Capitolul 1: Peroxizomii tubulari renali sunt dispensabili pentru funcționarea normală a rinichilor

Pentru mai multe informații, contactațitina.xiang@wecistanche.com

Peroxizomii sunt organite celulare specializate implicate într-o varietate de procese metabolice. La om, mutațiile care conduc la pierderea completă a peroxizomilor provoacă insuficiență multiorganică (tulburări ale spectrului Zellweger, ZSD), inclusivinsuficiență renală. Cu toate acestea, rolul (pato)fiziologic al peroxizomilor înrinichirămâne necunoscut. Am abordat rolul peroxizomilor înfunctie renalala șoareci cu ablația condiționată a biogenezei peroxizomale în tubul renal (șoareci cKO). Analizele funcționale nu au evidențiat niciun fenotip renal evident la șoarecii cKO. Cu toate acestea, șoarecii masculi cKO sugari aveau greutăți corporale și ale rinichilor mai mici, iar șoarecii masculi adulți cKO au prezentat reduceri substanțiale ale greutății rinichilor și ale raportului greutate rinichi/greutate corporală. Analiza stereologică a arătat o creștere a densității mitocondriilor în celulele tubulare proximale ale șoarecilor cKO. Analizele integrate ale transcriptomului și metabolomului au relevat o reprogramare profundă a mai multor căi metabolice, inclusiv metabolismul glutationului și biosinteza/biotransformarea mai multor clase majore de lipide. Deși această analiză a sugerat compensatstresul oxidativ, provocarea cu hrănirea bogată în grăsimi nu a indus insuficiențe renale semnificative la șoarecii cKO. Demonstrăm că peroxizomii tubulari renali sunt dispensabili pentru funcția renală normală. Datele noastre sugerează, de asemenea, că insuficiența renală la pacienții cu ZSD sunt de origine extrarenală.

Faceți clic aici pentru a afla despre beneficiile extractului de cistanche tubulosa

Introducere

Peroxizomii sunt organele legate de o singură membrană care au fost găsite pentru prima dată în rinichii de șoarece de către Rhodin în 1954 (1). Estimările actuale sugerează că peroxizomii conțin mai mult de 50 de enzime implicate într-o varietate de funcții celulare, inclusiv -oxidarea acizilor grași cu lanț foarte lung (VLCFA), acizi grași cu lanț lung (LCFA) și acid dicarboxilic cu lanț lung; a-și-oxidarea acizilor grași cu lanț ramificat; oxidarea prostaglandinelor și leucotrienelor; metabolismul aminoacizilor; biosinteza fosfolipidelor eterice (inclusiv plasmogeni) și acizilor biliari; homeostazia redox; detoxifiere cu glioxilat; si ferroptoza. Peroxizomii sunt prezenți omniprezent în aproape toate celulele de mamifere, cu cea mai mare abundență în celulele tubului proximal renal și hepatocite. În aceste celule, peroxizomii ocupă aproximativ 3 la sută din volumul celulei, dar numărul, dimensiunea și forma lor variază semnificativ în timpul dezvoltării embrionare și postembrionare (2); numărul lor poate crește foarte mult în diferite condiții de stres (3). Deși multe enzime peroxizomale au fost bine caracterizate, studiile care abordează expresia și rolul lor funcțional în rinichi sunt puține. Mai mult, relevanța funcțională generală a peroxizomilor în rinichi rămâne în mare parte necunoscută.

Dovezile pentru rolul peroxizomilor în (pato)fiziologia renală au apărut în principal din studiile de genetică umană. Au fost identificate două tipuri de mutații care conduc la tulburări peroxizomale umane: (i) mutații în așa-numitele gene peroxizomale (PEX) implicate în biogeneza peroxizomală și (ii) mutații în enzime peroxizomale specifice. Primul tip de mutație duce la disfuncția peroxizomală generalizată care provoacă tulburări de spectru Zellweger cerebrohepatorenal (ZSD)(4). Sugarii cu forme severe de ZSD mor de obicei în primul an de viață din cauza insuficienței multiorganice. Chiar dacă prezența chisturilor renale corticale și/sau a calculilor renali de oxalat la pacienții cu ZSD a fost bine documentată de-a lungul anilor(5, 6), mecanismele moleculare care conduc la aceste afectări rămân până acum necunoscute. Alte posibile anomalii renale în ZSD nu au fost investigate deoarece boala este dominată de complicații neurologice. Impactul formelor intermediare sau mai ușoare de ZSD asupra funcției renale nu a fost evaluat sistemic. Dovezile care leagă deficiența unei singure enzime peroxizomale de patofiziologia renală rămân, de asemenea, limitate.

