S,2R-reticulină (6); şi (plus)-1S,2S-reticulină N-oxid (7); tetrahidro protoberberină, coreximină (8); și pavine, bisnorargemonină (9). In timp ceflavonoideaparțin celor benzilatedihidroflavone, izouvarinol (10), dichamanetină (11) și un amestec de uvarinol (12) și izouvarinol (13). Compusul 5 este descris pentru prima dată în literatură ca un produs natural. Activitatea citotoxică a principalilor compuși izolați a fost evaluată împotriva liniilor celulare canceroase și necanceroase. Dintre compușii testați, cele mai promițătoare rezultate au fost găsite pentru dihidroflavonele benzilate dichamanetin (10) și amestecul de uvarinol (12) și izouvarinol (13), care au prezentat activitate citotoxică moderată împotriva substanțelor testate.celula canceroasălinii(<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-I). Dichamanetina (11) a arătat activitate citotoxică împotriva HL-60 și HCT116 cu valori IC50 de 15,78 ug·mL-I (33,70 umol·LI) și 18,99 ug·mL-（40,56 umol. L-）, respectiv, în timp ce amestecul de uvarinol（12） și izouvarinol (13) a demonstrat activitate citotoxică împotriva HL-60, cu o valoare IC5 de 9,74 ugs.mL{-1, și HCT116, cu un IC50 valoare de 17,31 ug. mL-I. Aceste activități citotoxice pot fi atribuite prezenței uneia sau mai multor grupări hidroxi benzii prezente în aceste molecule, precum și poziției în care aceste grupări sunt legate. Activitățile citotoxice ale reticulinei, anonainei și liriodeninei au fost stabilite anterior, liriodenina fiind compusul cel mai puternic.

Cuvinte cheie: Diclinanona calycina; alcaloizi și dihidroflavone benzilate; activitate citotoxică

Faceți clic pentru a afla mai multe despre produse

1. Introducere

Annonaceae este o familie mare de arbori și arbuști tropicali și subtropicali, cuprinzând aproximativ 112 genuri și 2440 de specii [1]. Mai multe specii sunt cunoscute pentru fructele lor comestibile și proprietățile medicinale ]2]. Investigația fitochimică anterioară cu unele specii de Annonaceae a condus la izolarea și caracterizarea diferitelor clase de metaboliți secundari, precum monoterpene, diterpene, triterpene, lignani,flavonoide, fenilpropanoizi derivați de asaronă, acetogenine și, în principal, alcaloizi tipici derivați de izochinolină [3-7]. Unii dintre acești metaboliți secundari izolați din speciile Annonaceae au prezentat activități biologice importante, cum ar fi proprietăți antiinflamatorii și de inhibare a ureazei [8,9], tripanocid [10,11], leishmanicid [11,12], antimalaric [4,13] , acțiuni antimicrobiene [4,14,15], antioxidante și antireumatice [9,15] și, în special, activitate citotoxică împotriva diferitelor linii de celule tumorale umane [4,6,11,16-21].

Deși familia Annonaceae este considerată o familie primitivă și bine studiată, puține studii fitochimice și/sau farmacologice au fost efectuate cu speciile sale[3]. Studiile fitochimice și/sau farmacologice s-au concentrat în principal asupra speciilor din genurile Annona, Asimina și Cananga, datorită importanței lor economice mari, și asupra unor specii din genurile Duguetia, Guatteria și Xylopia[5]. În ciuda creșterii mari din ultimii 20 de ani în raport cu studiile fitochimice și farmacologice, numărul speciilor investigate este încă foarte mic în raport cu un număr mare de specii recunoscute. În prezent, conform bazelor de date științifice Web of Science, Scopus și SciFinder, doar aproximativ 15% dintre speciile Annonaceae descrise au vreun studiu fitochimic și/sau farmacologic corespunzător.

Printre speciile puțin studiate se numără cele aparținând genului Diclinanona Diels. Acest gen aparține tribului Annoneae, din subfamilia Annonoideae, și apare doar în America de Sud tropicală (în principal în regiunea Amazonului). Este un gen format din doar trei specii, Diclinanona calycina(Diels)RE Fries Diclinanona matogrossensis Maas și Diclinanona tessmannii Diels, care apar ca arbori [22-24].D.calycina (sinonimia Xulopia calycina Diels) este un 8 la Arbore înalt de 30 m, cunoscut în mod popular ca „envireira” și „enviro”, distribuit în bazinul Amazonului din Brazilia, Peru și Venezuela [23]. D.calycina se aseamănă superficial cu Xylopia pentru florile sale cu petale alungite și înguste, dar este diferită pentru monocarpii lemnos, indehiscenți, globosi și cu pereți groși [23,24].

Studiile anterioare cu D. calycina raportează doar studii farmacologice. Primul studiu descrie investigarea activității antimicrobiene a extractelor metanolice, cloroformice și apoase împotriva microorganismelor Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus și Candida albicans folosind metoda [gel-diffusion]. Cel de-al doilea raportează investigarea activității antimicrobiene a extractelor organice (diclormetan: metanol 1:1) și apoase împotriva microorganismului Enterococcus faecalis folosind testul de microdiluție în bulion (MDBA) și testul de difuzie pe disc (DDA)[26]. Astfel, în căutarea noastră continuă de noi produse naturale bioactive din Annonaceae din pădurea tropicală amazoniană, acest studiu și-a propus să investigheze proprietățile fitochimice și farmacologice ale scoarței de D.calycina. În acest raport, treisprezece compuși (nouă alcaloizi și patru benzilațidihidroflavone) au fost izolate și identificate pentru prima dată în D.calycina, precum și în genul Diclinanona. În plus, citotoxicitatea compușilor principali a fost investigată împotriva B16-F10, HepG2, K562 și HL{{ 4}} linii de celule tumorale folosind testul Alamar albastru.

