Capitolul 5 Modificări ale activității enzimelor în timpul fermentației enzimelor
Oct 29, 2024
Capitolul 5 Modificări ale activității enzimelor în timpul fermentației enzimelor
Protează, lipază șisuperoxid dismutaza (SOD)sunt principalele enzime funcționale aleAlimentele de sănătate ale enzimei microbiene. Printre ei,proteazăjoacă un rol înpromovarea hidrolizei proteinei în alimenteîn corpul uman. În plus, poate descompune, de asemenea, unele celule pe moarte, poate îndepărta murdăria pe suprafața pielii și porii și poate juca un rol în exfoliere, astfel încât este utilizat pe scară largă în produsele de baie. Lipaza acționează asupra legăturii esterului dintre acizii grași și glicerol, iar substratul de hidroliză este în general uleiuri naturale. Prin urmare, se observă în multe alimente de pierdere în greutate și produse de sănătate. Multe femei sunt extrem de preocupate de subiectul pierderii în greutate, motiv pentru care enzimele au devenit rapid populare în întreaga lume.Enzimele sunt bogate în lipază, ceea ce înseamnă că au o valoare ridicată de cercetare și perspective de aplicare.GAZONeste o enzimă metalică specială care catalizează reacția de dismutație aRadicali de anion superoxid, prin urmareÎndepărtarea radicalilor anionului superoxidîn corp. Este o barieră de protecție pentru organisme, deci este utilizată pe scară largă în domeniul medical.
Acest capitol ia ca exemplu Enzima Apple. Începând de la etapa inițială a fermentației,Activități de superoxid dismutază, amilaza, lipaza, proteaza și celulaza în grupul experimental și grupul de control au fost măsurate la fiecare 15 zile pentru a reflecta în mod cuprinzător și sistematic tendința de schimbare a activității enzimei pe parcursul întregului proces de fermentare.
Faceți clic pentru a obține mai multe detalii
Serviciul de susținere al WeCistanche-cel mai mare exportator de Cistanche din China:
Email: wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/Tel: +86 15292862950
5.1 Materiale și metode
5.1.1 Materiale
(1) Materiale experimentale
Spălați merele proaspete cu apă sterilă în condiții sterile, uscați -le în mod natural pe o masă de funcționare sterilă, decojiți -le și feliați -le pentru utilizare ulterioară. Adăugați zahăr alb și mere la un borcan de sticlă sterilizat la un raport în masă de 1: 1. Activați bacteriile necesare pentru experiment și inoculați -le în enzimă în funcție de schema optimă (această etapă de operare este omisă pentru grupul de control), sigilați -o și așezați -o într -un loc rece și uscat. După 3 luni de fermentare a temperaturii camerei, luați o probă pentru a obține întregul lichid de enzimă care conține pulpa și filtrați -l. Luați supernatantul ca eșantion experimental. După ce eșantionul este centrifugat la 10, 000 rpm timp de 15 minute într-o centrifugă de mare viteză, acesta este utilizat pentru a măsura datele relevante. Este demn de remarcat faptul că, în procesul de a face enzime, pentru a evita contaminarea inutilă, toate operațiunile noastre au fost efectuate în condiții sterile.
(2) Instrumente principale
Instrumentele necesare pentru experiment sunt aceleași cu 3.1.1 (2).
5.1.2 Metode
(1) Determinarea activității superoxidului dismutază (SOD) [66]
Soluția de pirogallol a fost preîncălzită într -o baie de apă cu temperatură constantă de 25 de grade pentru o perioadă de timp. Conform tabelului 5.1, au fost adăugate o cantitate adecvată de tampon, apă distilată și același volum de acid clorhidric sau soluție de pirogallol. Baia de apă de temperatură constantă a fost stabilită la 25 de grade pentru 2 0 min. După ce lichidul mixt a fost rapid zguduit, a fost injectat imediat în cuvă. Valoarea de absorbție A0 a eșantionului a fost măsurată la fiecare 30 de secunde la o lungime de undă de 325 nm folosind un spectrofotometru.
