Capitolul 2: Compuși care vizează OSBPL7 Crește ABCA1- Efluxul de colesterol dependent de conservare a funcției renale în două modele de boală de rinichi

Pentru mai multe informatii. a lua legaturatina.xiang@wecistanche.com

Discuţie

Prezentul studiu descrie identificarea unei clase de compuși prin descoperirea fenotipică a medicamentelor (PDD) care reglează efluxul de colesterol dependent de ABCA{0}}. Deconvoluția țintei a arătat că OSBPL7 este ținta moleculară. În modelele animale de boală renală, acești compuși au redus acumularea de lipide renale, au prevenit pierderea podocitelor, au normalizat proteinuria și au redus declinul funcției renale.

Terapii curente pentru croniciboală de rinichisunt limitate la IECA, ARB și, mai recent, inhibitori de tip 2 ai cotransportatorului sodiu-glucoză (SLGT2i). În ciuda eficacității acestor agenți în întârzierea progresiei bolii cronice de rinichi, în primul rând la pacienții cu boală renală proteinurică, nevoia medicală nesatisfăcută în CKD rămâne imensă3,3940. Într-un studiu randomizat de 4300 de pacienți, SGLT2i s-a dovedit în mod neașteptat a fi eficient, indiferent a prezenței diabetului4, sugerând că sunt implicate mecanisme de renoprotecție, altele decât cele de scădere a glicemiei. De fapt, un studiu recent a demonstrat că SGLT2i poate crește HDL plasmatic și poate reduce acumularea de grăsime cardiacă42. Această apariție recentă a SGLT2i subliniază beneficiul țintirii mai multor mecanisme de conducere a CKD pentru a dezvolta terapii mai eficiente.

Noi și alții am descris acumularea de colesterol glomerular înboli renalecare provin atât din origini metabolice cât și nemetabolice. Acumularea de lipide glomerulare, în asociere cu scăderea efluxului de colesterol mediat de ABAl, apare în DKD7-11, FSGS12-14 și AS13. Aceste date sugerează că restabilirea funcției ABCal poate fi eficientă în tratarea acestor tipuri de boli renale. Am demonstrat recent că epuizarea colesterolului renal cu ciclodextrină sau supraexprimarea genetică ABCal protejează dedisfuncție renalăîn modelele DKD9, FSGS13,14 și ASl3. Am demonstrat, de asemenea, că deficiența ABAl specifică podocitelor agravează fenotipul renal în DKD7. Studiile cu agoniști LXR, cum ar fi T1317, au oferit, de asemenea, un sprijin puternic pentru un rol cheie al ABC Al, care a rămas o țintă terapeutică atractivă în ciuda limitării acestor agenți.

Am căutat agenți prin descoperirea fenotipică a medicamentelor și optimizarea farmaciei candidate cu molecule mici. Am identificat o serie de 5-arilnicotinamide, dintre care câțiva reprezentanți au crescut nivelurile de proteine ​​ABCa și efluxul de colesterol din celulele încărcate cu colesterol. Absența activității de eflux în fibroblaste de la un pacient cu boala Tangier și absența unei creșteri a mARN-ului ABCal, au relevat un nou mecanism de acțiune.

Eforturile de deconvoluție a țintei au identificat OSBPL7 ca o țintă cu interes ridicat. Sonda moleculară (³H-Cpd K) a legat eficient OSBPL7 în celulele vii și ar putea fi concurată eficient cu compușii nemarcați. Mai important, am demonstrat o relație corelativă „activitate-activitate” pentru un set mai mare de compuși între capacitatea lor de a crește efluxul de colesterol ABAl și capacitatea lor de a concura pentru legarea sondei la OSBPL7. Analiza mutațională, combinată cu modelarea moleculară și studiile de andocare, indică interacțiunea directă a compușilor cu buzunarul de legare a sterolului OSBPL7 prezis. În cele din urmă, studiile siRNA au confirmat implicarea OSBPL7 în funcția ABC Al.

Faceți clic pentru a afla cistanche de unde să cumpărați și pentru ce se folosește cistanche  

De asemenea, am identificat CBIR ca o țintă potențială. Mai multe rapoarte sugerează un rol pentru semnalizarea endocannabinoidului în reglarea colesterolului celular. S-a demonstrat că rimonabantul reglează în mod modest receptorul de captator B1 (SR-B1) și ABCGl, dar nu și ABC Al, în concordanță cu datele noastre45. S-a demonstrat că canabinoidul sintetic WIN55,212-2 reduce expresia ABC Al în timp ce crește receptorul de captator CD36 în macrofagele RAW264.7 încărcate cu oxLDL46. Împreună, aceste date nu susțin un rol puternic pentru CBIR în reglarea ABCA1. În studiile noastre, rimonabant și alți agoniști/antagoniști CBIR, inclusiv AM251, WIN55-212-2 și arahidonic coloretilamina (ACEA), au fost inactivi pentru a induce ABCA1 eflux de colesterol (fig. 3a, 4a).

