Autofagia mediată de însoțitor în bolile neurodegenerative și injuriile neurologice acute în sistemul nervos central partea 2

4. Instrumente de cercetare experimentală pentru testarea activității CMA

În această secțiune, descriem instrumentele de cercetare experimentală disponibile pentru testarea activității CMA in vitro și in vivo. Metodele utilizate în mod obișnuit pentru a obține informații sunt corelate cu activitatea CMA, precum și cu testele funcționale CMA.

CMA (Certified Management Accountant) este o certificare profesională de contabil de gestiune, care are ca scop certificarea persoanelor care au suficiente abilități operaționale și cunoștințe profesionale în domeniul contabilității de gestiune. Memoria, o capacitate a creierului uman, se referă la capacitatea de a-și aminti informații, cunoștințe sau experiență.

Există o anumită relație între CMA și memorie. În primul rând, examenul CMA cere candidaților să-și amintească un număr mare de puncte de cunoștințe și concepte și, în același timp, solicită candidaților să stăpânească abilitățile de aplicare a acestor puncte de cunoștințe. Prin urmare, memoria excelentă va juca un rol foarte important în obținerea unor rezultate bune la examenul CMA.

În al doilea rând, memoria poate fi îmbunătățită prin învățare și practică, ceea ce ajută și la studiul pentru examenul CMA. De exemplu, revizuind în mod repetat punctele de cunoștințe, învățând și memorând informații în diferite moduri și folosind tehnici de memorie, puteți îmbunătăți memoria și ajuta candidații să stăpânească mai bine punctele de cunoștințe și abilitățile necesare pentru examenul CMA.

În cele din urmă, studiul CMA nu este doar un examen, ci și o îmbunătățire a calității profesionale. În dezvoltarea carierei, dacă vrei să-ți exerciți mai bine capacitatea profesională, ai nevoie în mod natural de o anumită capacitate de memorie pentru a te ajuta să-ți duci mai bine sarcinile de lucru.

Pe scurt, există o relație strânsă între CMA și memorie. Încercarea de a-ți îmbunătăți memoria nu numai că te va ajuta să obții note bune, ci și să-ți îndeplinești mai bine sarcinile de lucru și să-ți realizezi valoarea personală și realizările în carieră pe măsură ce cariera ta se dezvoltă. Se poate observa că trebuie să ne îmbunătățim memoria, iar Cistanche deserticola poate îmbunătăți semnificativ memoria deoarece are efecte antioxidante, antiinflamatorii și anti-îmbătrânire, care pot ajuta la reducerea oxidării și inflamației la nivelul creierului, protejând astfel sănătatea sistemul nervos. În plus, Cistanche deserticola poate promova, de asemenea, creșterea și repararea celulelor nervoase, sporind astfel conectivitatea și funcția rețelei neuronale. Aceste efecte pot ajuta la îmbunătățirea memoriei, a capacității de învățare și a vitezei de gândire și pot preveni, de asemenea, apariția disfuncțiilor cognitive și a bolilor neurodegenerative.

Faceți clic pe Know pentru a crește puterea memoriei

4.1. Analize utile pentru monitorizarea activității CMA

Evaluarea modificărilor cantităților principalelor componente moleculare ale CMA poate fi utilizată ca o modalitate indirectă de evaluare a activității CMA [46]. În plus, numărul și distribuția lizozomilor activi CMA pot fi analizate pentru a deduce modificări ale activității CMA [46].

Cu toate acestea, aceste analize oferă doar datele corelate cu statutul CMA. Astfel, aceste analize ar trebui completate cu teste funcționale [47]. Imunoblotting și imagistica pentru evaluarea modificărilor componentelor principale CMA sunt cele mai frecvent utilizate metode pentru evaluarea activității CMA.

Deoarece nivelurile lizozomale ale LAMP2A sunt limitate pentru CMA [48], modificările abundenței proteinei LAMP2A în lizozomi se corelează de obicei cu activitatea CMA. Prin urmare, în evaluările imagistice, ar trebui analizată prezența LAMP2A la membrana lizozomală [47].

Imunoblotting pentru LAMP2A folosind fracții îmbogățite cu lizozomi sau cel puțin o fracțiune de celule membranoase este mai informativ decât cel folosind lizate de celule întregi [46]. Nivelurile de lizozomal-hsc70 sunt, de asemenea, legate de activitatea CMA [49].

Cu toate acestea, hsc70 este unul dintre cele mai abundente chaperone celulare, iar fracția localizată în lizozomi este o cantitate mică. Prin urmare, imunoblotting pentru hsc70 în lizatele celulare totale nu este informativă pentru CMA [46]. Colocalizarea hsc70 cu markeri lizozomali (de exemplu, LAMP1) poate fi utilizată pentru a detecta lizozomii activi CMA [49].