2. Rezultate și discuții

2.1. Elucidarea structurală a compuşilor

După ce s-a descoperit prezența compușilor care conțin azot în extractul metanolic folosind reactivul Dragendorff, acesta a fost supus unui tratament acido-bazic conform metodologiei lui Costa și colab. [12] rezultând fracții alcaloidale și neutre. O concentrație mare de compuși care conțin azot a fost observată în fracția alcaloidală care a fost supusă analizei cromatografice. Separările cromatografice succesive, așa cum sunt descrise în secțiunea Extracție și izolare, au condus la izolarea și identificarea a treisprezece constituenți chimici (1-13, Figura 1), nouă alcaloizi derivați din izochinolină 1-9 și patru dihidroflavone benzilate 10-13. Structurile acestor compuși izolați (Figura 1) au fost stabilite prin analiză extinsă folosind spectroscopie RMN 1D și 2D în combinație cu MS (Date suplimentare), precum și prin comparație cu datele din literatură.

Compusul 5 a fost obţinut ca o pulbere amorfă maro şi a fost testat pozitiv pentru reactivul lui Dragendorff. A arătat o moleculă protonată la m/z328 [M plus H]' în LR-ESI( plus )MS-compatibilă cu formula moleculară C18H1NO5. Spectrele „H și 13C-RMN ale lui 5 (Tabelul 1) au fost în concordanță cu cele ale reticulinei (4)[27, cu excepția absenței grupării metil legate de azot (CH3-N) și a semnalului de gruparea metină în poziţia 1, care a fost înlocuită cu un semnal la 5c 165,1 în spectrul tipic 13C-RMN al grupării imină conjugată la o grupare carbonil la bc 192,8. În „spectrul H-RMN, trei hidrogeni în câmp inferior la δH 6,88（1H,d, J=8,4 Hz, H{-5'）,5H7,57（1H,d, J{{33} }.0Hz, H{-2'）și δH 7,6{0（1H, dd, J=8,4 și 2,0 Hz, H{-6'） , a dezvăluit prezența unui sistem de cuplare ABX. Două semnale singlet la 6H 6,90(1H,s, H-8) și 6,71(1H, s, H{-5) au indicat prezența inelului fenil 1,2,4,{5-tetrasubstituit. În plus, spectrul H-RMN de 5 a arătat, de asemenea, semnale pentru două grupări metoxi care rezonează la bH 3,93 (3H, s) și 6H 3,95 (3H,s) și semnale pentru două grupări metilen care rezonează la δμ 2,79 (2H,t, J=7,8 Hz） și 6H 3,89(2H,t,/=7,8 Hz), atribuite lui H{-4 și, respectiv, H-3 (Tabelul 1) . Aceste date au indicat că alcaloidul 5 are un schelet de benziltetrahidroizochinolină [28-30].

Aceste grupuri au fost stabilite pe baza hărții de corelație H-13C cu două și trei legături din experimentul HMBC-RMN (Figura 2 și Tabelul 1). Această analiză a arătat că hidrogenul la δH 3,89 （H-3）a arătat o corelație cu trei benzi „H-13C cu carbonii la 6c130.1（4a） și δc165.{ {42}}（C-1）și corelația cu două legături lH-13C cu carbonul atδc 25,4(C{-4), confirmând prezența grupării imine în moleculă. Pe de altă parte, semnalele la δH 7,57 （H-2'） și δH 7,60（H{-6'）au arătat o corelație cu trei legături lH{-13C cu carbonii la δc 124,3（ C-6'）,5c 151,4（C{-4'） și δc192,8（C-7） și 5c116,0（C{-2'）,6c 151,4 (C-4') și, respectiv, c 192,8(C{-7'), stabilindu-se gruparea carbonil din moleculă (Figura 2 și Tabelul 1). Prin urmare, pe baza acestor date RMN, compusul 5

a fost stabilit ca alcaloid benziltetrahidroizochinolin 34-dihidro-7-hidroxi-6-metoxi-1-izochinolinil)({3-hidroxi{-4-metoxifenil)-metanonă, care a fost numită dehidro-oxonorreticulină. Acest alcaloid este descris pentru prima dată în literatură ca un produs natural. Prima și singura sa înregistrare a fost descrisă de Dörnyei și colab. în 1982 【31】ca produs de origine sintetică. Numai datele 'H-RMN sunt descrise cu unele multiplicităţi nedeterminate. Astfel, atribuirile complete pentru toate deplasările chimice 1H- și 13C-RMN au fost stabilite prin experimente de corelare cu o legătură (HSOC) și cu două și trei legături (HMBC)' H-13C-RMN și au fost descrise în Tabelul 1.

Compușii 6 și 7 au fost identificați ca alcaloizi benziltetrahidroizochinolin (plus)-1S,2R-reticulină-N-oxid și (plus)-1S,2S-reticulină-N-oxid, respectiv. Datele H-RMN ale acestor alcaloizi au fost comparate cu datele descrise de Lee et al. [28]folosind același solvent deuterat (CD3OD) și au fost observate unele inconsecvențe (Tabelul 1), în principal în relație cu H-1, H-8 și H, C-NO. Nu există date 13C-RMN descrise pentru acești alcaloizi în literatură. Pe baza datelor limitate 1H- și 13C-RMN, precum și a ambiguităților observate pentru aceste molecule, au fost efectuate experimente RMN 1D și 2D H și 13C pentru a determina atribuirile și multiplicitățile lor corecte.