Proteinele de legare a oxisterolului de mamifere (OSBP) au fost inițial implicate în biosinteza colesterolului și a sfingomielinei47-49. Mai multe studii au legat OSBP specifice cu reglarea stabilității proteinei ABC Al și a efluxului de colesterol mediat de ABAl50,51. Nicio dată înainte de prezentul raport nu a implicat OSBPL7 ca un organism de reglementare al ABCA1. Datele noastre sugerează că OSBPL7 poate furniza o funcție de însoțire sau de transfer de substrat care afectează ABC Al. Experimentele preliminare de co-imunoprecipitare în celulele transfectate nu au identificat o interacțiune directă între cele două proteine. Cu toate acestea, o meta-analiză a studiilor de asociere la nivelul genomului (GWAS) a identificat OSBPL7 printre 60 de loci genetici care influențează nivelurile de colesterol plasmatic la oameni.

Interesul nostru pe termen lung pentru rolul ABC Al în bolile renale ne-a determinat să evaluăm modelele 5-arilnicotinimidelor in vitro și in vivo ale bolii renale. Am descoperit că OSBPL7 este exprimat în rinichi, inclusiv în glomeruli și podocite și că Cpd A și Cpd G reglează în sens pozitiv efluxul de colesterol mediat de apo Al din podocitele încărcate cu colesterol. Cpd A și Cpd G promovează o creștere a ABCa la nivelul membranei plasmatice fără a afecta expresia ARNm. Acest mecanism contrastează cu agoniştii LXR, care reglează ARNm ABAl conducând la o creştere a ABC Al atât în ​​membranele plasmatice, cât şi în cele intracelulare. Am evaluat eficacitatea terapeutică a Cpd A și Cpd G in vivo într-un model de șoarece de FSGS (nefropatie indusă de ADR). S-a constatat că ambii agenți reduc conținutul de colesterol renal, corelând cu proteinurie redusă, pierdere în greutate și modificări patologice renale. Cpd G a fost foarte eficient pentru a preveni pierderea podocitelor induse de ADR și modificările structurale glomerulare. Reducerea semnificativă a ABCal în rinichi, însoțită de o creștere ainflamatorproteine, a fost prevenit de Cpd G, susținând un rol cheie pentru ABCA1. Cpd G a redus în mod eficient albuminuria, BUN și nivelurile de creatinine serice la șoarecii AS. Mai important, Cpd G a prelungit durata de viață la animalele mai în vârstă Col4a3 cu insuficiență renală avansată.

Aceste date susțin potențialul terapeutic al compușilor care vizează ABCAl și sugerează cu tărie că acest nou mod de acțiune va oferi o eficacitate suplimentară sau complementară medicamentelor care vizează RAAS, SGLT2, NRF2 și sinteza sau absorbția colesterolului. În special, spre deosebire de efectul Cpd G, blocarea RAAS nu prelungește durata de viață la șoarecii Col4a3 mai în vârstă, în ciuda faptului că este cea mai eficientă terapie pentru intervenția timpurie în acest model53,54. Activitatea antiproteinurică a Cpd G a fost superioară efectelor ramiprilului pe care le-am raportat anterior într-un model singeneic al AS38. Prin urmare, Cpd G poate viza mai bine populația de pacienți cu SA și proteinurie în comparație cu bardoxolona, ​​un agonist NRF-2 despre care s-a demonstrat că crește RFG, dar nu a avut niciun efect asupra proteinuriei, cel mai puternic predictor al 10- an Risc IRST în populația generală55,56. Statinele s-au dovedit a fi protectoare în AS57 experimental și sunt recomandate la toți pacienții cu BRC pentru a reduce riscul cardiovascular, dar s-au dovedit ineficiente pentru a încetini progresia bolii renale 8. În cele din urmă, am raportat recent un potențial beneficiu al ezetimibului în SA prin reducerea absorbția acizilor grași și a trigliceridelor. Cu toate acestea, ezetimibul nu a afectat conținutul de colesterol din rinichi, iar eficacitatea acestuia de a îmbunătăți RFG și de a reduce proteinuria a fost inferioară efectelor pe care le raportăm aici pentru Cpd G.