Mutațiile din alanina peroxizomală hepatică: glioxilat aminotransferaza codificată de gena AGXT duc la hiperoxalurie primară de tip I, o boală caracterizată prin depunerea cristalelor de oxalat de calciu în rinichi (revizuită în ref. 7). Recent, a fost identificată o mutație autozomal dominantă care duce la sindromul Fanconi renal, sau disfuncția generalizată a tubului proximal, în enzima peroxizomală enoil-CoA hidrtaza și 3-hidroxiacil CoA dehidrogenază (EHHADH)(8) . Această mutație provoacă direcționarea greșită a EHHADH către mitocondrii și afectarea funcției mitocondriale. Studiile genetice efectuate pe tulpini congenice de șobolan au arătat că enzima peroxizomală hidroxiacizi oxidaza 2(HAO2) poate juca un rol în controlul tensiunii arteriale (9,10). Cu toate acestea, rămâne necunoscut dacă acest fenotip se datorează modificării funcției HAO2 în rinichi sau în alte țesuturi. În general, datele de la modele animale cu defecte specifice rinichilor de biogeneză peroxizomală sau inactivarea specifică rinichilor a unei singure enzime peroxizomale încă lipsesc. Aici, am abordat rolul peroxizomilor în funcția renală la șoareci masculi și femele cu ablația condiționată a biogenezei peroxizomale în tubul renal.

Rezultate

Generarea și caracterizarea de bază a șoarecilor sugari masculi și femele cu ablația condiționată a biogenezei peroxizomale în tubul renal. Biogeneza peroxizomului în tubul renal a fost perturbată prin inactivarea condiționată a receptorului 1 (PTS1) de țintire a peroxizomului citosolic care codifică Pex5, care este esențial pentru importul proteinelor care conțin motivul PTS1 în peroxizomi (11,12). Eliminarea condiționată a Pex5 în tubul renal a fost realizată folosind un sistem inductibil cu doxiciclină (inductibil cu DOX) (șoareci PexSanlo/Pax8-rtTA/LC1, ref.13). Deoarece importanța funcțională a peroxizomilor poate fi dependentă de vârstă(14), caracterizarea de bază a deficienței Pex5 în rinichi a fost efectuată atât la șoareci sugari, cât și adulți. În experimentele cu șoareci sugari, excizia alelei Pex5 floxate a fost realizată prin administrarea de DOX (2 mg/mL în apă de băut) la femelele gravide la E14 și menținută până la P7. Șoarecii sugari au fost sacrificați la P28. Șoarecii cu genotip Pex5oilo au fost utilizați ca martori. După cum se arată în figura suplimentară 1A (material suplimentar disponibil online cu acest articol; https://doi.org/10.1172/jci.insight.155836DS1), tratamentul DOX a dus la excizia aproape completă a alelei Pex5 floxate în Pexswn/Pax{{{{ 29}}Șoareci sugari masculi și femele GTA/LC1. Analiza secțiunilor renale nu a evidențiat nicio anomalie histologică evidentă sau calculi renali la șoarecii sugari lipsiți de Pex.5 în tubul renal (neprezentat). Albuminuria a fost absentă în probele de urină spot ale șoarecilor Pex5-sugari lipsiți de ambiisexe(Figura suplimentară 1B). Greutatea corporală (BW) și greutatea rinichilor (KW), dar nu și raportul KW/BW, au fost mai mici la șoarecii sugari de sex masculin lipsiți de Pex5-în comparație cu martorii de așternut (Figura suplimentară 1C).