Poziția corectă a hidrogenului H{{{0}} și H{-1 a ambilor izomeri 6 și 7 a fost stabilită pe baza hărții de corelație cu trei legături „H{-13C din HMBC -Experiment RMN （Figura 2）. Pentru izomerul 6, analiza a arătat că hidrogenul la δH 5,78（H-8）a arătat o corelație cu trei legături „H-13C cu carbonii la 6c 79,8（C-1）,δc120 .6（4a） și δc 149,4 （C-6）, în timp ce hidrogenul la δH 4,13 （H-1）a arătat o corelație cu trei legături „H-13C cu carbonii la c 60,7（C-3）,6c 115,7 （C-8）,δc 120,6（C-4a） și 131,2 （C{-1'）, stabilindu-se astfel pozițiile corecte ale hidrogenilor H-8 și H{-1 pentru izomerul 6. Această atribuire poate fi confirmată în continuare prin analiza hidrogenului la δH 6,76（H-5）care a prezentat trei legături Corelația H-13C cu atomii de carbon at δc 27,0（C{-4）, δc 127,1（C{-8a） și δc 145,7 （C{-7）（Figura 2）. Pentru izomer7, analiza a arătat că hidrogenul la δH 6,30 （H-8）a arătat o corelație cu trei legături „H{-13C cu atomii de carbon la δc 79,4（C-1）,δc 122,8（ 4a) și δc 148,9 (C-6), în timp ce hidrogenul la δH 4,46 (H-1) a arătat corelații cu trei legături H{-13C cu carbonii la δc 62,9 （C{ {82}}）,5c 115,5（C{-8）, bc 122,8（C{-4a） și 131,4（C{-1'）, stabilindu-se astfel pozițiile corecte ale hidrogenului H -8 și H{-1 pentru izomerul 7. Această atribuire a fost confirmată și de analiza hidrogenului la δH 6,71 （H{-5）care a prezentat trei legături lH-13C corelații cu carbonii la δc26,3（C{-4), δc 126,9（C{-8a） și 6c 146,1（C{-7） (Figura 2). Experimentul NOESY a fost de asemenea efectuat pentru a stabili stereochimia corectă a izomerilor6 și 7. În acest experiment, corelația puternică NOE a H-1（δH 4,13) și H, CN(5 3.15) a indicat -orientarea oxigenului din izomerul 6. Pe de altă parte, în experimentul 2D-NOESY pentru 7, nu a putut fi găsită nicio corelație evidentă NOE între H-1(6H 4,46) și HAC-N(5H 3,20), indicând orientarea oxigenului în izomerul 7 (Figura 2). Aceste mici diferențe în deplasările chimice ale acestor izomeri sunt observate în mod clar datorită stereochimiei azotului afectat de pozițiile și ale oxigenului. Comparațiile dintre datele RMN H și 13C obținute pentru compușii 6 și 7 cu datele moleculelor cu structuri apropiate, cum ar fi hexapetalina A și hexapetalina B [30] susțin datele descrise în tabelul 1 fără ambiguitate.

Compușii 1-4 și 8-13 au fost identificați ca talifolină (1) [32], anonaină (2) [33]liriodenină (3)[10,34], (S)-( plus )-reticulină ( 4)[27], coreximină (8) [34,35], bisnorargemonină (9)[36], izochamanetină (10) [37], dichamanetină (11) [37] și un amestec de uvarinol (12) și izouvarinol (13) [37] pe baza profilurilor lor spectroscopice și a comparației cu valorile din literatură. Spectrele lH- și 13C 1D și 2D-RMN, precum și spectrele de masă ale tuturor compușilor izolați, sunt disponibile ca materiale suplimentare.

Din punct de vedere chimiofenetic (un termen nou pentru chimiosistematica plantelor/chemotaxonomie a plantelor), este important de remarcat faptul că prezența flavanonelor C-benzilate și a dihidrochalconelor C-benzilate sunt un tip special de flavonoide derivate din binecunoscuta flavanonă pinocembrină. și au fost descrise în special la speciile din genul Uoaria aparținând familiei Annonaceae [3,38-42]. Prezența acestor compuși în D. calycina sugerează relații chemofenetice strânse cu Uoaria. Pe de altă parte, ar trebui efectuate investigații suplimentare cu alte părți ale plantei, precum și cu alte specii de Diclinanona pentru a confirma această relație chimiofenetică. Flavanone și calconele sunt răspândite în plantele superioare, dar adăugarea de grupări benzii este destul de rară și pare să fie limitată în Annonaceae la genul Uoaria [3,39-42]și acum la genul Diclinanona. Grupările benzil apar probabil dintr-o cale C6-C1, dar funcționalitatea o-hidroxi este neobișnuită. Absența substituenților în inelul B în toate aceste flavonoide din Uoaria și Diclinanona poate fi legată de observația anterioară referitoare la flavonoidele Popowia cauliflora [38].

Alcaloizii derivați de izochinolină izolați și descriși în această lucrare au fost deja înregistrați la mai multe specii de Annonaceae din diferite genuri. Unii dintre aceștia, cum ar fi liriodenina și anonaina, sunt considerați markeri chemofenetici, iar prezența acestor alcaloizi în D.calycina întărește și mai mult relația acestor markeri chemofenetici din familia Annonaceae [5-7,15,20,27, 33-35,43].

Merită menționat faptul că, conform lui Zidorn [44], studiile chimiofenetice sunt definite ca studii menite să descrie gama de metaboliți secundari specializați dintr-un taxon dat, așa cum sa observat deja în mai multe lucrări publicate [5-7,15,20. ,27,33-35,43-46]. Astfel, studiile chimiofenetice contribuie la descrierea fenetică a taxonilor, similar abordărilor anatomice, morfologice și cariologice, care au fost deja recunoscute ca de mare importanță pentru stabilirea sistemelor „naturale” și care continuă să fie de o importanță extremă pentru descrierea organismelor clasificate cu ajutorul metodelor moleculare moderne [44].

