Caracterizarea riscului de respingere a rinichilor pre-transplant și post-transplant prin secvențierea repertoriului imun al celulelor B

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Studierea repertoriului imunitar în contextul transplantului de organe oferă informații importante despre modul în care imunitatea adaptivă poate contribui și modula respingerea grefei. Aici caracterizăm repertoriul imunitar din sângele periferic al indivizilor înainte și dupărinichitransplant folosind secvențierea receptorilor de celule B într-un studiu clinic longitudinal. Persoanele care dezvoltă respingere după transplant au un repertoriu imunitar mai divers înainte de transplant, ceea ce sugerează o predispoziție pentru riscul de respingere post-transplant. În plus, pe parcursul a 2 ani de urmărire, pacienții care dezvoltă respingere demonstrează un set specific de clone extinse care persistă după respingere. Deși există o reducere generală a diversității celulelor B periferice, probabil din cauza expunerii crescute la imunosupresie generală în această cohortă, detectarea utilizării specifice a genei IGHV la toți pacienții care resping susține faptul că un grup comun de antigene imunogene poate determina respingerea post-transplant. Descoperirile noastre pot avea implicații clinice pentru predicția și managementul clinic al respingerii transplantului de rinichi.

Rinichitransplantul este tratamentul preferat al bolii renale în stadiu terminal (IRST) și cronicerinichiboala. Chiar dacă au existat îmbunătățiri semnificative în tehnologiile și potrivirea țesuturilor bazate pe testarea histocompatibilității pentru antigenele leucocitare umane donator/recipient (HLA)l, predicția rezultatului grefei este încă o problemă nerezolvată. Nepotrivirea țesutului măsurat la alți loci23 minori, non-HLA, poate provoca, de asemenea, leziuni aloimune cu respingere acută și cronică, ducând la rezultate slabe ale grefei pe termen lung4. Mai mult, în jur de 50 la sută dinrinichialogrefele, fără nepotriviri majore HLA, sunt încă pierdute în decurs de 10 ani de la transplant². Am emis anterior ipoteza că locii non-HLA pot influența răspunsul imun al primitorului împotriva acestuia.rinichidonor graft6. More research needs to be done to better understand and predict the recipient's risk of rejection to substantially improve long-term patient and graft outcomes. Nevertheless, the diversity of the immune response to various immunogenic epi-topes is as yet, poorly understood. The role of T cells in organ transplant rejection has been demonstrated, but there is increasing appreciation of the additional role of B cells and antibodies in triggering this process8. In this regard, B-cell receptor sequencing(BCRSeq)is a promising high-throughput technique that allows the sequencing of millions of Immunoglobulin (Ig)regions in parallel to study the immune response. The key feature of B cells is their enormous diversity. Each individual is capable of producing >1013 anticorpi diferiți0, ceea ce le permite să recunoască o gamă largă de antigeni străini. BCR-urile umane sau Ig constau din două lanțuri grele (I) identice formate din cinci izotipuri: IgM, IgD, IgA, IgE și IgG și două lanțuri ușoare. Anticorpul intact conține un domeniu variabil și unul constant. Legarea antigenului are loc în domeniul variabil, care este generat prin recombinarea unui set de segmente de genă variabilă (V), diversitate (D) și unirea (J) care formează repertoriul imunitar al celulelor B, iar diversitatea sa este concentrată în principal în regiunea 3 determinantă complementară (CDR3). În timpul procesului de maturare a afinității, apare hipermutația somatică (SHM) în regiunea variabilă. Un răspuns imun adaptativ puternic depinde de expansiunea clonelor de celule B și de un proces numit maturare a afinității, în timpul căruia sunt introduse mutații somatice în rearanjamentele genei Ig și sunt selectate celulele B cu afinitate mai mare pentru un anumit antigen.