În rezumat, prezentul raport descrie identificarea prin descoperirea fenotipică a medicamentelor a moleculelor mici asemănătoare medicamentelor de primă clasă care induc efluxul de colesterol mediat de ABAl. Biologia chimică a identificat OSBPL7 ca țintă moleculară și a demonstrat că moleculele interacționează intim în domeniul său de legare a oxisterolului prezis. Din cunoștințele noastre, acesta este unul dintre doar câteva exemple de compuși asemănătoare medicamentelor descoperiți inițial prin abordări fenotipice, a căror țintă a fost ulterior identificată cu succes44. Compușii G și A au fost foarte eficienți pentru a îmbunătăți funcția renală la modelele de șoarece care reflectă două etiologii diverse ale bolii renale progresive. Ele par a fi sigure și bine tolerate, așa cum se reflectă în capacitatea lor de a reduce nivelurile AST la șoarecii cu ADR provocați și, mai convingător, de a prelungi durata de viață a șoarecilor Col4A3 KO. Acești compuși pot oferi o potențială nouă terapie pentru boala renală prin țintirea metabolismului colesterolului celular printr-un nou mod de acțiune. Acești agenți, împreună cu medicamentele actuale care vizează tensiunea arterială sau controlul glucozei, pot aborda nevoia semnificativă nesatisfăcută în CKD.

Metode

Compuși. Compușii utilizați în acest studiu sunt rezumați în Tabelul suplimentar 5 și au fost sintetizați la F.Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Elveția, dacă nu se indică altfel. Pentru experimentele in vitro, compușii liofilizați au fost reconstituiți în DMSO (Sigma) și alicote au fost depozitate la grade -20. Pentru experimentele in vivo, compușii liofilizați au fost resuspendați în vehicule care conțineau 1,25% hidroxipropil metilceluloză,0,10 procente sare de sodiu docusat,0,18% propilparaben de sodiu și 0,02% acid citric monohidrat, la pH 6. O suspensie de particule fine a fost generată prin trei sonicări scurte cu puls efectuate pe gheață.

Proceduri de chimie sintetică și date analitice. Vă rugăm să consultați fișierul Date suplimentare 1.

Biologie chimică/screening ținta candidată Pe scurt, o plasmidă care exprimă o țintă candidată de interes fuzionată cu o etichetă FLAG a fost transfectată în celule HEK293. După 24 de ore, s-a adăugat compusul K tritiat la o concentrație capabilă să inducă efluxul de colesterol mediat de ABCA1-(1.0 μM) timp de 3 ore, apoi celulele vii au fost expuse la lumină UV (K{{{ 7}} nm) pentru a interoga reticulare potențială compus/țintă in situ. Lizatele celulare au fost preparate, proteina exprimată a fost apoi imunoprecipitată selectiv folosind un anticorp anti-FLAG cuplat cu perle de sepharoză, proteinele legate au fost separate prin SDS-PAGE și două pete identice au fost preparate și testate prin Western blot și prin autoradiografie pentru a detecta expresia proteinei. şi respectiv prezenţa sau absenţa reticularii compusului. Diagrama de flux a acestui ecran este ilustrată în Fig. 2. Figura 2d ilustrează capacitatea Cpd A și Cpd G de a înlocui Cpd K tritiat din OSBPL7 supraexprimat și imuno-precipitat. Figura 3b ilustrează utilizarea acestui test pentru a detecta legarea Cpd K tritiată la variantele supraexprimate și imunoprecipitate ale OSBPL7 care conțin mutații punctuale în buzunarul de legare a oxisterolului prezis al OSBPL7. Avantajele acestei metode sunt i. utilizarea transfectării plasmidei conduce la o expresie ridicată a fiecărui candidat, ceea ce reduce probabilitatea de a rata o țintă autentică pentru cele care pot fi exprimate la niveluri endogene scăzute, iii. interacțiunea sondei chimice cu ținta sa are loc într-un context biologic relevant (celule vii) la o concentrație activă farmacologic și iii. imunoprecipitarea permite ca proteina de interes exprimată să fie purificată din proteinele de fond, îmbunătățind substanțial raportul semnal/zgomot.