2.2. Testul citotoxic

Activitatea citotoxică in vitro a compuşilor izolaţi (Tabelul 2), cu excepţia compuşilor 2, 3,5 şi 8 (datorită randamentului lor scăzut), a fost evaluată faţă decelula canceroasăliniile HL-60 (leucemie promielocitară umană), MCF-7(adenocarcinom mamar uman), HepG2 (carcinom hepatocelular uman), HCT116 (carcinom de colon uman) și linia celulară necanceroasă MRC{{5} }(fibroblast pulmonar uman) folosind testul Alamar albastru după 72 de ore de incubație.

Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25.0 ug.mL-1). Dichamanetina (11) a arătat activitate citotoxică împotriva HL-60 și HCT116 cu valori IC50 de 15,78 ug·mL-1（33,70 μmol·L{-1) și, respectiv, 18,99 ug·mL-1（40,56 umol.L{-1）. Amestecul de uvarinol (12) și izouvarinol (13) a demonstrat activitate citotoxică împotriva HL-60, cu o valoare ICs0 de 9,74ug∶mL{-1, și HCT116, cu valoarea ICs0 de 17,31 ug∶mL{{ {30}}. Dintre dihidroflavonele benzilate, numai izorhamnetina (10) a prezentat activitate citotoxică împotriva HepG2 cu o valoare IC50 de 19,79 ug:mL-1(54,65 umol.-1). Conform literaturii de specialitate, dihidroflavonele benzilate sunt descrise cu proprietăți citotoxice [39-42]. Printre cele descrise în această lucrare, izorhamnetina (10), dichamanetina (11) și uvarinolul (12) sunt descrise în proprietățile citotoxice vitro împotriva liniilor de celule tumorale umane de carcinom al nazofaringelui (KB) și leucemie limfocitară P-388 (PS) cu valori IC50 de 5,3 și 4,1, 4,8 și 1,8 și 5,9 și 9,7, ug.mL-1, respectiv [39,40]. Aceste activități diferite pot fi atribuite prezenței uneia sau mai multor grupări hidroxi benzii prezente în molecule, precum și poziției în care aceste grupări sunt legate. Cu toate acestea, sunt necesare investigații suplimentare pentru a confirma această observație.

Activitatea citotoxică in vitro a alcaloizilor derivați de izochinolină anonaină (2), liri-adenină (3) și (S)-( plus )-reticulinei (4) a fost descrisă recent de Menezes și colab.[2{{16]. }}], Souza et al. [6] și Costa și colab. [43] cu accent pe liriodenina, care a demonstrat o activitate citotoxică puternică împotriva liniilor de celule canceroase B{{10}}F1{0(melanom de șoarece), HepG2 (carcinom hepatocelular uman), HL{{13 }} (leucemie promielocitară umană) și K562 (leucemie mielocitară cronică umană) cu valori IC5s0 sub 10,0 μmol.L{-1【43】. Anonaina a prezentat activitate moderată împotriva B{16-F10, HepG2, HL60 , și K562 cu valori IC50 mai mici de 19,0 umol.L-1[20]. (S)-( plus )-Reticulina a prezentat activitate moderată numai împotriva HepG2 cu valori IC50 de 15,35 μmol L-1【 6,20】.

3. Materiale și Metode

3.1. Proceduri generale experimentale

Rotațiile optice în metanol (MeOH) au fost înregistrate cu un polarimetru P{{0}} (Jasco, Tokyo, Japonia) la 589 nm. Experimentele RMN 1D și 2D au fost obținute în CDCl. (cloroform-d) sau CDCl plus picătură de CD, OD (metanol-du și CD, COCD3(acetonă-d6) la 298 K pe un spectrometru AVANCE I HD RMN (Bruker, Billerica, MA, SUA) care funcționează la 11,75 T (Mână 13C la 500 și, respectiv, 125 MHz) și pe un spectrometru RMN Bruker AVANCE I 6{00 care funcționează la 14,1 T('H și 13Cat 60{ {63}} și respectiv 150 MHz). Toate deplasările chimice lH- și 13C-RMN （δ） sunt prezentate în ppm în raport cu semnalul de tetrametilsilan la 0.00 ppm ca referință internă și constantele de cuplare (D) sunt date în Hz. Spectrometrul RMN a fost echipat cu o sondă de detecție inversă multinucleară de 5-mm (experimente RMN 1D și 2D) cu un gradient z. O legătură (HSQC) și două și Experimentele de corelare cu trei legături (HMBC)1H-13C-RMN au fost optimizate pentru constanta de cuplare medie JcH și LRJ(cH de 140 și, respectiv, 8 Hz. Pentru analiza spectrometriei de masă cu rezoluție joasă (LC-MS), probele de compuși izolați au fost resuspendate în metanol (grad HPLC), creând stocul k soluții (1 mg·mL-1). Alicote (5 uL) din soluțiile stoc au fost diluate în continuare la 5 ug·mL și analizate prin perfuzie directă într-un spectrometru de masă triplu cvadrupol, model TSO Quantum Access (Thermo Scientific, San Jose, CA, SUA), echipat cu ionizare electrospray. (ESI) sau surse de ionizare chimică la presiune atmosferică (APCI). Condiții ESI-MS: tensiune de pulverizare,5kV;gaz de înveliș, 10 unități arbitrare(arb); gaz auxiliar, 5arb; gaz de măturare, 0arb; temperatură capilară, 250 de grade; tensiune capilară, 40 V; lentilă tubulară, 70 V; domeniul de masă, m/z 100 până la 1000. Condiții APCI-MS: curent de descărcare, 5 μA; temperatura vaporizatorului, 350 de grade; presiunea gazului învelișului, 25 unitate arbitrară (arb); presiunea gazului de baleiaj ionic, 0,0 arb; presiune gaz auxiliar, 10 arb; temperatura capilară, 250 grade C; compensare lentile tubulare, 70 V; skimmer offset, 0 V; interval de masă, m/z 100 până la 1000. Argonul a fost folosit ca gaz de coliziune, iar spectrele MS/MS au fost obținute folosind energii de coliziune cuprinse între 25 și 30 eV. Silicagel 60 (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, SUA, 70-230 mesh) a fost utilizat pentru cromatografia pe coloană (CC), în timp ce silicagel 60 F254 (Macherey-Nagel, Düren, Germania, 0,25 mm, aluminiu) a fost folosit pentru cromatografie analitică și preparativă cu laver subțire (PTLC) (Macherey-Nagel, 1,00 mm, sticlă). Compușii au fost vizualizați prin expunere la lumină UV254/365, prin pulverizare cu reactiv p-anisaldehidă urmată de încălzire pe o placă fierbinte și prin pulverizarea reactivului Dragendorff.