Studiul repertoriului imunitar în transplantul de organe este crucial pentru a înțelege ce declanșează și susține procesul de respingere și cum poate accelera în cele din urmă calea către eșecul grefei. Cu progresele secvențierii de generație următoare și abordările computaționale robuste, putem studia regiunea VDJ în detaliu,12. Până în prezent, analiza repertoriului imun al celulelor T înrinichitransplantul a fost efectuat la un număr foarte limitat de paciențil3-15 și, deși BCRSeq a fost aplicat altor boli și răspunsuri imune umane, cum ar fi sleroza multiplă6, vaccinul gripal7 sau tulburările de imunodeficiență8, există o lipsă de studii în transplant. respingere. Într-orinichitransplant, BCRSeq a fost efectuat doar în contextul toleranței, sensibilizat la HLArinichicandidații la transplant supuși terapiei de desensibilizare20 și infiltrarea celulelor B comparând expansiunea clonală în sânge și grefa21. O altă aplicație privind BCRSeq în transplant a fost publicată anterior într-o cohortă mică de 12 beneficiari de transplant de inimă.

Recunoscând importanța brațului umoral al răspunsului imun în respingerea tardivă a transplantului și eșecul cronic al alogrefei, caracterizăm repertoriul imunitar din sângele periferic folosind BCRSeq într-un studiu prospectiv, longitudinal. Constatăm că diversitatea repertoriului imunitar înainte de transplant este mai mare la acei indivizi care respingrinichiarătând, de asemenea, extinderea anumitor clone și gene IGHV de-a lungul celor 24 de luni de urmărire. Aceste rezultate pot ajuta la prezicerea riscului de respingere înainte de grefare și pot avea implicații clinice în detectarea anumitor antigene care conduc la respingere.

Cistanche este bun pentru funcția rinichilor

Rezultate

Subiecte de studiu. Am efectuat BCRSeq în 83 de probe de sânge periferic de la 27 de pacienți unici și am executat conducta analitică prezentată în Fig.1. În acest studiu au fost luate în considerare trei grupe de fenotip clinic, definite de citirile patologice centrale oarbe ale biopsiilor de alogrefe în serie, punctate după criteriile Banff23,24 și scorul indicelui de deteriorare cronică a alogrefei (CADI): non-progresori (NP; n=10) au avut un scor CADI non-incremental scăzut fără respingere acută, progresorii fără respingere (PNR;n=10) ​​au avut scor CADI incremental pe 2 ani fără respingere, iar progresorii cu respingere (PR; n{=7) au avut scoruri CADI crescătoare pe 2 ani cu episoade de respingere. Demografie, cauze alerinichieșecul, iar utilizarea imunodepresiei este prezentată în Tabelul 1. Este important să evidențiem unele caracteristici ale acestor pacienți. Studiul parental la care au fost înrolați acești pacienți a avut o rată generală scăzută (17 la sută) de respingere acută confirmată prin biopsie (timp mediu de respingere {min, max}=12 {6,24}luni). Acești pacienți prezentau toți un risc imunologic scăzut de respingere (starea maximă de sensibilizare a anticorpilor reactivi din panoul<20%), and="" also="" had="" low="" rates="" of="" generation="" of="" donor-specific="" antibody(dsa)and="" only="" two="" of="" the="" rejection="" phenotype="" patients="" included="" in="" the="" analysis="" had="" dsa.="" the="" generation="" of="" dsa="" to="" hla="" and="" mica="" was="" measured="" in="" all="" serial="" sera="" throughout="" the="" study25.="" national="" experience="" with="" similar="" immunosuppressive="" protocols="" in="" similar="" patient="" cohorts="" have="" confirmed="" similar="" good="" clinical="" outcomes="" and="" low="" rejection="">

Secvențierea repertoriului imun al celulelor B. BCRSeq a fost efectuat pe probe de ADN (gDNA) genomic extrase din cheaguri de sânge pe 81 de probe din 27rinichiprimitorii de transplant la trei momente (0,6,24 luni). Secvențierea a obținut un număr total de 327.703 citiri (medie 4045/probă) după controlul calității (vezi secțiunea metode). Pentru validarea rezultatelor și evaluarea ulterioară a fiecărui izotip, am extras suplimentar ARN din PBMC potrivite care erau disponibile pentru 55 de probe, colectate în același timp cu cheagul de sânge și am efectuat secvențierea complementară ADN (ADNc) la o adâncime mai mare, obținând 1.773.330 de citiri. pentru IgD (medie 31.667/probă), 1.708.227 citiri pentru IgM (medie 30.504/probă), 973.444 citiri pentru IgA (medie 17.383/eșantion), 139.7345 citiri pentru IgG (medie 29,{29,444) }} citește pentru IgE (media 5178/probă) (Fig. 1 suplimentară). Bibliotecile pentru fiecare izotip au fost amplificate separat și apoi reunite pentru secvențiere; prin urmare, analiza comparativă a izotipului încrucișat nu este fezabilă.