Cultură de celule. Liniile celulare au fost achiziționate de la ATCC și subcultivate pentru cel mult pasajul 15, cu excepția podocitelor umane, care au fost inițial de la Dr. Jochen Reiser. Podocitele umane imortalizate condiționat au fost cultivate în condiții permisive la 33 de grade, în mediu RPMI (Corning) care conține 10 la sută FBS (GIBCO), 1 la sută penicilină/streptomicina,0.01. mg/ml insulină umană recombinantă, 0,0055 mg/ml transferină umană (în mod substanțial fără fier) ​​și 0,005 ug/ml selenit de sodiu (ITS, Corning). Pentru a induce diferențierea, podocitele au fost cultivate la 37 de grade timp de 14 zile într-un mediu RPMI care conține 10% FBS (GIBCO) și 1% penicilină/streptomicină. Podocitele diferențiate au fost înfometate în RPMI-0.2% FBS timp de 18 ore și apoi tratate cu 1 uM, 5 uM și 10 uM de compuși proaspăt preparați în DMSO timp de 18 ore la 37 de grade, așa cum este indicat.

Efluxul de colesterol în macrofage și fibroblaste. Capacitatea compuşilor de a induce efluxul de colesterol mediat de ABAl a fost determinată în culturi replicate de celule THP1 sau fibroblaste în microplăci 96-godeuri. Celulele au fost placate la o densitate de 150,000 celule/godeu. Monocitele THP1 au fost diferențiate de macrofage prin adăugarea de PMA (100 nM) timp de 72 de ore într-un mediu RPMI care conține 10% ser fetal bovin și 3 pl de 2-mercaptoetanol. Celulele au fost spălate o dată cu RPMI-1640 și apoi încărcate cu 50 ug/ml LDL acetilat și 10μCi/ml 【' H】-colesterol în mediu RPMI-1640 care conține 2% FCS, timp de 48 de ore la 37 de grade . După încărcare, celulele au fost spălate o dată cu RPMI-1640 și incubate cu compușii de testat pentru încă 24 de ore în mediu RPMI-1640 care conține 1 mg/ml albumină serică bovină liberă de acid gras (BSA). Celulele au fost apoi spălate o dată, iar efluxul de colesterol a fost indus prin adăugarea a 10 ug/ml de apoAI uman sau a 30 ug/ml de HDL2, HDL3 sau LDL în RPMI-1640 care conține 1 mg/ml BSA pentru o perioadă suplimentară. 6h. Radioactivitatea în supernatanții culturii a fost determinată prin numărare prin scintilație. Efluxul de colesterol a fost exprimat ca valoare relativă față de martorii incubați în absența acceptoarelor de colesterol. Curbele doză-răspuns au fost calculate utilizând XLfit3 (ID Business Solutions Ltd. UK).

Efluxul de colesterol în podocite. Podocitele umane diferențiate timp de 13 zile au fost marcate timp de 24 de ore la 37 de grade în mediu RPMI care conține 2 procente FBS și [PH]-colesterol (1 uCi/ml, American Radiolabeled Chemicals). Celulele au fost apoi spălate de 3 ori cu PBS și incubate cu RPMI suplimentat cu 0,2% BSA fără grăsimi (Sigma) cu sau fără compuși timp de 18-h la 37 de grade. Compușii au fost utilizați la următoarele concentrații∶ Cpd C (1 μM), Cpd A (1 μM, 5 uM) și Cpd G (l uM, 5 uM, 10 μM). După incubarea de 18-h, apoAI uman (Calbiochem) a fost adăugat în mediu (concentrație finală de 2{0 ug/mL) și celulele au fost incubate încă 18 ore la 37 de grade. Alicote de mediu colectate înainte de (T =0h) și după (T=18h) adăugarea de apoAI au fost centrifugate la 12,{00xg timp de 5 minute și radioactivitatea în supernatant a fost numărat prin scintilație lichidă. Celulele au fost apoi spălate cu PBS, lizate 0,1% SDS, 0,1 M NaOH și radioactivitatea din lizate a fost cuantificată prin scintilație lichidă. Fluxul de colesterol mediat de apo Al, exprimat în procente, a fost calculat ca cantitatea de etichetă eliberată în mediu după adăugarea apo Al (diferența de radioactivitate în mediu înainte și după adăugarea ApoA1) împărțită la cantitatea de etichetă totală din fiecare godeu (radioactivitate eliberată în medii plus radioactivitate în celulele lizate).