Generarea și caracterizarea de bază a șoarecilor adulți masculi și femele cu ablația condiționată a biogenezei peroxizomale în tubul renal. Deleția Pex5 în tubul renal al șoarecilor adulți a fost indusă de un tratament de 2-săptămână cu DOX al șoarecilor masculi și femele de 8-săptămâni Pex5xio/Pax8-ntTA/LC1, denumiti în continuare ca șoareci cKOm și, respectiv, cKOf (vezi Metode). În paralel, același tratament cu DOX a fost furnizat martorilor lor littermate (șoarecii Pex5a/lx, denumiți în continuare șoareci Ctrlm și respectiv Ctrlf). Toate experimentele pe șoareci adulți au fost efectuate la 4 săptămâni după terminarea tratamentului cu DOX. După cum se arată în Figura 1A, expresia ARNm Pex5 a fost redusă semnificativ în rinichii atât ai șoarecilor cKOm, cât și ai cKOf. Cu toate acestea, la șoarecii cKOf, a fost detectabil și un ARNm Pex5 rezidual de lungime completă, ceea ce sugerează excizia incompletă a alelei floxate. În mod similar, proteina PEX5 a fost practic absentă în rinichii șoarecilor cKOm, dar încă detectabilă la șoarecii cKOf, deși la un nivel substanțial mai scăzut. Această diferență a fost vizibilă atunci când extractele de rinichi de la șoareci cKOm și cKOf au fost încărcate pe același gel SDS-PAGE și imunoblotate împreună (Figura 1B). Atât șoarecii Kim, cât și cKOf au fost viabili, nu au prezentat anomalii evidente și au avut BW normal în comparație cu șoarecii martor (Tabelul suplimentar 1). Raporturile KW și KW/BW au fost substanțial mai mici la șoarecii cKOm comparativ cu șoarecii Ctrl, dar nu la șoarecii cKOf comparativ cu șoarecii Ctrlf (Figurile 1, C și, respectiv, D). Analiza probelor de urină și plasmă de 24-oră nu a evidențiat un efect al genotipului la șoarecii de ambele sexe, cu excepția nivelurilor mai scăzute de potasiu în plasmă la șoarecii cKOm în comparație cu șoarecii Ctrl (Tabelul suplimentar 1). Albuminuria a fost absentă în urină atât la șoareci cKOm, cât și la cKOf (Figura suplimentară 2A). Nu au fost observate modificări morfologice grosolane, depozite de oxalat de calciu sau acumulare de lipide în rinichiul șoarecilor cKOm (Figura suplimentară 2, respectiv BD).

Evaluarea prin microscopie electronică a celulelor tubulare proximale la șoarecii adulți cKO. Evaluarea prin microscopie electronică a cortexului renal a relevat un număr mare de peroxizomi în celulele tubulare proximale ale șoarecilor Ctrlm și Ctrlf (Figura 2, A și, respectiv, B). Peroxizomii erau practic absenți în tubii proximali ai șoarecilor cKOm și cKOf (Figura 2, respectiv Cand D). Au fost folosite instrumente stereologice pentru analiza cantitativă a celulelor

organele și dimensiunile celulare în tubii proximali ai șoarecilor Ctrlm și cKOm. Atât densitatea de volum a peroxizomilor (număr/μm² citoplasmă), cât și procentul de citoplasmă ocupat de peroxizomi în celulele tubulare proximale au scăzut dramatic la șoarecii cKOm (Figura 3, A și B, respectiv), Dimpotrivă, densitatea volumului mitocondrial, precum și procentul de citoplasmă ocupat de mitocondrii în celulele tubulare proximale, a fost crescut la șoarecii cKOm în comparație cu șoarecii Ctrl (Figura 3, C și, respectiv, D). De asemenea, densitatea volumului și procentul de citoplasmă ocupat de lizozomi în celulele tubulare proximale nu au fost diferite între șoarecii Kim și Ctrlm (Figura 3, E și, respectiv, F). După cum se arată în Figura 3G, celulele tubulare proximale de la șoarecii cKOm au avut tendința de lățime redusă a celulei (P= 0.083).