Așa cum se arată în Fig. 1b, am definit o clonă ca un grup de celule care descend dintr-o moleculă strămoș comună care are același segment IGHV și IGHJ, aceeași lungime CDR3 și identitate de nucleotidă de 90% între CDR3, așa cum a fost definit anterior în studiile adaptive B. -răspunsurile celulare'8. Această definiție permite studierea diversității, a conurilor comune sau comune și a expansiunii clonale în contextul aloimunității înrinichitransplanturi. Numărul de conuri unice per individ la fiecare moment de timp este afișat ca grafic de bare în materialul suplimentar (Fig. 1 suplimentară). Pentru rigurozitatea analizei datelor, am redus eșantioanele cu<100 clones="" (69="" samples="" from="" gdna="" and="" 55="" samples="" from="" cdna="" were="" left="" for="" further="" study.="" ige="" isotype="" was="" discarded="" completely="" due="" to="" a="" very="" small="" number="" of="" reads).="" in="" addition,="" we="" filtered="" outpatient="" 8="" in="" the="" np="" group="" from="" subsequent="" analysis,="" as="" we="" recognized="" after="" the="" run,="" that="" he="" had="" developed="" ebv+post="" transplant="" lymphoproliferative="" disease(ptld)at="" 2.2="" years="" post="">rinichitransplant, caracterizat prin proliferarea lui Epstein Barr

Fig. 1 Conducta generală a studiului.a Reprezentarea schematică a structurii anticorpilor și a procesului de recombinare VDJ responsabilă pentru diversitatea produsă în repertoriul imunitar.b Clona de celule B definită ca celule dintr-un strămoș comun și conducta analitică c a studiului: celula B secvențierea pentru gDNA și cDNA, analiza diversității luând în considerare numărul de clone (bogăția) și frecvența fiecărei clone (entropia Shannon), analiza rețelei și analiza clonală și IGHVgene

celulele B infectate cu virusul (EBV). Am observat un număr crescut de clone la momentul 6 la acest pacient, cu o diversitate clonală mai mică înainterinichitransplant și la 24 de luni după transplantul de rinichi. Deoarece bibliotecile au fost amplificate dintr-o cantitate invariabilă de șablon, o fracțiune mai mare de celule B din sânge ar fi putut duce la un număr mai mare de clonotipuri reprezentate în produsele secvențiate. Din cauza procesului patologic distinct și unic la acest pacient, această probă a fost exclusă din analizele viitoare.

Diversitatea celulelor B pre-transplant este asociată cu respingerea. După cum se arată în Fig. 1c, am examinat diversitatea repertoriului imunitar al celulelor B luând în considerare bogăția speciilor (numărul de clone unice) și entropia Shannon (ecuația (1) din metode) de-a lungul momentelor de timp și a rezultatelor clinice folosind un model de regresie liniară, luând în considerare numărul a clonelor sau entropiei ca variabilă dependentă și rezultatul clinic sau SHM ca variabilă factor independentă. Repertoriul de dinainterinichitransplantul în PR a fost semnificativ mai divers decât în ​​NP (bogăție: valoarea P=0.005, entropie: valoarea P=0.01) cu aceeași tendință persistând la 6 luni dupărinichitransplant (bogăție: valoare P=0.02, entropie: valoare P=0.02) și fără diferențe de grup distinse la 2 ani după transplant (Fig. 2a și Fig. 2 suplimentară). Datele de secvențiere ADNc post-transplant au arătat aceeași tendință de diversitate mai mare a repertoriului la 6 luni după transplant, în principal pentru izotipurile IgD (bogăție: valoare P=0.02, entropie: valoare P=0. 03) (Fig. 2b și Fig. 2 suplimentară). Nu a existat niciun efect de confuzie asupra datelor din diverse variabile demografice și clinice, cum ar fi vârsta primitorului, sexul, rasa, sursa donatorului, tipul de imunosupresie, nepotrivirea HLA și cauza insuficienței renale. Deoarece răspunsul celulelor B al unui copil de 1-ani (vârsta minimă din date) și de 19-ani (vârsta maximă din date) ar putea fi foarte diferit, am efectuat o sensibilitate analiza excluzând acești doi pacienți și rezultatele au rămas semnificative (NP vs. PR la momentul 0: bogăție: valoare P=0.01, entropie: valoare P=0.03). Într-o altă măsură a diversității repertoriului imunitar, am evaluat SHM, definit ca frecvența mutațiilor în fiecare segment al genei V și am găsit o tendință pentru un număr mai mare de SHM pentru PR înainte de transplant și o tendință pentru SHM mai mare în izotipul IgD. în PR la 6 luni post-transplant (valoarea P=0.06).