studii siRNA. Pool-urile siRNA specifice pentru OSBPL7 uman, CBIR uman și controlul negativ siRNA non-țintă sunt rezumate în Tabelul suplimentar 6. Monocitele THPI au fost însămânțate la o densitate de 80,000 celule/godeu în {{4} }plăci de godeuri și diferențiate cu PMA așa cum este descris mai sus. După 72 de ore, mediul a fost înlocuit cu 50 ul de mediu proaspăt per godeu. Celulele au fost apoi transfectate folosind reactiv Viromer Blue (Origene) urmând instrucțiunile producătorului. Pe scurt, 10 ul de siARN (5 μM) au fost amestecați cu 90 ul de Viromer Blue (diluat 1% v/v în tamponul furnizat). După 15 minute de incubare, complexele reactiv de transfecție siARN au fost diluate la 1:6,5 în mediu proaspăt și adăugate la un volum de 50 ul per godeu. După 24 de ore, celulele au fost apoi încărcate cu colesterol prin incubare cu LDL acetilat (25 ug/ml) în mediu RPMI, 1% FBS, 100 nM PMA, 2 μCi H-colesterol timp de 24 de ore. Un set de godeuri care conțin celule transfectate a fost pus deoparte pentru a verifica eficiența transfecției prin RT-PCR. Macrofagele încărcate cu colesterol au fost apoi incubate în prezența Cpd G5 uM sau vehicul (0,1 la sută DMSO) în mediu RPMI care roșu fenol, 0,2 la sută BSA) pentru încă 24 de ore. Fluxul de colesterol a fost apoi măsurat așa cum este descris mai sus.

RT-PCR. ARN-ul a fost izolat folosind kitul RNEasy Plus Mini (Qiagen). Transcripția inversă a fost efectuată folosind qScript cDNA SuperMix(Quantabio) conform instrucțiunilor producătorului. PCR cantitativă în timp real a fost efectuată folosind TaqMan Fast Universal PCR Master Mix și testele de exprimare a genei Taqman (Tabelul suplimentar 7).

Western blot. Lizatele sau fracțiile celulare au fost incubate în tampon Laemmli la 55 de grade timp de 10 minute în condiții reducătoare. Un total de 30 ug de proteină din lizatele celulare sau o treime din volumul colectat în preparatele cu fracțiuni celulare au fost separate prin SDS-PAGE în geluri cu gradient de 4-20 procente (Biorad) și proteinele au fost apoi transferate pe membranele PVDF. După blocare cu 5% TBS-lapte, membranele au fost testate cu anticorpi primari peste noapte la 4 grade. Au fost utilizați următorii anticorpi primari: anti-ABCA1 de șoarece (Abcam; 1:1000), anticorp anti-GAPDH de iepure (Milli-pore; 1:10,000), anti-actină de șoarece ( CP01,Millipore 10,000),anti-MEK, anti-ERp72, anti-V5 și anti-Na plus /K plus ATPaza (semnalizare celulară; toate 1:100) și anti-OSBPL7 de iepure (Sigma) ; 1:1000). După spălare, membranele au fost incubate cu anticorpi IgG-HRP anti-iepure sau anti-șoarece (Promega, 1:10,00). Semnalele au fost detectate după incubare cu substrat Westernbright ECL HRP (Advansta), iar semnalele de luminiscență au fost capturate cu stația de lucru Azure C600 Gel Imaging (Azure Biosystems Inc, SUA) sau filme cu raze X.

Fracționarea celulară. Podocitele diferențiate au fost tratate cu compuși Cpd C (l μM), Cpd A (5 μM) sau Cpd G (10 μM) timp de 18 ore, spălate și apoi recoltate în PBS rece cu gheață. Celulele au fost centrifugate la 1000xg timp de 5 minute, supernatantul a fost îndepărtat cu grijă, iar peletul a fost resuspendat în tampon hipoton (15 mM KCl, 1,5 mM MgClz, 10 mM HEPES și I mM DTT) suplimentat cu o protează. cocktail inhibitor (Roche). Celulele au fost distruse cu un douncer de sticlă și s-a adăugat zaharoză pentru a obține o concentrație finală de 227 mM. Lizatele celulare au fost centrifugate la 1000xg timp de 30 de minute la 4 grade. Supernatantul a fost apoi transferat într-un tub nou și centrifugat la 10.000 xg timp de 15 minute la 4 grade. Peletul, care conține fracția microzomală, a fost colectat și supernatantul a fost transferat într-un tub nou și centrifugat la 100.000 xg timp de 1 oră la 4 grade. Fracția de membrană plasmatică granulată a fost colectată și supernatantul, care conține fracția citosolică fără organele, a fost concentrat în coloane de filtrare Vivaspin 500. Western blot a fost efectuat folosind anticorpi pentru ABAl și markeri specifici pentru fiecare fracțiune de membrană, așa cum este descris mai sus. Nat/K plus ATPaza a fost utilizat pentru a identifica fracția membranei plasmatice, ERp72 ca marker pentru fracția îmbogățită cu microzomi și MEK ca control pentru fracția citosolică nemembranoasă.