Analizele transcriptomice și metabolomice integrate sugerează o reprogramare profundă în căile metabolice, antioxidante și de sinteză a lipidelor în rinichii șoarecilor cKO. Au fost efectuate analize integrate de secvențiere profundă a transcriptomului și metabolom pentru a identifica modificări moleculare în rinichii șoarecilor cKO (GSE179202). Comparațiile dintre transcriptoame au evidențiat 1350 de transcripte exprimate diferențial în rinichii șoarecilor Ctrlm și cKOm (Figura 4A și Tabelul suplimentar 2, FDR< 5%)and="" 121="" transcripts="" differentially="" expressed="" in="" kidneys="" of="" ctrlf="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 4b="" and="" supplemental="" table="" 3,="">< 5%).="" 61="" differentially="" expressed="" transcripts="" were="" present="" in="" both="" sexes(figure="" 4c="" and="" supplemental="" figure="" 3).="" enrichment="" analysis="" of="" 100="" genes="" encoding="" proteins="" related="" to="" peroxisomal="" function(kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes="" [kegg]="" pathway="" hsa04146)performed="" on="" transcriptomes="" of="" ctrlm="" and="" ckom="" mice="" revealed="" 52="" transcripts="" either="" up-or="" downregulated="" in="" kidneys="" of="" ckom="" mice="" (figure="" 4d="" and="" supplemental="" figure="" 4).="" gene="" set="" enrichment="" analysis(gsea)="" performed="" on="" the="" kegg="" pathway="" database="" (release="" on="" december="" 11,="" 2020)showed="" downregulation="" of="" pathways="" related="" to="" the="" metabolism="" of="" pyruvate,="" glyoxylate="" and="" dicarboxylate,="" amino="" acids="" (arginine,="" proline,="" cysteine,="" methionine,="" tryptophan,="" alanine,="" and="" histidine),="" or="" glutathione(figure="" 4e="" and="" supplemental="" figure="" 5)="" and="" upregulation="" of="" pathways="" related="" to="" fatty="" acid="" synthesis="" and="" degradation,="" ppar="" signaling,="" and="" abc="" transporters="" (figure="" 4f="" and="" supplemental="" figure="" 6).="" no="" enrichment="" was="" found="" in="" pathways="" linked="" to="" inflammation="" or="" fibrosis.="" targeted="" analysis="" of="" several="" groups="" of="" functionally="" related="" genes="" that="" are="" not="" represented="" in="" kegg="" pathways="" revealed="" substantial="" changes="" in="" the="" expression="" of="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" the="" peroxisomal="" metabolism="" of="" fatty="" acids="" (acsl1/3/4/6,="" acsvl1,="" acot3/4,="" acnat1,="" acox3,="" abcd3,="" ehhadh,="" and="" acaa1b),="" plasmalogen="" biosynthesis="" (far1="" and="" agps),="" bile="" acid="" synthesis(amacr="" and="" hsd17b4),="" and="" reactive="" oxygen="" species="" (ros)="" detoxification(cat="" and="" sod1)="" (supplemental="" figure="" 3).="" alterations="" were="" also="" noted="" in="" the="" expression="" of="" a="" large="" number="" of="" genes="" critical="" for="" membrane="" transport="" processes="" in="" the="" proximal="" tubule,="" thick="" ascending="" limb="" (tal),="" and="" distal="" nephron(supplemental="" figure="" 7="" and="" supplemental="" table="" 4).="" for="" instance,="" in="" the="" proximal="" tubule,="" we="" found="" a="" reduction="" in="" the="" expression="" of="" an="" aquaporin-1="" water="" channel(agp1);="" megalin="" (lrp2);="" phosphate="" transporter="" napi-2a="" (slc34al);="" urate="" transporters="" uratl="" (slc22a12),="" npt1/4="" (sic17al/3),="" and="" oat1="" (slc22a6);="" and="" numerous="" other="" organic="" anion="" and="" amino="" acid="" transporters.="" in="" the="" tal="" and="" distal="" nephron,="" there="" was="" a="" substantial="" increase="" in="" the="" expression="" of="" genes="" encoding="" proteins="" involved="" in="" sodium="" reabsorption:="" nkcc2="" (slc12a1),="" clc-kb="" (clcnkb),="" βenac="" (scnn1b)=""><0.05), and="" ncc="" (slc12a3)(fdr="">