3.2.Materiale vegetale

În cadrul anchetei de față, materialul botanic (scoarță) de D.calycina a fost colectat la 27 mai 2017 în Rezervația Adolpho Ducke (coordonate geografice: 02 grade 53'36.1S și 59 grade 58'28.9"W), Manaus, statul Amazonas , Brazilia, și identificat de Prof. Dr. Antonio Carlos Webber, taxonom de plante al Departamentului de Biologie al Universității Federale do Amazonas (DB/UFAM).Un exemplar de voucher cu numărul 10.810 a fost depus la Herbarul din DB/UFAM. accesul (specimenul) a fost înregistrat în Sistema Nacional de Gestao do Patrimonio Genetico e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) cu înregistrarea A70EDCD.

3.3. Extracție și izolare

Scoarța de D.calycina a fost inițial uscată la temperatura camerei timp de 24 de ore și apoi uscată într-un cuptor cu circulație a aerului timp de 48 de ore la o temperatură de 40 de grade, și ulterior pulverizată într-o mașină de măcinat cu patru cuțite (Marconi, Piracicaba, SP). , Brazilia) pentru a obține materialul sub formă de pulbere (1340 g). Apoi s-a efectuat o macerare exhaustivă cu hexan (8×4 L) urmată de MeOH (8×4 L). Soluțiile extractive obținute au fost concentrate într-un evaporator rotativ la presiune redusă (40-50 grade) pentru a da extractele de hexan (24,85 g) și, respectiv, MeOH (199,43 g).

Analiza TLC dezvăluită cu reactivul Dragendorff a indicat o prezență ridicată de alca-loizi în extractul MeOH. Prin urmare, o alicotă de extract de MeOH (188,30 g) a fost supusă inițial unei extracții acido-bazice pentru a da fracții alcaloidale (5,46 g) și neutre (4,47 g). Ulterior, o parte din fracția alcaloidală (5,0g) a fost supusă unei coloane cromatografice cu silicagel (CC) tratată anterior cu o soluție de NaHCO3 10% [12], eluată cu hexan (100%), hexan-CHCl, (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 și 10:90,v/o), CH2Cl2 (100 la sută), CH2Cl 2-EtOAc (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 și 10:90,0/u), EtOAc (100 la sută), EtOAc-MeOH (95:05, 90:10,85:05, 80:10,75:25, 70:30,60:40, 50:50,40:60, 30:70,20 :80 și 10:90, v/o), și în final MeOH dând 250 de fracții (30 mL fiecare). După evaluarea TLC folosind un amestec de CH2Cl2-MeOH în proporții de 95:05, 90:10, 85:15 și 80:20 ca sistem de eluent (v/o), probele similare au fost reunite pentru a da 16 fracții (F1 până la F16).

Fracția F5 (181,2 mg) din CC inițial eluată cu hexan-CH,Cl2 (50:50 până la 10:90, v/o) a fost supusă unui nou silicagel CC utilizând aceeași metodologie de mai sus eluată cu hexan (100 la sută), hexan -CH,Cl2 (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 și 10:90,v/o), CH,Cl ,(100 la sută), CHCl2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 și 10:90 ,o/), EtOAc (100 la sută), EtOAc-MeOH (85:15,70:30,50:50, 30:70 și 15:85, /o) și MeOH (100 la sută) dând 118 fracții ( 15 ml fiecare) care au fost reunite în 12 subfracții (F5.1 până la F5.12), conform evaluării analizei TLC folosind un amestec de CH2Cl2-MeOH în proporțiile de 95:05 și 90:10. Subfracția F5 .1 (28,9 mg) eluat cu hexan (100 la sută) a fost supus unui TLCeluat preparativ cu CH,Cl-MeOH (95:05,v/v,două eluții) dând 2 (1,4 mg) și 3 (1,7 mg), respectiv. Subfracțiile F5.4 (21,5 mg) eluate cu hexan-CH, C(80:20,vo), F5.5 (16,7 mg) eluate cu hexan-CH, CI (80:20,70:30,60;40 și 50:50) ,v/) și F5.6 (15,4 mg) eluate cu hexan-CHCI2 (50:50, 40:60 și 30:70, v/o) au fost reunite (53,6 mg) și, de asemenea, au fost supuse unui TLC preparativ eluat cu CH,CI-MeOH (95:05, v/u, două eluţii) rezultând 3 (8,9 mg).