Diversitatea celulelor B se modifică de-a lungul timpului în funcție de rezultatul clinic. Pentru a afla dacă diversitatea repertoriului imunitar se modifică de-a lungul timpului în funcție de rezultatul clinic, am modelat datele longitudinale folosind modele liniare cu efecte mixte, luând în considerare interacțiunea dintre rezultatul clinic și timp. Am descoperit că NP și PR s-au comportat diferit de-a lungul timpului după transplant, arătând o creștere a diversității în NP și o scădere a diversității în PR, în timp ce pentru PNR diversitatea a rămas invariabilă de-a lungul timpului. Acest lucru a fost observat pentru ADNg (bogăție: valoarea P=0.007, entropie: valoarea P=0.001, Fig. 3a) și toate izotipurile pentru ADNc, cele mai semnificative diferențe de entropie fiind pentru izotipurile IgM și IgD (IgA: valoare P=0,07, IgD: valoare P=0,02, IgG: valoare P=0,05, IgM: valoare P=0.04, Fig. 3b). Graficele pentru bogăție cu valorile P corespunzătoare sunt prezentate în Fig. 3 suplimentară. După cum s-a observat în grafice, un individ are un eșantion suplimentar la un timp de 32 de luni, ceea ce ar putea denatura rezultatele, astfel că a fost efectuată o analiză de sensibilitate excluzând acest eșantion din analiza și observarea unor rezultate similare, cu excepția izotipurilor IgG și IgM în care semnificația este pierdută (entropia gDNA: valoarea P=0.004. Entropia ADNc: IgA: valoarea P=0.1 , IgD: valoarea P=0.05, IgG: valoarea P=0.08, IgM: valoarea P=0.1).

Măsurile de diversitate pot fi afectate de eșantionarea biologică și tehnică. Diversitatea unui eșantion poate diferi semnificativ de diversitatea generală dintr-un repertoriu, deoarece sunt reprezentate doar o fracțiune de miliarde de celule, ceea ce este cunoscut sub numele de problema speciilor lipsă. Eșantionarea tehnică poate exista deoarece fiecare probă poate varia în adâncimea secvenței și un anumit grad de erori experimentale. Pentru a rezolva problema speciilor lipsă, am folosit instrumentul Recon (reconstrucție a clonelor estimate din numerele observate)29, care estimează distribuția globală a mărimii clonelor. Recon produce estimări precise și robuste ale unui set de măsuri de diversitate, inclusiv bogăția și entropia, permițând comparații robuste ale diversității între indivizi. Pentru a face față adâncimii de secvențiere și a unui anumit grad de erori experimentale, am efectuat o strategie de eșantionare; o strategie foarte bine utilizată în analiza repertoriului imunitar11,17,30. În analiza Recon (fig. suplimentară S4: A–E), atât bogăția, cât și diversitatea au fost replicate pentru datele gDNA. În datele ADNc, izotipul IgD de timp 6 arată tendința, dar nu a atins semnificație, deși rezultatele longitudinale pentru izotipurile IgA, IgD și IgG au fost replicate. În analiza de eșantionare (fig. suplimentară S4: F-J), totul este replicat, dar timpul este 0 pentru datele gDNA. Aceasta ar putea fi o consecință a restricției care reduce eșantionarea