Co-imunoprecipitarea ABC AT. ABCA{{0}}Constructia steagului a fost oferită cu amabilitate de Dr. Michael Fitzgerald, Universitatea Harvard. Construcția OSBPL7-V5 (pcDNA3.1-V{5-ORP7) a fost achiziționată de la Addgene. Vectorii de expresie de mamifere PCMV6-AN-GFP și pCMV6-AC{-3DDK, de la Origene, au fost utilizați ca martori negativi. Celulele HEK293 au fost co-transfectate tranzitoriu cu oricare dintre următoarele combinații de plasmide:(1)ABCA1-Flag plus OSBPL7-V5;(2)ABCA1-Flag plus PCMV{{19 }}AN-GFP; sau(3) OSBPL7-V5＋pCMV6-AC{-3DDK utilizând reactivul de transfecție Fugene 6 (Promega) urmând instrucțiunile producătorului. La 48 de ore după transfecție, celulele au fost lizate cu 1 ml tampon de imunoprecipitare (1 procente Triton X-100, 50 mM Tris-Cl pH 7,0, 150 mM NaCI) suplimentat cu un cocktail inhibitor de protează (Roche). Lizatele au fost curățate prin centrifugare și cantități egale de proteine ​​totale din fiecare supernatant au fost incubate peste noapte la 4 grade cu 30 ul de gel de afinitate anti-Flag M2 (Sigma Aldrich). Granulele au fost granulate prin centrifugare și spălate de 5 ori cu 1 ml de tampon de imunoprecipitare. Proteinele imunoprecipitate au fost eluate prin incubarea granulelor cu 50 ul de tampon de probă 2x timp de 15 minute la 56 de grade. Prezența ABC A1 și OSBPL7-V5 în lizate și eluați a fost verificată prin western blot așa cum este descris mai sus.

Studii pe animale. Animalele au fost găzduite în cicluri de lumină/întuneric de 12 ore/12 ore și la temperatură controlată (18-23 grade) și umiditate (40-60 procente) într-o unitate pentru animale fără patogeni a Diviziei de Resurse Veterinare a Universității din Miami, Școala de Medicină Miller. Șoarecilor li s-a oferit o dietă standard de 18% proteine ​​pentru rozătoare și apă ad libitum. Protocolul de studiu a fost aprobat de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor (IACUC) al Universității din Miami, care este acreditat de Asociația pentru Evaluarea și Acreditarea Laboratorului Animal Care International (AAALAC). Toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu toate reglementările etice federale și de stat, inclusiv reglementările Actului privind bunăstarea animalelor (AWA) supravegheate de Departamentul pentru Agricultură al Statelor Unite (USDA) și Politica Serviciului de Sănătate Publică privind îngrijirea umană și utilizarea animalelor de laborator (PHS). Politică) administrată de National Institutes of Health (NIH), Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW). Femele de șoareci Balb/c au fost achiziționate de la Jackson Laboratories pentru studii de nefropatie indusă de adriamicină. La vârsta de 8 săptămâni, șoarecii au primit o singură doză de Adriamicină (Sigma-Aldrich, 12 mg/Kg) sau vehicul (0,9% NaCI) prin injectare în vena cozii. Șoarecii au fost separați aleatoriu în șase grupuri experimentale și, începând cu 24 de ore după injectarea ADR, au fost tratați fie cu vehicul sau cu diferite doze de compuși zilnic prin gavaj oral timp de 28 de zile. Au fost utilizate următoarele doze: Cpd C (agonist LXR) 10 mg/Kg; Cpd A 30mg/Kg; Cpd G 100mg/Kg. Toate animalele au fost sacrificate la 28 de zile după injectarea ADR. Șoarecii Col4a3 KO (tulpina Col4a3tmiDec 129X1/SvJ) au fost achiziționați de la Jackson Labs. Șoarecii au fost separați aleatoriu în 2 grupuri. Începând cu vârsta de 4 săptămâni, șoarecii au fost dozați prin gavaj oral o dată pe zi, fie cu vehicul sau Cpd G (100 mg/Kg) timp de 4 săptămâni, urmat de sacrificare la vârsta de 8 săptămâni. Un al doilea studiu a fost efectuat pe șoareci Col4a3 KO cu tratament inițiat la vârsta de 6 săptămâni. Acest studiu a fost efectuat pentru a evalua dacă tratamentul cu Cpd G al șoarecilor cu insuficiență renală stabilită ar putea întârzia boala renală în stadiu terminal și, prin urmare, poate prelungi supraviețuirea. Pentru tratamentul cu ramipril, șoarecii Col4a3 KO au început să primească ramipril la vârsta de 4 săptămâni. Ramipril a fost adăugat în apa de băut la o concentrație care ar duce la o doză de 10 mg/Kg/zi 8.