Fracția F6(2099,1 mg) din CC inițial eluată cu hexan-CHCI(10:9{0,v/)), CH2Cl, (100 procente), și CH,Cl2-EtOAc (90:10 până la 10:90, o/o) a fost supus la un nou silicagel CC folosind aceeași metodologie de mai sus eluată cu aceleași sisteme de solvenți dând 140 de fracții (30 ml fiecare). După evaluarea TLC folosind un amestec de CH2Cl2-MeOH în proporții de 95:05, 90:10 și 85:15 ca sistem de eluent (o/o), probele similare au fost reunite pentru a da 13 subfracții (F6 .1 până la F6.13). Subfracția F6.6 (1541,3 mg) a fost supusă unui nou silicagel CC folosind aceeași metodologie de mai sus eluată cu aceleași sisteme de solvenți, oferind 120 de fracții (30 mL fiecare) care au fost analizate prin TLC (folosind aceeași metodologie de mai sus) oferind 12 noi subfracții (F6.6.1 la F6.6.12). Subfracția F6.6.2 (17,0 mg) eluată cu hexan-CH,CI, (60:40 și 50:50,v/v) a fost supusă unui TLCeluat preparativ cu CH2CI2-MeOH (90:10, v/o, o eluție) rezultând 3 (1,4 mg). Subfracția F6.6.3 (643,3 mg) eluată cu hexan-CH2CI2 (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 și 10:90, o/v), CH2CI2 (100 la sută) și CH2CI2-EtOAc (90:10 și 80:20, o/o) a fost supus unui TLCeluat preparativ cu CH2CI{2-MeOH (90 :10, vfo, o eluție) obținând o nouă subfracție F6.6.3.1 (161,8 mg) care a fost supusă unui nou TLC preparativ eluat cu EtOAc-MeOH (90:10, v/o, o eluție) dând 4 (148,2) mg). Subfracția F6.6.4 (90,2 mg) eluată cu CH2CI2-EtOAc (70:30 și 60:40, o/o) a fost supusă unui TLCeluat preparativ cu CH2CI-MeOH (90:10, v/o, o eluţie) dând 1 (1,4 mg) şi 4 (50,1 mg), respectiv. Subfracția F6.6.5 (83,4 mg) eluată cu CH,Cl-EtOAc (60:40 și 50:50, o/o) a fost de asemenea supusă unui TLCeluat preparativ cu CH,Cl{2-MeOH (90:10, ufo, o eluție) dând din nou 1 (1,5 mg) și, respectiv, 4 (45,5 mg). Subfracția F6.6.6 (101,4 mg) eluată cu CH,Cl2-EtOAc (50:50 și 40:60, v/)) a fost supusă unui TLC preparativ eluat cu CH,Cl-MeOH (90: 10, vfo, o eluție) dând 8 (3,4 mg) și altă subfracție F6.6.6.1 (48,8 mg). Această subfracție (F6.6.6.1) a fost supusă unui TLCeluat preparativ inițial cu EtOAc-MeOH (85 :15, vo, o eluție) și posterior CHCI-MeOH (90:10, v/v, o eluție) rezultând din nou 4 (37,4 mg). Pentru această procedură, placa cromatografică a fost iniţial eluată cu EtOAc-MeOH în fază mobilă (85:15, v/o, o eluţie). După această eluare, placa cromatografică a fost uscată pentru a îndepărta solventul și, ulterior, a fost supusă unei noi eluții cu faza mobilă CH,CI,-MeOH (90:10,vf,o eluție) rezultând 4.Subfracția F6.6.7 ( 109,0 mg) eluată cu CH,Cl2-EtOAc (40:60,30:70,20:80 și 10:90,vfo) a fost supusă unui TLC preparativ eluat cu CH,Cl2-MeOH (90:10,vo, o eluție) dând o altă subfracție F6.6.7.1 (24,8 mg) care a fost supusă unui nou TLC preparativ eluat inițial cu EtOAc-MeOH (85:15, v/o, o eluție) și ulterior CH2CI2-MeOH (90:10, vfo, o eluție) rezultând 9 (11,1 mg). Procedura de izolare utilizată pentru 9 a fost aceeași ca cea descrisă anterior pentru 4. Subfracția F6.6.10 (92,0 mg) eluată cu EtOAc-MeOH (60:40 și 50:50, v/o) a fost supusă unui TLCeluat preparativ cu CH, CI,-MeOH (90:10, v/o, o eluare) dând 5 (1,7 mg) şi respectiv 6 (7,8 mg). Subfracția F6.6.11 (326,0 mg) eluată cu EtOAc-MeOH (50:50,40:60,30:70,20:80 și 10:90,v/o) a fost supusă unui TLCeluat preparativ cu CHCI- MeOH (90:10, v/o, o eluţie) cu 1 (2,4 mg) şi respectiv 7 (12,5 mg).

Fracția F7 (692,4 mg) din CCeluată inițială cu EtOAc (100 la sută) și CHCl2-EtOAc (95:05,90:10,85:15 și 75:25,ofo) a fost supusă unui nou silicagel CCFolosind aceeași metodologie ca cea descrisă pentru CC inițială cu aceleași sisteme de solvenți care oferă 110 fracții (30 mL fiecare). După evaluarea TLC folosind un amestec de CH2Cl2-MeOH în proporții de 95:05, 90:10 și 85 :15 ca sistem de eluent (o/o), probele similare au fost reunite pentru a da 12 subfracții (F7.1 până la F7.12). F7.8 (147,4 mg) eluat cu CH,Cl2- EtOAc (50:50, 40:60 și 30:70, procente v/o) a fost supus unui TLC preparativ eluat cu CHCI-MeOH (95:05, vfo, o eluție) dând 10 (5,4 mg) și 11 ( 120,6 mg), respectiv. F7.9 (144,2 mg) eluat cu CHCI2-EtOAc (30:70, 20:80 și 10:90, v/o procente) a fost de asemenea supus unui TLCeluat preparativ cu CH,CI,-MeOH( 95:05,vo, o eluţie) dând 11 (91,2 mg) şi un amestec de 12 şi respectiv 13 (39,4 mg).

Thalifoline (1): pulbere amorfă maro;' H-RMN și 13C-RMN în conformitate cu literatura de specialitate [32]; LR-ESI(plus)-MS [M plus H]* plus m/z 208.