Fig. 2 Diagrame de vioară care arată numărul de clone (bogăție) din cele trei rezultate clinice. un număr de clone la ori 0, 6 și 24 din probe de ADNg. b Numărul de clone la momentul 6 pentru izotipul IgD din probele de ADNc. Valorile P sunt obținute din ajustarea unui model de regresie liniară luând în considerare numărul de clone ca variabilă dependentă și rezultatul clinic ca variabilă factor independentă (n=27 eșantioane). Diagramele de vioară reprezintă densitatea de probabilitate a datelor la fiecare valoare. Markerul punct reprezintă valoarea mediană cu intervalul intercuartil. Datele sursă sunt furnizate ca fișier de date sursă

Fig. 3 Date longitudinale reprezentate grafic cu linia ajustată pentru fiecare rezultat clinic. o Diversitate măsurată prin entropia Shannon reprezentată de-a lungul momentelor de timp prin cele trei rezultate clinice (NP, PNR, PR) în gDNA. b Diversitatea măsurată prin entropia Shannon reprezentată de-a lungul momentelor de timp prin cele trei rezultate clinice (NP, PNR, PR) prin izotipuri în ADNc. Valorile P corespund termenului de interacțiune definit de timp × rezultatul clinic ajustând un model liniar cu efect mixt (n=27 eșantioane). Fiecare punct reprezintă entropia per probă de-a lungul timpului cu linia sa ajustată și intervalul de încredere. Datele sursă sunt furnizate ca fișier de date sursă

strategiile implicate, în special pe datele gDNA unde numărul de secvențe este mult mai mic decât pentru datele cADN. În gDNA, am limitat analiza la indivizi cu cel puțin 1000 de clone pentru a conserva suficiente secvențe. Reducerea eșantionării a fost efectuată la un minim de 1062 de clone în comparație cu 62.173 de clone în ADNc. În ciuda acestei limitări, am observat tendința pentru timpul 0, am conservat semnificația analizei longitudinale în ADNg și am replicat toate asocierile în ADNc. În ambele analize (recon și downsampling), am replicat rezultatele, în ciuda unor limitări evidențiate aici, arătând validitatea rezultatelor raportate anterior.

Rețelele de celule B prezintă diferențe în expansiunea clonală. Repertoriul celulelor B poate fi reprezentat în mod natural ca o rețea bazată pe diversitatea secvenței31. În datele noastre, am dezvoltat o rețea vizuală pentru fiecare probă (Fig. 4 și Figurile suplimentare 5–7) în care fiecare vârf a reprezentat un BCR unic, iar numărul de BCR identice bazat pe secvențele lor de nucleotide a definit dimensiunea vârfului. Există o margine între vârfuri atunci când acestea aparțin aceleiași clone, astfel încât grupurile de celule B pot fi afișate ca grupuri de vârfuri interconectate care formează o clonă. Pentru a cuantifica rețeaua, am folosit indicele Gini, care este o măsură de neuniformitate care a fost aplicată distribuțiilor de vârf și cluster. Când se aplică mărimii vârfurilor, Gini(V), este reprezentată natura clonală generală. Dacă Gini(V) este mai aproape de 1, vârfurile sunt inegale arătând expansiunea unora dintre ele, iar mai aproape de 0 în caz contrar. Când se aplică mărimii clusterului, Gini(C), este reprezentată dominanța clonală. Dacă sunt mai aproape de 1, clusterele sunt inegale și, prin urmare, reprezintă clone dominante, dacă sunt mai aproape de 0, toate clusterele sunt de dimensiuni egale.

În Fig. 4 prezentăm un exemplu de diferențe vizuale și cantitative marcate între repertoriile reprezentative de celule B din fiecare dintre cele trei grupuri de rezultate clinice, în cele trei momente de timp diferite (pre-transplant și post-transplant 6 și 24 de luni) . În repertoriul PR, există o abundență de secvențe de celule B care formează grupuri mai multe și mai mari de clone în comparație cu NP, în timp ce PNR este situat între ele. De-a lungul timpului, grupul PR arată o scădere a numărului de BCR și clone unice în comparație cu NP. Rețelele detaliate de celule B ale fiecărui individ din studiu sunt furnizate în figurile suplimentare. 5–7. Este interesant de observat modelul foarte divers al rețelei de celule B la persoana care a dezvoltat PTLD în grupul NP (Figura 5 suplimentară), fără expansiune a celulelor B înainte de transplant, urmată de o creștere a celulelor B după 6 ani. luni şi o expansiune clonală clară însoţită de o scădere a diversităţii la 24 de luni post-transplant.