Numărul acestor lizozomi colocalizați cu hsc70 proporțional cu întregul bazin lizozomal crește atunci când CMA este activată [12]. În plus, o analiză microscopică electronică folosind colorarea cu imunogol pentru hsc70 poate oferi, de asemenea, informații despre grupul de lizozomi activi cu CMA [49].

În analizele care utilizează lizozomi izolați din celule sau țesuturi, nivelurile crescute de substraturi CMA bine-cunoscute (de exemplu, GAPDH) pot indica o activitate scăzută a CMA [46].

În general, substraturile CMA sunt degradate rapid după translocare [6]. Astfel, o comparație a nivelurilor lizozomiale ale substraturilor CMA în celule sau animale între modelele tratate sau netratate cu inhibitori ai proteazelor lizozomale (adică, leupeptina) permite măsurarea fluxului în valorile CMA [24].

4.2. Teste funcționale

Mai multe teste funcționale permit urmărirea activității CMA în timp în celule, țesuturi și organele izolate.

4.2.1. Evaluarea degradării proteinelor intracelulare

Aproximativ 30% din proteinele citosolice totale pot fi degradate de CMA [9]. Cu toate acestea, fracția reală a proteinei citosolice degradată de CMA variază în funcție de tipul celular și de condițiile celulare [6].

Prin urmare, măsurarea grupului de proteine ​​celulare care suferă degradare prin CMA este o metodă comună pentru determinarea activității generale a căii CMA [46].

Experimentele cu puls și urmărire folosind un aminoacid radiomarcat și inhibitori fie ai proteazelor lizozomale, fie ai altor căi autofagice pot fi utilizate pentru a discrimina proteinele care suferă degradarea CMA de cele gestionate de alte căi [50].

4.2.2. CMA Reporteri fotoconvertibile

În plus, o metodă de monitorizare a asocierii lizozomale a reporterilor CMA fluorescenți artificiali ar fi, de asemenea, utilă pentru urmărirea livrării și degradării substratului prin CMA [51].

Folosind reporteri fluorescenți fotoconvertibili [51], este posibil să urmăriți asocierea proteinei fotoconvertite cu lizozomi într-un canal de fluorescență diferit. O creștere a numărului de puncta fluorescente pe celulă ar fi un bun indicator al activării CMA [46].

4.2.3. Analize in vitro ale CMA folosind lizozomi izolați

Conversația dintre diferitele căi autofagice face dificilă evaluarea cu precizie a activității CMA în celulele intacte [41]. Prin urmare, trebuie să analizăm separat toți pașii funcționali implicați în procesul de degradare dinamică a căilor CMA [46,49].

Abordarea cea mai sigură pentru analiza activității CMA este obținută prin reconstituirea in vitro a CMA cu lizozomi izolați [52]. Izolarea fracției specifice de lizozomi activi în CMA permite o analiză a conținutului de substraturi CMA endogene în compartimentele CMA [47].

Lizozomii izolați permit, de asemenea, reconstituirea CMA in vitro pentru a urma pașii implicați în legarea procesului CMA-substrat, absorbția lizozomală și degradarea lizozomală [50].

Tratamentul cu inhibitori de protează lizozomală urmat de incubarea cu substratul CMA va permite măsurarea substratului legat și translocat în lizozomi (legarea și absorbția) [39].

Prin scăderea cantității de substrat legat de lizozomină despre care proteoliza nu a fost prevenită, ar fi apoi posibil să se calculeze absorbția [39,53].

Fracțiunile lizozomale izolate permit, de asemenea, compararea directă a modificărilor conținutului, modificării post-translaționale și organizarea componentelor CMA la nivelul membranei lizozomale. Reducerile nivelurilor lizozomale LAMP2A sau lys-hsc70 la izozozomii sunt indicative pentru scăderea activității CMA [54,55], în timp ce creșterile LAMP2Alevels sugerează o reglare în creștere a activității CMA [56].

În plus, raportul LAMP2A lizozomal asamblat într-un complex multimeric la un moment dat poate fi determinat folosind electroforeza bluenative a lizozomilor izolați și imunoblot pentru LAMP-2A [57].

5. Boli neurodegenerative și CMA

Neuronii sunt celule post-mitotice și necesită mașini eficiente de degradare a proteinelor pentru a menține homeostazia celulară în condiții de stres [58,59]. Deteriorarea procesului de degradare a proteinelor din SNC determină agregarea proteinelor aberante sau deteriorate, care este o caracteristică distinctă a multor boli neurodegenerative.