Anonaine (2): pulbere amorfă maro; 1H-RMN și 13C-RMN în conformitate cu literatura de specialitate [33]; LR-ESI(plus)-MS [M plus H] plus m/z 266.

Liriodenină (3): cristale galbene (CH, CI-MeOH 3:1); 1H-RMN şi 13C-RMN în conformitate cu literatura de specialitate [10,34]; LR-ESI(plus)-MS [M plus H] plus m/z 276.

(S)-( plus )-Reticulina(4): pulbere amorfă maro; []p25 plus 71,60(c 0,05 g/100 mL, MeOH); 1H-RMN și 13C-RMN în conformitate cu literatura de specialitate [27;LR-ESI(plus)-MS [M plus H] plus m/z 30.

3,4-Dihidro-7-hidroxi-6-metoxi-1-izochinolinil)({3-hidroxi{-4-metoxifenil)-metanonă (Dehidro-oxonorreticulină)(5 ): pulbere amorfă maro; Datele H și 13C-RMN, vezi Tabelul 1; LR-ESI(plus)-MS [M plus H] plus m/z 328.

( plus ){{0}}N-oxid de S,2R-reticulină (6): pulbere amorfă maro; [lp25 plus 136,4 (c0,146g/100 mL, MeOH); 1 Date 13C-RMN, vezi Tabelul 1; LR-APCI( plus )-MS [M plus H] plus m/2346

( plus ){{0}}S,2S-Reticulină N.-oxid (7): pulbere amorfă maro; []p25 plus 394,5 (c 0,03g/100 mL, MeOH);'H și date 13C-RMN, vezi Tabelul 1;LR-APCI( plus )-MS [M plus H] plus m/z346.

Coreximină (8): pulbere amorfă galben deschis;[]p25 plus 201,1(c 0,08g/100mL, MeOH)'H-RMN și 13C-RMN în conformitate cu literatura de specialitate[34,35];LR- ESI(plus)-MS [M plus H] plus m/z 328.

Bisnorargemonină (9): pulbere amorfă maro; 1H-RMN și 13C-RMN în conformitate cu literatura de specialitate [36]; LR-APCI(plus)-MS [M plus H] plus m/z 328.

Isochamanetin (10): pulbere amorfă galben deschis; [p25-12.4(c 0,5 g/100 mL, MeOH)'H-RMN și 13C-RMN în conformitate cu literatura de specialitate[37;LR-APCI(-)-MS [MH]-m/z361.

Dichamanetină (11): pulbere amorfă galbenă;[]D25-10.7(c0.5g/100 mL, MeOH);1H-RMN și 13C-RMN în conformitate cu literatura [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z467.

Un amestec de uvarinol (12) și izouvarinol (13): pulbere amorfă galbenă; H-RMN și 13C-RMN în conformitate cu literatura de specialitate [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z 573.

3.4.Testul citotoxic in vitro

3.4.1.Celule

HL-60 (leucemie promielocitară umană), MCF-7 (adenocarcinom mamar uman), HepG2 (carcinom hepatocelular uman), HCT116 (carcinom de colon uman) și MRC-5 (fibroblast pulmonar uman) Liniile celulare au fost obținute de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, SUA) și au fost cultivate așa cum este recomandat de ghidul de cultură de celule animale ATCC. Toate liniile celulare au fost testate pentru micoplasmă folosind un kit de colorare a micoplasmei (Sigma-Aldrich) pentru a valida utilizarea celulelor lipsite de contaminare.

3.4.2. Test de citotoxicitate

Pentru testul de citotoxicitate, viabilitatea celulară a fost cuantificată prin metoda albastru Alamar, așa cum s-a descris anterior [{{0}}]. Pentru toate experimentele, celulele au fost placate în 96-plăci de godeuri. Constituenții chimici au fost dizolvați în dimetil sulfoxid (DMSO, Vetec Ouimica Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brazilia) și adăugați în fiecare godeu și incubați timp de 72 de ore. Doxorubicina (clorhidrat de doxorubicină, puritate mai mare sau egală cu 95 la sută, Laboratorul IMA SAIC, Buenos Aires, Argentina) a fost utilizată ca martor pozitiv. La sfârșitul tratamentului, 20 μL dintr-o soluție stoc (0,312 mg/mL) de resazurină În fiecare godeu s-a adăugat (Sigma-Aldrich Co.) Absorbanțele la 570 nm și 600 nm au fost măsurate folosind un cititor de microplăci SpectraMax190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, SUA) Concentrația de semi-inhibare (IC50) a fost obținută prin regresie neliniară cu intervale de încredere de 95% (CI95%) utilizând software-ul GraphPad Prism (Intuitive Software for Science; San Diego, CA, SUA).

4. Concluzii

Investigația fitochimică a scoarței de D.calycina a condus la izolarea și identificarea a treisprezece compuși(1-13); nouă alcaloizi derivați din izochinolină (1-9) și patruflavonoide(10-13). Alcaloizii aparțin următoarelor subclase: izochinolină simplă, thali online(1);aporfină, anonaină (2); oxoaporfină, liriodenină (3); benzil-tetrahidroizochinoline, (plus )-reticulină(4), de hidro-oxonorreticulină(3,4-dihidro-7-hidroxi{-6-metoxi-1-izochinolinil)({{13} }hidroxi-4-metoxifenil)-metanonă)(5), Ng-oxid de 1S,2R-reticulină (6) şi N-oxid de 1S,2S-reticulină (7); tetrahidroprotoberberină, coreximină (8); și pavine, bisnorargemonină (9). În timp ce flavonoidele aparțin dihidroflavonelor benzilate, izouvarinol (10), dichamanetin (11) și un amestec de uvarinol (12) și izouvarinol (13). Compușii izolați sunt descriși pentru prima dată în D.calycina precum și în genul Diclinanona.