La o evaluare ulterioară a măsurătorii indicelui Gini (Fig. 5), grupul PR a arătat în mod constant măsuri semnificativ mai mari atât pentru vârf, cât și pentru grupul de grup, față de grupul NP, sugerând că pacienții din grupul PR au avut o expansiune clonală mai mare la momentul inițial,

Fig. 4 Rețele de repertoriu de celule B de la trei indivizi reprezentând cele trei rezultate clinice în anumite momente. Fiecare vârf reprezintă un BCR unic fiind dimensiunea vârfului definită de numărul de BCR identice luând în considerare secvențele de nucleotide. Există o margine între vârfuri atunci când acestea aparțin aceleiași clone așa cum a fost definită anterior, deci clusterele sunt grupuri de vârfuri interconectate care formează o clonă. Fiecare eșantion arată indicele gini obținut pentru dimensiunea vârfurilor (Gini(V)) și dimensiunea clusterului (Gini(C)). BCR reflectă totalul receptorilor de celule B pentru acea probă specifică, iar clonele reflectă numărul total de clone unice. Datele sursă sunt furnizate ca fișier de date sursă

și extinderea ulterioară post-transplant a unui subset de clone dominante (valoarea P [regresia liniară] <0.05, fig.="" 5).="" grupul="" pnr="" se="" încadrează="" între="" np="" și="" pr="" așa="" cum="" s-a="" arătat="" anterior,="" deși="" acest="" timp="" este="" semnificativ="" diferit="" față="" de="" grupul="" np="" la="" momentul="" 24="" (valoarea="" p="" [regresie="" liniară]="">< 0,05).="" deși="" datele="" pentru="" fig.="" 5="" au="" fost="" generate="" din="" datele="" adng,="" izotipul="" igm="" pentru="" adnc="" a="" arătat="" aceleași="" diferențe="" (valoarea="" p="" [regresie="" liniară]="0.05)" (figura="" 8="">

Anumite clone și gene IGHV sunt implicate în respingere.

Deși obiectivul nostru principal a fost de a caracteriza repertoriul celulelor B pe grupuri de rezultate clinice, oferind o imagine globală a răspunsului imun înainte și post-transplant, datele noastre ne-au permis, de asemenea, să efectuăm analize specifice secvenței Ig la clonă și IGHV. nivelul genelor.

Pentru analiza clonală, am evaluat asocierea prezenței sau absenței fiecărei clone particulare (118.223 clone totale) cu rezultatul clinic (PR, PNR, NR) la fiecare moment de timp. Aplicând testul exact al lui Fisher, am găsit 8, 4 și 21 de clone asociate nominal cu rezultate clinice la fiecare dintre 0, 6 și, respectiv, 24 de luni (Tabelul suplimentar 1). Deși niciunul nu a trecut de corecția testelor multiple, în principal din cauza lipsei de putere, deoarece avem o dimensiune limitată a eșantionului în analiză cu mii de parametri (clone), am putut observa că cele câteva clone care s-au apropiat de semnificație (valoarea P < {{="" 11}}.05)="" au="" fost="" împărțite="" între="" pacienții="" numai="" din="" grupul="" pr="" și="" s-au="" îmbogățit="" la="" 24="" de="" luni="" după="">

De asemenea, am luat în considerare dacă unele clone au persistat în timpul prelevării de probe, mai mult decât altele, în cadrul fiecărui rezultat clinic (Figura 9 suplimentară). Luăm în considerare două măsuri diferite: (1) numărul de clone persistente și (2) expansiunea clonală. Am observat că clonele care erau persistente în PR au fost semnificativ mai extinse (valoarea P [regresia liniară]=0.01, PR vs. NP) și au arătat o tendință de un număr mai mare de clone persistente (P- valoarea [regresiune liniară]=0.09). Am examinat în continuare dacă aceste clone persistente au fost, de asemenea, împărtășite între diferiți indivizi în cadrul fiecărui rezultat clinic. Din cele 263 de clone persistente detectate, 23 au fost partajate între indivizi. Cinci au fost partajate în cadrul aceluiași PNR și șase în cadrul grupului PR și nicio clonă nu a fost împărțită între grupul NP. În total, 12 clone comune au fost comune în ambele grupuri de pacienți cu leziuni cronice progresive de transplant și fibroză în timp (PR și PNR). Lista clonelor partajate între indivizi este furnizată în materialul suplimentar (Tabelul suplimentar 2).