Analiza fenotipică a șoarecilor. S-au recoltat probe de urină săptămânal pe loc. Albumina urinară a fost măsurată prin ELISA (laboratoarele Bethy!) și creatinina printr-un test colorimetric (Stanbio). Albuminuria a fost exprimată ca raport albumină/creatinină. Șoarecii au fost anesteziați cu Ketamina (90 mg/Kg)/Xilazină (10mg/Kg), sângele a fost colectat în tuburi heparinizate, iar animalele au fost apoi perfuzate prin ventriculul stâng cu soluție de NaCl 0,9%. Cortexele renale au fost excizate cu grijă și separate în probe care au fost fie congelate rapid, încorporate în OCT, fie fixate în formol 10% pentru evaluările ulterioare.

Determinarea depunerilor de lipide în secțiunile cortexului renal. Probele de cortex de rinichi încorporate OCT au fost criosecționate la o grosime de 4 μm și colorate cu ulei. Soluție roșie de O-izopropanol (Electron Microscopy Science, PA) diluată 6:4 în apă și apoi contracolorată cu Hematoxilin Harris Hg Free (VWR, PA). Secțiunile au fost apoi evaluate folosind un microscop cu lumină (Olympus BX 41, Tokyo, Japonia).

Determinarea conținutului de colesterol și trigliceride. Probele de cortex de rinichi congelate rapid au fost omogenizate în tampon fosfat de potasiu 2 mM, pH 7, (1{{1{0}} pul tampon/mg țesut) folosind un douncer de sticlă pe gheață. 1{00 ul de omogenat s-au amestecat bine cu 1 ml de hexan: izopropanol (3:2;vv) per volum de omogenat de țesut Fazele apoase (pelete) și organice (supernet) au fost separate prin centrifugare la 12,000× g timp de 5 min. Pelete (fază apoasă) au fost uscate și reconstituite în 8 M uree, 0,1% SDS, 0,1 M NaOH, iar proteinele totale au fost cuantificate prin metoda BCA (Thermofisher) Faza organică a fost uscată prin expunere la azot. Lipidele au fost apoi reconstituite în 100 ul de izopropanol∶NP-40 (9:1;vv). Conținutul de trigliceride a fost testat folosind un kit colorimetric conform instrucțiunilor producătorului (Cayman Chemical USA). Colesterolul total și conținutul de CE au fost analizate folosind o metodă fluorometrică enzimatică 59. Pentru măsurarea colesterolului total, extractele au fost diluate 1:100 în tampon de testare (fosfat de potasiu 100 mM). e,50mM NAC,5mM acid colic,0,1% Triton X-10,pH 7,4)conținând colesterol oxidază (1 U/ml), colesterol esterază (1 U/ml), peroxidază de hrean (1 U/ml), și Amplex Red（75 μM）. Reacțiile au fost incubate la 37 de grade timp de 30 de minute într-o placă neagră opac 96-godeuri (Greiner) și fluorescența a fost măsurată într-un cititor de microplăci (Spectramax i3X, Molecular Devices) la 530 nm de excitare și 580 de emisii.

Pentru determinarea CE, 150 ul de tampon de testare descris mai sus, suplimentat cu catalază hepatică bovină (45 U/ml) și colesterol oxidază (1 U/ml), s-au adăugat la 25 ul de probă și s-au incubat peste noapte la 37 de grade pentru a se epuiza. colesterolul lăsând doar esteri de colesterol. Apoi, s-au adăugat 75 ul de reactiv de detectare a esterului de colesterol (1 U/ml colesterol oxidază, 4 U/ml colesterol esterază, 24 U/ml peroxidază de hrean, 300 μM Amplex Red). Reacția a fost incubată la 37 de grade timp de 30 de minute și semnalul de fluorescență a fost măsurat așa cum este descris mai sus Standardele interne au inclus eșantioane care conțineau 1 mM de colesterol și 5 uM de oleat de colesterol pentru a verifica caracterul complet al descompunerii enzimatice a colesterolului liber, precum și sensibilitatea și specificitatea testului.