Tab.5.1 Adăugați cantitatea de reactiv de benzen adiacent cu trei fenol pentru determinarea ratei de autoxidare
Metoda pentru determinarea activității SOD este practic aceeași cu operația de mai sus. Singura diferență este că înainte de a adăuga pirogallol, {{0}}. 5 ml de probă enzimatică soluția de concentrații diferite trebuie adăugate mai întâi. În același timp, se adaugă același volum de apă distilată. Absorbanța măsurată este ASOD. Rata de inhibare și activitatea enzimei SOD sunt calculate în conformitate cu Formula 5.1 și Formula 5.2: Rata de inhibare (%)=(△ A 0- △ ASOD)/△ A 0 × 100 (5.1) activitatea enzimatică (U/ML) =} rata de inhibare/50% × V (5.2) unde: v1 este volumul total al soluției, ML; V2 este volumul soluției de probă de enzimă, ML; △ A0 este rata de auto-oxidare a pirogallului; △ ASOD este rata de modificare a valorii de absorbție a eșantionului; N este determinarea multiplă a diluției (2) a activității amilazei Acest studiu a utilizat metoda colorimetrică cu amilază de iod pentru a determina activitatea amilazei. Etapele de operare specifice se referă la „procedura de operare de laborator clinic național” [67]. Este împărțit în principal în următoarele două puncte:
① Pregătirea soluției
Buffered starch solution ({{0}}.4g/L): Accurately weigh 9g of sodium chloride, 22.6g of anhydrous disodium hydrogen phosphate, and 12.5g of anhydrous potassium dihydrogen phosphate, dissolve them in 500mL of distilled water, and heat until Soluția fierbe; cântărește cu exactitate 0,4 g de amidon solubil, dizolvă -l în 10 ml de apă distilată, se amestecă uniform și se reglează la o pastă; Injectați soluția de amidon ajustată la o pastă în soluția de fierbere de mai sus și spălați paharul în mod repetat până când amidonul este transferat complet în soluția de apă clocotită. După agitarea uniformă cu o tijă de sticlă, se răcește la temperatura camerei, se adaugă 5 ml dintr -o soluție de formaldehidă de 37% pentru păr și se diluează la 1L cu apă distilată. Valoarea pH -ului soluției este de 7,0 ± 0,1 și este plasată la frigider pentru utilizare.
Soluție stoc de iod (0. 1 mol/l): cântăriți cu exactitate 1.7835g iod de potasiu și iodură de potasiu 22,5g într -o 500 ml curată
Beakerul, se adaugă încet și uniform 4,5 ml acid clorhidric concentrat, amestecând continuu în timpul procesului de adăugare, se diluează la scară cu apă distilată și se amestecă uniform. Pune -l în frigider pentru utilizare și păstrează -l într -o sticlă de reactiv maro.
Soluție de aplicație Iodine ({{0}}. 01mol/l): Luați o anumită cantitate de soluție stoc de iod (0,1 mol/L), diluați -o de 10 ori cu apă distilată, puneți -o în frigider pentru utilizare și depozitați -o timp de până la 1 lună.
② Etapele de funcționare experimentale
Luați soluția enzimatică și diluați -o de 10 ori cu soluție salină fiziologică și operați conform tabelului 5.2. Se amestecă bine, lungimea de undă a spectrofotometrului este de 660 nm, iar calea de lumină a cupei colorimetrice este de 10 mm. Zero cu apă distilată și citiți absorbția fiecărui tub. Calculați activitatea amilazei pe baza formulei de calcul de bază 5.3.
Tab.5.2 Etape de funcționare a determinării amilazei
(3) Determinarea activității lipasei
Metoda de determinare a fost realizată în conformitate cu QB/T {{0}} [68]. O soluție de testare a enzimei de 2% a fost preparată cu 0. 0 25 mol/L tampon fosfat (pH 7,5), fenolftaleina a fost utilizată ca indicator, iar acizii grași au fost titrați cu o soluție standard de hidroxid de sodiu. Activitatea lipazei a fost calculată pe baza volumului de hidroxid de sodiu consumat în experiment. Regula este: la un pH de 7,5 și o temperatură ambientală de 40 de grade, 1 ml de soluție de enzime lichide hidrolizează lipază timp de 1 min pentru a produce 1 μmol de acid gras, care este o unitate de activitate lipaza, exprimată ca U/ml. Apoi, activitatea lipazei a fost calculată conform Formulei 5.4: Activitatea enzimei (U/ML)=(BA) × C/0.05 × 50 × 1/15 × N=200/3 × (BA) × C × N (5.4) unde: B este volumul de soluție standard de hidroxid de sodiu, ML; A este volumul de soluție standard de hidroxid de sodiu consumată în grupul de control gol, ML; C este concentrația de soluție standard de hidroxid de sodiu, mol/L; 0,05 este factorul de conversie al concentrației de soluție standard de hidroxid de sodiu; 50 este conținutul de acid gras al soluției de hidroxid de sodiu; 15 min este timpul de reacție; n este multiplu diluare.
(4) Determinarea activității proteazei
Consultați GB/T 23527-2009 [69] cu ușoare modificări.
① Pregătirea curbei standard
Luați 1 ml de soluție standard de tirozină cu diferite concentrații de masă, care sunt 0, 1 0, 20, 30, 40 și 50mg/L, și adăugați 5 ml de 0,4mol/L soluție carbonat de sodiu și 1 ml de soluție de reactiv de folia la acesta. Reacționează timp de 20 de minute la o temperatură de 40 de grade. După finalizarea reacției, îndepărtați soluția de reacție și măsurați valoarea de absorbție a soluției la o lungime de undă de 680nm folosind un spectrofotometru. Desenați o curbă standard de tirozină cu concentrația de tirozină ca axa orizontală și valoarea de absorbție ca axa verticală.