Apoi am efectuat analiza genei IGHV, analizând utilizarea genei IGHV per probă, definită ca numărul de ori în care fiecare genă IGHV a fost utilizată, normalizată prin numărul de clone (pentru a evita prejudecățile de eșantionare a anumitor gene IGHV), filtrând conținutul scăzut exprimat.

Fig. 5 Indicele Gini Vertex reprezentat grafic în raport cu indicele Gini a grupului. Diagrama de împrăștiere reprezintă fiecare eșantion la momentele 0, 6 și 24. Boxploturile arată diferențele Gini(V) și Gini(C) la momentul 24. Valorile P sunt obținute din ajustarea unui model de regresie liniară considerând Gini(V) și Gini(C) ca o variabilă dependentă și rezultatul clinic ca o variabilă factor independentă pentru fiecare punct de timp (n=27 eșantioane). În diagrama cu casete este afișat doar timpul 24, dar timpul 0 și 6 au fost, de asemenea, semnificativi pentru NP vs. PR: timpul 0: P (Gini (V))=0.1, P ( Gini(C))=0.05; timpul 6 P (Gini(V))=0,02, P (Gini(C))=0,01; timpul 24: P (Gini(V))=0.003, P (Gini(C))=0.01. Banda din interiorul cutiei reprezintă valoarea mediană, caseta definește intervalul intercuartil (IQR), iar mustații definesc primul și al treilea quartila ± 1,5 × IQR. Datele sursă sunt furnizate ca fișier de date sursă