Activitatea citotoxică a compușilor izolați (cu excepția anonainei, liriodeninei, 1,2-dihidro-oxonorreticulinei și coreximinei) a fost evaluată împotriva cancerului (HL-60, MCF{-7, HepG2 și HCT116) și linii celulare necanceroase (MRC-5). Dintre acestea, cele mai promițătoare rezultate au fost observate pentru dihidroflavonele benzilate dichamanetin (10) și

amestecul de uvarinol (12) și izouvarinol (13) care a prezentat activitate citotoxică moderată împotriva liniilor de celule canceroase testate （<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-'). Dichamanetina (11) a arătat activitate citotoxică împotriva HL-60 și HCT116 cu valori IC50 de 15,78 ug·mL{-1 （33,70 μmol-L{-1) și 18,99 ug·mL-I（40 μmol. .L-1), respectiv, în timp ce amestecul de uvarinol （12） și izouvarinol (13) a demonstrat activitate citotoxică împotriva HL-60, cu o valoare IC50 de 9,74 ug∶mL-I, și HCT116, cu IC50 valoare de 17,31 ug·mL-1. Aceste rezultate pe liniile celulare tumorale sunt descrise, de asemenea, pentru prima dată pentru dihidroflavonele benzilate. Activitățile citotoxice ale reticulinei, anonainei și liriodeninei au fost stabilite anterior, în care liriodenina este compusul cel mai puternic.

Rezultatele obținute în această lucrare indică faptul că speciile din familia Annonaceae sunt o sursă promițătoare de compuși biologic activi cu proprietăți citotoxice și sugerează continuarea investigației lor în alte modele de teste biologice.

Referințe

1. Couvreur, TLP; Pirie, MD; Chatrou, LW; Saunders, RMK; Su, YCF; Richardson, JE; Erkens, RHJ Istoria evolutivă timpurie a familiei plantelor cu flori Annonaceae: diversificare constantă și geodispersie boreotropică. J. Biogeogr. 2011, 38, 664–680. [CrossRef]

2. Corrêa, MP Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e das Exóticas Cultivadas; IBDF Ministério da Agricultura: Rio de Janeiro, Brazilia, 1984.

3. Leboeuf, M.; Cave, A.; Bhaumik, PK; Mukherjee, B.; Mukherjee, R. Fitochimia Annonaceae. Phytochemistry 1982, 21, 2783–2813. [CrossRef]

4. Rupprecht, JK; Hui, Y.-H.; McLaughlin, JL Acetogenine anonacee: o revizuire. J. Nat. Prod. 1990, 53, 237–278. [CrossRef]

5. Lúcio, ASSC; Almeida, JRGDS; Da-Cunha, EVL; Tavares, JF; Filho, JMB Alcaloizi ai Annonaceae: Apariția și o compilație a activităților lor biologice. În Alcaloizi; Knolker, H.-J., Ed.; Elsevier: Amsterdam, Olanda, 2015; Capitolul 5; Volumul 74, p. 233–409. [CrossRef]

6. Souza, CAS; Nardelli, VB; Paz, WHP; Pinheiro, MLB; Rodrigues, ACBC; Bomfifim, LM; Soares, MBP; Bezerra, DP; Chaar, JS; Koolen, HHF; et al. Fenilpropanoizi derivati ​​din asaronă și alcaloizi derivați din izochinolină din scoarța Duguetia pycnastera (Annonaceae) și citotoxicitatea acestora. Quim. Nova 2020, 43, 1397–1403. [CrossRef]

7. Araújo, MS; Silva, FMA; Koolen, HHF; Costa, EV Alcaloizi derivați din izochinolină din scoarța de Guatteria olivacea (Annonaceae). Biochim. Syst. Ecol. 2020, 92, 104105. [CrossRef]

8. Ngouonpe, AW; Mbobda, ASW; Happi, GM; Mbiantcha, M.; Tatuedom, OK; Ali, MS; Lateef, M.; Tchouankeu, JC; Kouam, SF Produse naturale din planta medicinală Duguetia staudtii (Annonaceae). Biochim. Syst. Ecol. 2019, 83, 22–25. [CrossRef]

9. Santos, RC; Souza, AV; Andrade-Silva, M.; Cruz, KCV; Kassuya, CAL; Cardoso, CAL; Vieira, MC; Formaggio, ASN Investigație antioxidantă, antireumatică și antiinflamatoare a extractului și dicentrinonei din Duguetia furfuracea (A. St.-Hil.) Benth. & Cârlig. f. J. Etnofarmacol. 2018, 211, 9–16. [CrossRef]

10. Costa, EV; Pinheiro, MLB; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Valdez, RH; Ueda-Nakamura, T.; Dias Filho, BP; Nakamura, CV Activitatea tripanocidă a oxoaporfinei și pirimidin- -alcaloizilor carbolini din ramurile Annona foetida Mart. (Annonaceae). Molecules 2011, 16, 9714–9720. [CrossRef]

11. Silva, DB; Tulli, ECO; Milita, GCG; Costa-Lotufo, LV; Pessoa, C.; Moraes, MO; Albuquerque, S.; Siqueira, JM Activitățile antitumorale, tripanocide și antileishmaniale ale extractului și alcaloizilor izolați din Duguetia furacea. Phytomedicine 2009, 16, 1059–1063. [CrossRef] [PubMed]

12. Costa, EV; Pinheiro, MLB; Xavier, CM; Silva, JRA; Amaral, ACF; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Ferreira, AG; Machado, GMC; et al. O pirimidină- -carbolină și alți alcaloizi din Annona foetida cu activitate antileishmanială. J. Nat. Prod. 2006, 69, 292–294. [CrossRef]