Noile ierburi Cistanche cu putere antioxidantă puternică
② Determinarea activității proteazei
Grup experimental: luați 1 ml de soluție de cazeină cu o concentrație de 10 g/L și amestecați -o uniform cu 1 ml din soluția de probă pentru a fi testată și reacționați timp de 10 minute la o temperatură ambientală de 40 de grade; filtrați și obțineți filtratul după stație, luați 1 ml de filtrat, 5 ml de soluție de carbonat de sodiu și 1 ml de reactiv folin, amestecați uniform și reacționați pentru 20 de minute la o temperatură ambiantă de 40 de grade; Utilizați un spectrofotometru pentru a măsura valoarea de absorbție a soluției la o lungime de undă de 680nm.
Grup de control gol: Luați 1 ml din soluția de probă pentru a fi testat, adăugați acid tricloroacetic, reacționați complet la inactivarea proteazei, iar alte metode de funcționare sunt aceleași cu grupul experimental.
Calculați activitatea de protează conform formulei 5.5:
Activitate de protează (u/ml)=ak × 4/10 (5.5) unde: a este absorbția soluției enzimatice în grupul experimental; K este cantitatea de tirozină atunci când absorbția este egală cu 1; 4 este volumul total al soluției de reacție, ML; 10 este timpul de reacție, min.
(5) Determinarea activității celulozei [70]
Activitatea celulozei în enzime este, în general, exprimată de cantitatea de glucoză eliberată de o anumită cantitate de soluție de enzime pe unitate de timp. Principiul utilizării metodei hârtiei de filtrare pentru a măsura activitatea celulazei este că celulaza poate descompune celuloza în hârtia de filtrare pentru a produce metaboliți secundari, cum ar fi glucoza, iar glucoza poate reacționa cu 3, 5- acid dinitrosalicilic pentru a forma un complex galben. Culoarea acestei reacții este relativ luminoasă, ceea ce poate determina bine cantitatea de glucoză și alte zaharuri reducătoare produse.
①3, 5- Agent colorimetric acid dinitrosalicilic
Cântăriți cu exactitate 1 0 g de 3, 5- acid dinitrosalicilic cu un punct de topire de 168-169, dizolvați -l cu apă distilată, adăugați 20g de hidroxid de sodiu și 200g de potasiu de sodiu cu tartrat, continuați să se încălzească, până când solidul este complet disoluat, diluat la 500ml cu apă distilată, adăugați 2 și 0,5 g de sulfit de sodiu anhidru, amestecați continuu în timpul procesului de adăugare până când este complet dizolvat, opriți încălzirea după amestecare uniform, se răcește la temperatura camerei, transferați totul la un balon volumetric de 1000 ml, diluați la marcă cu apă distilată, așezați la temperatura camerei timp de o săptămână, filtrați, obțineți supernatantul și stocați într -o sticlă de reacție brună.② Hidroliză șinzimatică
Pipetă cu precizie {{0}}, 0. 5, 1. 0, 1,5, 2,0 ml soluție de probă de enzimă în 2 ml de soluție tampon de acetat de acid acetic cu o valoare de pH de 4,5. După 5 minute de baie de apă la temperatură constantă la 40 de grade, adăugați 6 bucăți de hârtie de filtrare a cromatografiei cu o suprafață de 1 × 1cm2 respectiv și începeți imediat momentul pentru a face timpul de reacție exact la 60 de minute. Transferați imediat în baia de apă clocotită pentru reacție timp de 10 minute, iar celulaza își pierde activitatea.
③ reacție de culoare
Luați soluția de eșantion de enzimă, adăugați 3 ml de 3, 5- agent colorimetric acid dinitrosalicilic preparat în ①, căldură în baie de apă clocotită timp de 15 minute, scoateți, răciți la temperatura camerei, adăugați 10 ml de apă distilată, amestecați uniform, utilizați spectrofotometru la o lungime de undă de 550Nm, ajustați grupul de control gol la zero și măsurați valoarea de absorbție.
④ Desenarea curbei standard a glucozei
Pregătiți o soluție standard de glucoză cu o concentrație de 1mg/ml cu exactitate și utilizați apă distilată pentru a face soluția standard de glucoză cu un volum de 0, 0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. din 3, 5- agent colorimetric acid dinitrosalicilic preparat în ① pentru a efectua reacția de dezvoltare a culorilor. Reglați curba standard cu concentrația de glucoză ca axa orizontală și absorbția ca axă verticală.
⑤Calculație
Utilizați valoarea de absorbție A după dezvoltarea culorii cu soluție enzimatică, apoi calculați cantitatea de eliberare a glucozei m în funcție de curba standard a glucozei și calculați în conformitate cu Formula 5.6:
Activitatea celulazei (u/ ml)=m/ (t · m) (5.6) unde: m este cantitatea de eliberare a glucozei, ug; T este timpul de hidroliză enzimatică, min; M este conținutul de enzimă în reacție, ug/ml.