<0.05. (d)="" enrichment="" analysis="" of="" a="" homemade="" gene="" set="" (based="" on="" the="" kegg="" pathway="" mmu04146)="" targeting="" 100="" transcripts="" related="" to="" peroxisomal="" functions,="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" scatter="" plot="" of="" the="" top="" 25="" most="" downregulated="" (e)="" or="" upregulated="" (f)="" metabolic="" pathways="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice,="" based="" on="" an="" untargeted="" gsea="" using="" a="" database="" of="" 543="" kegg="" metabolic="" pathways.="" pathways="" are="" sorted="" by="" their="" absolute="" normalized="" enrichment="" score.="" a="" significant="" pathway="" regulation="" can="" be="" considered="" when="" adjusted="" p="" value="" referred="" to="" as="" "q="" value"="" is=""><0.2" alt="Figure 4. Transcriptional reprogramming in the kidneys of cKO mice. (A and B) Volcano plot representing the relative transcriptional expression of all renal transcripts in cKOm versus Ctrlm (A) or cKOf versus Ctrlf (B). Transcripts depicted in blue are significantly downregulated while transcripts depicted in red are significantly upregulated. (C) Venn diagrams showing the number of transcripts significantly downregulated or upregulated in cKOm (in blue) or cKOf (in pink) mice versus Ctrl mice of the same sex. A significant transcript regulation is considered when the adjusted P value referred to as " fdr"="" is=""><0.05. (d)="" enrichment="" analysis="" of="" a="" homemade="" gene="" set="" (based="" on="" the="" kegg="" pathway="" mmu04146)="" targeting="" 100="" transcripts="" related="" to="" peroxisomal="" functions,="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" scatter="" plot="" of="" the="" top="" 25="" most="" downregulated="" (e)="" or="" upregulated="" (f)="" metabolic="" pathways="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice,="" based="" on="" an="" untargeted="" gsea="" using="" a="" database="" of="" 543="" kegg="" metabolic="" pathways.="" pathways="" are="" sorted="" by="" their="" absolute="" normalized="" enrichment="" score.="" a="" significant="" pathway="" regulation="" can="" be="" considered="" when="" adjusted="" p="" value="" referred="" to="" as="" "q="" value"="" is=""><0.2" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Din totalul de 852 de metaboliți detectați, 207 au prezentat abundență diferențială în rinichii șoarecilor Ctrlm și cKOm, iar 118 au arătat abundență diferențială în rinichii șoarecilor Ctrlf și cKOf (Tabelul suplimentar 5, FDR<5%). seventy-nine="" metabolites="" demonstrating="" differential="" abundance="" were="" common="" in="" both="" comparisons(figure="" 5a="" and="" supplemental="" table="" 6).among="" metabolites="" showing="" the="" most="" significant="" differences="" were="" plasmalogens="" and="" sphingomyelins(decreased="" abundance)and="" glutathione-related="" metabolites="" and="" dicarboxylic="" acids="" (increased="" abundance)="" in="" kidneys="" of="" both="" ckom="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 5b="" and="" supplemental="" figure="" 8,="" respectively).="" global="" analysis="" of="" metabolome="" confirmed="" that="" plasmalogens="" and="" sphingomyelins="" constituted="" a="" majority="" of="" metabolites="" showing="" a="" decreased="" abundance="" in="" kidneys="" of="" both="" ckom="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 5c).lcfa="" dicarboxylates,="" very="" long-chain="" fatty="" acyl-carnitines,="" phosphatidylcholines,="" and="" phosphatidylethanolamines="" were="" present="" among="" metabolites="" with="" increased="" abundance,="" in="" addition="" to="" glutathione-related="" metabolites="" and="" dicarboxylic="" acids(figure="">