S-au adunat dovezi substanțiale că disfuncția CMA este asociată cu diferite patologii în diferite boli neurodegenerative care afectează SNC [1,14].

În aceste boli, diferite proteine ​​patogene au fost identificate ca substraturi ale CMA, cum ar fi -sinucleina în PD [60], Tauprotein în AD [61], huntingtin (Htt) în HD [62,63] și TDP{{5} } în ALS și FTLD [64,65].

5.1. Boala Parkinson

PD este una dintre cele mai frecvente tulburări neurodegenerative. Principalele caracteristici patologice ale PD sunt pierderea treptată a neuronilor dopaminergici în substanța neagră și agregarea proteinei -sinucleinei în corpii Lewy.

Numeroase studii au arătat că afectarea CMA este legată de principala patogeneză a PD [4,66]. La pacienții cu PD, nivelul proteinei LAMP2A este scăzut în creier, indicând faptul că activitatea CMA este atenuată [67,68].

Multe studii anterioare au sugerat că inhibarea căii de degradare a CMA determină acumularea de -sinucleină, care este asociată cu pierderea treptată a neuronilor dopaminergici [8].

Este important că formele mutante A53T și A30P ale sinucleinei identificate în PD familială nu pot fi degradate de CMA. În plus, aceste forme mutante se leagă strâns de LAMP2A la membrana lizozomală și, în consecință, inhibă degradarea normală a altor substraturi CMA in vitro [60,69]. Mutația G2019S în proteina kinazei 2 repetate bogate în leucină (LRRK2) poate fi o cauză patologică a PD familială. [70].

Mutantul G2019S inhibă asamblarea dinamică a complexului de translocare CMA la membrana lizozomală, provocând disfuncția CMA în modelul de mușcă al PD și a creierului pacienților mutanți LRRK2 PD [25]. În plus, formele mutante patogene ale LRRK2 se leagă de Hsc70 citosolic și interacționează anormal cu componentele CMA, blocând degradarea altor substraturi CMA și homeostaza proteinelor neuronale in vitro [25,71].

Ubiquitin C-terminal hidrolaza L1 (UCH-L1) interacționează fizic cu LAMP-2A, Hsc70 și Hsp90 și este implicată în mecanismul de reglare al căii CMA [72]. Într-un studiu anterior, forma mutantă I93M a UCH-L1 a fost identificat într-o singură familie PD [73].

De asemenea, s-a raportat că mutația I93M în UCH-L1 a îmbunătățit anormal interacțiunea cu regiunea citosolică a LAMP2A, inhibând calea CMA in vitro [74]. În plus, expresia formei mutante I93M a celulelor de mamifere UCH-L1 a indus creșterea asociată cu inhibarea CMA a cantității de sinucleină [74].

Aceste descoperiri sugerează că interacțiunea aberantă a formei mutante I93M a UCH-L1 cu aparatura CMA ar putea sta la baza patogenezei PD asociată cu agregarea -sinucleinei. Proteina 7 a bolii Parkinson (PARK7), cunoscută și sub numele de DJ-1, este o proteine ​​multifuncționale implicate într-o varietate de activități celulare, inclusiv rezistența la oxidare [75].

PARK7/DJ-1are un rol important în menținerea homeostaziei mitocondriale [75]. S-a raportat că o mutație a genei DJ-1 mediază formele autosomale recesive și timpurii de PD [76]. Deficiența de DJ-1 a accelerat degradarea LAMP2A în lizozomi, ducând la agregarea -sinucleinei [77 ].

În schimb, DJ-1 a reușit să inhibe acumularea de -sinucleină prin reglarea CMA [78]. În general, diferite mecanisme moleculare care cauzează disfuncția CMA sunt considerate a sta la baza patogenezei PD.

Cu toate acestea, mecanismele patologice asociate cu CMA rămân în mare parte neclare. Vor fi necesare cercetări suplimentare pentru a clarifica relația dintre procesul CMA și patologiile reale ale PD.

5.2. Boala Alzheimer

AD este cea mai frecventă boală neurodegenerativă la vârstnici. Principala patogeneză a AD este formarea plăcii de amiloid și agregarea Tau cauzată de afectarea homeostaziei proteinelor. Mai multe proteine ​​legate de AD au fost identificate ca substraturi CMA. Degradarea CMA a acestor substraturi proteice s-a dovedit a fi afectată la pacienții cu AD [45,61,79].