Evaluarea histologică. Secțiunile de cortex renală încorporate în parafină fixate cu formalină, de 4 um grosime, au fost colorate cu acid periodic Schiff (PAS). Lamele au fost analizate de un patolog renal într-un design dublu-orb. Scleroza glomerulară (glomerală și segmentară), hipertrofia podocitelor și hiperplazia podocitelor au fost exprimate ca procent de glomeruli găsite cu aceste anomalii. Microchisturile tubulare și inflamația interstițială au fost evaluate pe o scară 0-4 unde 0=0 procente ,05=1-10 procente ,1=11-25 procente ,2:26-50 procente ,3:{{ 12}} la sută și 4=mai mult de 75 la sută daune. Expansiunea mezangială a fost punctată pe baza analizei semicantitative (scara 0-5) sau procentaj de glomeruli care prezintă expansiune mezangială (procent).

Microscopie cu imunofluorescență. Pentru detectarea expresiei ABC Al, secțiunile de cortex de rinichi de parafină de 4 um au fost deparafinizate și rehidratate. Antigenele au fost recuperate prin fierbere timp de 30 min în tampon citrat pH 6.0(Soluție de recuperare țintă, Citrat pH 6, Sigma, SUA). Secțiunile au fost permeabilizate timp de 30 de minute cu 0,1% Triton X-100 în TBS. Secțiunile de țesut au fost incubate cu 10% ser de capră (cat #G9023, Millipore Sigma) și 1% BSA (cat# SP-5050-500, Vector, SUA) în TBS-T timp de 1 oră la temperatura camerei pentru a bloca orice nespecific legare. Probele au fost apoi incubate peste noapte la 4 grade cu anticorpi anti-ABCAL de șobolan (Novus, 1:200) și anticorpi de iepure anti-WI1 (Abcam, 1:200) într-o cameră umidificată. După spălare extensivă, probele au fost apoi incubate timp de 1 h la RT cu anticorpi secundari conjugați cu fluorocrom (Invitrogen, 1:500). Mediul de montare antidecolorare care conține DAPI (Vectashield Plus) a fost adăugat la secțiuni înainte de a fi analizat

Imaginile au fost obținute utilizând un microscop confocal FluoView FV1000 (Olympus) cu o lentilă obiectiv cu ulei x63 în diferite planuri folosind un model din seria Z cu o dimensiune a pasului de 0,18 um. În timpul analizei, avioanele individuale au fost deconvolute și stivuite pentru a produce o imagine proiectată maximă folosind software-ul de vizualizare gripă versiunea 4.3b (Olympus). Au fost capturate minimum 5 imagini din 5 câmpuri diferite per probă. Cuantificarea intensității medii a fluorescenței glomerulare (MFI) ABCAl a fost realizată folosind software-ul Fiji-ImageJ.

Pentru detectarea OSBPL7,4 um secțiuni de cortex renal înghețat încorporate în OCT, au fost fixate cu PFA-zaharoză (2% ,4%) în PBS timp de 20min la RT și permeabilizate cu 0,3% Triton-PBS pentru 15 min și blocat cu tampon de blocare (5 procente FBS în PBS) timp de 1 oră. Secțiuni de țesut au fost apoi incubate cu anticorpi de iepure anti-OSBPL7 (Sigma, 1:50) și capră anti-Synaptopodin (Santa Cruz, 1:800) într-o cameră umidificată peste noapte la 4 grade. După spălare extensivă, probele au fost apoi incubate cu anticorpi secundari conjugați cu fluorocrom și acoperite cu mediu de montare așa cum este descris mai sus. Imaginile au fost capturate folosind un microscop fluorescent Leica DMI 6000B.

analize statistice. GraphPad Prism ver 6 sau 7 a fost folosit pentru a efectua toate analizele statistice. Grupurile au fost comparate folosind un test t cu două cozi sau ANOVA unidirecțional urmat de testul lui Dunnett sau Tukey. Testul F, Brown-Forsythe sau Bartlett a fost folosit pentru a determina variațiile semnificative între grupuri, dacă P<0.05, then="" groups="" were="" compared="" using="" two-tailed="" mann-whitney,="" or="" kruskal-wallis="" followed="" by="" dunn's="" tests.="" the="" correlation="" between="" albuminuria="" and="" accumulation="" of="" cholesterol="" ester="" in="" kidney="" cortexes="" was="" assessed="" using="" the="" spearman="" coefficient="" test.="" p=""><0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" only="" data="" from="" independent="" experiments="" were="">

Toate animalele au fost repartizate aleatoriu în grupuri de tratament.