<0.05. metabolites="" are="" identified="" by="" their="" biochemical="" name="" and="" sorted="" by="" related="" metabolisms="" and="" subclasses="" of="" metabolites.="" for="" each="" metabolite,="" the="" individual="" expression="" of="" 6="" ctrl="" and="" 6="" cko="" mice="" normalized="" between="" 0="" and="" 1="" and="" the="" log2="" -transformed="" mean="" fold="" change="" of="" expression="" (log2fc)="" in="" cko="" versus="" ctrl="" mice="" are="" given,="" for="" both="" sexes.="" for="" calculation="" of="" the="" mean="" fc="" of="" expression,="" missing="" values="" (depicted="" in="" gray)="" have="" been="" replaced="" by="" the="" minimum="" value="" of="" both="" genotypes="" from="" the="" same="" sex."="" alt="Figure 5. Remodeling of the renal metabolome in cKO mice. (A) Venn diagrams representing the number of detected renal metabolites showing a significantly decreased or increased abundance in cKOm (in blue) or cKOf (in pink) mice versus Ctrl mice of the same sex. (B) Volcano plot representing the relative abundance of all detected metabolites in kidneys of cKOm versus Ctrlm. Metabolites depicted with blue dots are significantly less abundant, and transcripts depicted with red dots are significantly more abundant in kidneys of cKOm mice as compared with Ctrlm mice. The names of some representative metabolites are depicted using colors shared for related metabolites. (C and D) Heatmaps of metabolites showing a significantly decreased (C) or increased (D) abundance in cKO mice of both sexes as compared with Ctrl mice. A significant difference of abundance is considered when adjusted P value from a 2-way ANOVA referred to as " fdr"="" is=""><0.05. metabolites="" are="" identified="" by="" their="" biochemical="" name="" and="" sorted="" by="" related="" metabolisms="" and="" subclasses="" of="" metabolites.="" for="" each="" metabolite,="" the="" individual="" expression="" of="" 6="" ctrl="" and="" 6="" cko="" mice="" normalized="" between="" 0="" and="" 1="" and="" the="" log2="" -transformed="" mean="" fold="" change="" of="" expression="" (log2fc)="" in="" cko="" versus="" ctrl="" mice="" are="" given,="" for="" both="" sexes.="" for="" calculation="" of="" the="" mean="" fc="" of="" expression,="" missing="" values="" (depicted="" in="" gray)="" have="" been="" replaced="" by="" the="" minimum="" value="" of="" both="" genotypes="" from="" the="" same="" sex."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Analiza căilor articulare (MetaboAnalyst 5.0) a transcrierilor și metaboliților care prezintă o abundență crescută sau scăzută în rinichii șoarecilor cKOm în comparație cu șoarecii Ctrl au identificat 22 de căi reglate în jos și 7 căi reglate în sus (Figura 6, A și, respectiv, B; FDR<0.1; supplemental="" table="" 7).="" nitrogen="" metabolism,="" pyruvate="" metabolism,="" glycolysis,="" and="" gluconeogenesis="" were="" identified="" among="" the="" downregulated="" pathways="" while="" fatty="" acid="" degradation="" was="" identified="" among="" the="" upregulated="" pathways="" (figure="" 6,="" a="" and="" b,="" respectively).="" glutathione="" metabolism="" and="" retinol="" metabolism="" were="" present="" among="" both="" up-and="" downregulated="" pathways="" (figure="" 6,="" a="" and="" b).="" detailed="" analysis="" of="" transcripts="" and="" metabolites="" related="" to="" glutathione="" metabolism="" identified="" 16="" transcripts="" and="" 3="" metabolites="" with="" decreased="" abundance="" in="" kidneys="" of="" ckom="" mice="" (figure="" 6,="" c="" and="" d,="" respectively),="" along="" with="" 6="" transcripts="" and="" 8="" metabolites="" exhibiting="" increased="" abundance(figure="" 6,="" e="" and="" f,="" respectively).="" the="" oxidized="" form="" of="" glutathione(gssg)was="" present="" in="" ckom="" but="" not="" in="" ctrlm="" mice,="" thereby="" suggesting="" oxidative="" stress="" in="" ckom="" mice(figure="">