Acumularea progresivă de oligomeri-amiloid este un eveniment toxic central în AD [80,81]. Un studiu recent a arătat că etichetarea oligomerilor-amiloid cu mai multe motive KFERQ a promovat intrarea lor în endozomi și lizozomi, protejând neuronii corticali umani de cultură primară de neurotoxicitate [82]. Proteina precursor de amiloid (APP) este o moleculă patogenă importantă în AD deoarece poate fi procesată pentru a produce amiloid- [83].

APP conține un motiv asemănător KFERQ la capătul său C-terminal. Acest motiv este important pentru procesarea normală și degradarea APP pentru a preveni acumularea fragmentelor APP-C-terminale [84]. Un studiu recent a arătat că APP este un substrat CMA care se leagă de Hsc70 [85].

Inhibarea degradării CMA a APP îi sporește citotoxicitatea. În plus, activarea CMA de către supraexpresia Hsc70 sau metformină a redus nivelurile acumulate ale plăcii de amiloid din creier și a inversat fenotipurile AD moleculare și comportamentale într-un model de AD de șoarece [85]. Tau este o proteină citosolică care stabilizează în mod normal microtubulii din celulele neuronale.

Tauproteina are motive care vizează CMA și poate fi degradată de calea CMA [79]. Agregarea proteinelor Tau mutante care are ca rezultat hiperfosforilarea Tau și formarea de încurcături neurofibrilare este un semn distinctiv al AD și al tauopatiilor asociate [86,87].

În plus, proteinele Tau mutante pot interacționa anormal cu LAMP2A și pot inhiba translocarea în lumenul lizozomului, afectând activitatea CMA [79]. Regulatorul calcineurinei 1 (RCAN1) este un substrat al CMA [45] și este crescut la pacienții cu AD [88].

RCAN1 este un inhibitor al defosforilării dependente de calcineurină a proteinelor Tau. Este important că activitatea CMA poate fi inhibată prin creșterea nivelului de RCAN1, afectând astfel degradarea altor substraturi ale CMA [45].

5.3. Boala Huntington

HD este o tulburare neurodegenerativă cu debut tardiv, caracterizată prin mișcări necontrolate, demență și tulburări emoționale. HD este o boală moștenită predominant cauzată de acumularea și agregarea proteinei Htt mutante în neuronii striatali și corticali.

Htt conține un tract N-terminal de poliglutamină (poliQ) expandat anormal [62,63,89]. Disfuncția degradării Htt este sugerată ca principala patogeneză a HD.

Studiile anterioare au arătat că CMA este implicată în degradarea Htt-ului mutant în modelele celulare și de șoarece ale HD [62]. Htt adăpostește un presupus motiv KFERQ și interacționează cu componentele cheie ale CMA, Hsc70 și LAMP2A. În plus, mutantul Htt cu o expansiune a tractului poliQ prezintă o absorbție afectată de CMA in vitro [89].

Nu numai CMA, ci și macroautofagia este implicată în degradarea Htt [90]. Htt se poate lega atât de LAMP2A, cât și de proteina Atg7 legată de macroautofagie în procesul de degradare [89,91,92].

Se pare că activitatea CMA este suprareglată în modelele celulare și animale ale HD în stadiul inițial al bolii. Cu toate acestea, activitatea CMA scade în stadiul târziu al bolii [91]. Aceste constatări sugerează că creșterea timpurie a activității CMA poate fi o reglementare compensatorie ca răspuns la ineficiența macroautofagiei. Scăderea nivelului de LAMP2A lizozomal indică faptul că există o pierdere a funcției CMA în faza târzie a HD [91].

5.4. Scleroza laterală amiotrofică și degenerescenta lobară frontotemporală

ALS și FTLD sunt boli neurodegenerative cu multe caracteristici clinice și patologice similare [93]. Răspunsul la transactivare Proteina de legare la ADN de 43 kDa (TDP-43) este o proteină ribonucleară care reglează multe aspecte ale metabolismului ARN.

Acumularea de fragmente TDP-43 C-terminale în celulele neuronale este detectată frecvent la pacienții cu ALS și FTLD [65]. Astfel, acumularea de TDP-43 este considerată pe scară largă un semn distinctiv al acestor boli.

Proteina TDP-43 conține un motiv asemănător KFERQ care se leagă de Hsc70 și poate fi degradată de procesul CMA [94,95]. Expresia Hsc70 a fost redusă în limfomonocitele pacienților cu SLA sporadic și a contribuit la acumularea de TDP-43 [64].

O mutație a motivului asemănător KFERQ în TDP-43 poate perturba degradarea acestuia prin CMA, inducând acumularea de TDP-43 și inhibarea CMA în celulele cultivate [94]. CMA poate ajuta la controlul turnover-ului formelor fiziologice și patologice de TDP-43 [94].

For more information:1950477648nn@gmail.com