<0.1. the="" size="" of="" each="" dot="" depends="" on="" the="" percentage="" of="" all="" transcripts="" and="" metabolites="" ("compounds")="" of="" the="" pathway="" that="" are="" significantly="" affected="" in="" ckom="" mice.="" (c="" and="" d)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (c)="" and="" metabolites="" (d)="" significantly="" less="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (e)="" and="" metabolites="" (f)="" significantly="" more="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" individual="" values="" from="" 6="" ckom="" and="" 6="" ctrlm="" mice="" are="" depicted="" after="" transformation="" from="" raw="" individual="" data:="" values="" of="" metabolite="" abundance="" have="" been="" divided="" by="" the="" median="" value="" of="" both="" genotypes,="" while="" values="" of="" transcript="" expression="" from="" both="" genotypes="" have="" been="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" box="" and="" whiskers="" represent="" the="" mean="" and="" the="" sem,="" respectively.="" nd,="" not="" detected."="" alt="Figure 6. Joint analysis of transcriptional and metabolic changes in cKOm mice. (A and B) Scatter plot of significantly downregulated (A) or upregulated (B) metabolic pathways, based on a joint pathway analysis of both regulated transcripts and modulated metabolites in kidneys of cKOm versus Ctrlm mice. Pathways are sorted by their absolute impact, and a significant pathway regulation is considered when adjusted P value referred to as " fdr"="" is=""><0.1. the="" size="" of="" each="" dot="" depends="" on="" the="" percentage="" of="" all="" transcripts="" and="" metabolites="" ("compounds")="" of="" the="" pathway="" that="" are="" significantly="" affected="" in="" ckom="" mice.="" (c="" and="" d)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (c)="" and="" metabolites="" (d)="" significantly="" less="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (e)="" and="" metabolites="" (f)="" significantly="" more="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" individual="" values="" from="" 6="" ckom="" and="" 6="" ctrlm="" mice="" are="" depicted="" after="" transformation="" from="" raw="" individual="" data:="" values="" of="" metabolite="" abundance="" have="" been="" divided="" by="" the="" median="" value="" of="" both="" genotypes,="" while="" values="" of="" transcript="" expression="" from="" both="" genotypes="" have="" been="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" box="" and="" whiskers="" represent="" the="" mean="" and="" the="" sem,="" respectively.="" nd,="" not="" detected."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Provocarea hrănirii bogate în grăsimi nu duce la stres oxidativ suplimentar la ckKOmice. Modificări ale căilor legate de glutation, epuizarea plasmalogenilor și scăderea expresiei catalazei au sugerat stresul oxidativ și/sau rearanjarea diferitelor sisteme de apărare antioxidantă în rinichii șoarecilor cKOm. Pentru a testa aceste ipoteze, am provocat șoarecii cKOm cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) timp de 4 săptămâni. Această provocare nu a dus la albuminurie, ci a crescut volumul urinar și excreția urinară de calciu și urat. Nu a fost observată nicio diferență în parametrii plasmatici testați, inclusiv calcemia și uricemia (Tabelul suplimentar 8). Nu au fost detectate modificări morfologice brute sau acumulare de lipide în rinichii șoarecilor Ctrlm și cKOm provocați de HFD (Figura 7A). Capacitatea antioxidantă totală și neenzimatică, așa cum a fost evaluată prin testul Trolox (Figura 7B), precum și nivelurile tisulare de malondialdehidă, un marker al peroxidării acizilor grași polinesaturați (Figura 7C), nu au fost diferite între tratamente și genotipuri. Abundența produsului de peroxidare a lipidelor 4-hidroxinonenal (4-HNE) a fost crescută la șoarecii Ctrlm tratați cu HFD în comparație cu șoarecii Ctrl din dieta de control, dar nu s-a observat nicio diferență la șoarecii cKOm tratați cu 2 diete (Figura 7D).