gene (utilizarea genei IGHV > {{0}}.05 în cel puțin 10 procente din probe) și aplicarea unui model de regresie liniară pentru a găsi acele gene care au fost asociate cu fiecare rezultat clinic, la fiecare punct de timp. Din cele 27 de gene IGHV care au trecut prin filtrul de expresie scăzută, am găsit gene semnificative între grupul PR și NP (valoarea P < 0.05)="" cu="" trei="" gene="" la="" momentul="" 0,="" 7="" la="" momentul="" 6="" și="" 16="" la="" timpul="" 24="" (fig.="" 6a–c).="" din="" aceste="" gene,="" 1="" (ighv3-11)="" la="" momentul="" 0,="" 5="" gene="" (ighv{3-7,="" ighv3-15,="" ighv3-21,="" ighv{3-23,="" ighv{="" {22}})="" la="" timpul="" 6="" și="" 16="" gene="" (ighv1-8,="" ighv1-18,="" ighv1-46,="" ighv2-="" 5,="" ighv3-7,="" ighv{{="" 30}},="" ighv3-15,="" ighv3-23,="" ighv3-30,="" ighv3-33,="" ighv3-48,="" ighv3-74,="" ighv{{37="" }},="" ighv4-59,="" ighv{4-61,="" ighv5-51)="" la="" momentul="" 24="" a="" trecut="" de="" corecția="" cu="" teste="" multiple="" ale="" ratei="" de="" descoperire="" falsă="" (fdr).="" în="" mod="" interesant,="" am="" descoperit="" că="" ighv3-23="" a="" fost="" cea="" mai="" semnificativă="" și="" abundentă="" genă="" în="" toate="" cele="" trei="" momente="" din="" comparația="" np="" vs.="" pr="" (timp="" 0:="" valoarea="" p="0.04," timpul="" 6:="" p-="" valoarea="0.003," timp="" 24:="" valoarea="" p="0.02)" (fig.="" 6d).="" în="" plus,="" am="" evaluat="" dacă="" secvențele="" ighv3-23="" au="" fost="" suprareprezentate="" printre="" secvențele="" partajate="" din="" analiza="" clonală="" anterioară.="" am="" descoperit,="" folosind="" o="" analiză="" de="" îmbogățire="" cu="" testul="" exact="" al="" lui="" fisher,="" că="" secvențele="" ighv3-23="" au="" fost="" semnificativ="" suprareprezentate="" în="" ambele,="" clonele="" persistente="" împărțite="" între="" indivizi="" (tabelul="" suplimentar="" 2)="" (valoarea="" p="">< 2,2="" ×="" 10="" -="" 16).="" ),="" și="" clonele="" asociate="" cu="" rezultatul="" clinic="" la="" momentul="" 24="" (tabelul="" suplimentar="" 1)="" (valoarea="" p="">< 2,2="" ×="" 10-16).="" am="" observat="" că="" individul="" 9="" din="" grupul="" nr,="" despre="" care="" s-a="" descoperit="" că="" împărtășește="" unele="" clone="" persistente="" cu="" progresorii="" în="" analizele="" anterioare,="" s-a="" clasificat="" cu="" grupul="" pr="" în="" toate="" momentele.="" nu="" a="" existat="" niciun="" efect="" de="" confuzie="" asupra="" datelor="" din="" diverse="" variabile="" demografice="" și="" clinice,="" cum="" ar="" fi="" vârsta="" primitorului,="" sexul,="" rasa,="" sursa="" donatorului,="" tipul="" de="" imunosupresie,="" nepotrivirea="" hla="" și="" cauza="" insuficienței="" renale.="" în="" plus,="" s-a="" dovedit="" că="" această="" genă="" este="" semnificativă="" atât="" în="" ​​izotipurile="" igm="" (valoarea="" p="" [regresia="" liniară]="0.008)" cât="" și="" în="" izotipurile="" igd="" (valoarea="" p="" [regresia="" liniară]="0.05)." bazat="" pe="" adnc="" la="" 24="" de="" luni="" post-transplant,="" în="" concordanță="" cu="" rezultatele="" anterioare="" care="" arată="" consecvență="" cu="" aceste="" două="" izotipuri="" fiind="" cele="" mai="" îmbogățite="" în="" grupul="" pr.="" doar="" alte="" trei="" gene="" au="" fost="" găsite="" semnificative="" în="" analiza="" adnc="" și="" toate="" au="" fost="" la="" 24="" de="" luni="" după="" transplant="" în="" izotipurile="" igd="" și="" igm="" (ighv3-15="" și="" ighv{4-="" 61="" în="" igd="" și="" ighv{4-39="" în="">

Discuţie

Diversitatea este o caracteristică esențială a sistemului imunitar, iar la oamenii sănătoși, este esențială împotriva agenților patogeni pentru a face față bolilor. În transplantul de organe, manipularea terapeutică deliberată este instituită clinic pentru a permite ca organul străin să fie ignorat sau acceptat în mod activ de către sistemul imunitar al pacientului pentru a nu genera un răspuns aloimun, ducând la respingere. Celulele B sunt o componentă importantă a acestui proces și au fost demonstrate de grupul nostru și de alții ca fiind esențiale atât în ​​prezentarea antigenului32,33, cât și în producția de aloanticorpi34,35. În această lucrare, am folosit secvențierea celulelor B cu randament ridicat pentru a înțelege mai bine diversitatea și clonalitatea celulelor B dinrinichicirculația transplantului, atât înainte de grefare, cât și după 24 de luni de urmărire, cu o evaluare longitudinală a repertoriului imunitar al celulelor B. În general, analiza noastră arată o diversitate mai mare a celulelor B înainte de grefare, diferențe longitudinale cu o scădere a diversității însoțită de expansiune clonală și o creștere a utilizării anumitor gene IGHV în rândul celor care resping grefele.

O nevoie clinică cheie nesatisfăcută pentru un transplant de organ este lipsa unei predicții neinvazive, sensibile și precise a prejudiciului transplantului și a rezultatelor slabe. Această sarcină este complicată de faptul că există diverși factori care influențează supraviețuirea grefei36. În acest studiu, am descoperit că indivizii stabili au avut o diversitate redusă a repertoriului imunitar al celulelor B înainte de transplant, în comparație cu cei care au respins organul. Următorul pas ar trebui să fie demonstrarea valorii predictive a diversității repertoriului celulelor B, oferind potențiali biomarkeri mai buni pentru predicția respingerii înainte de grefare și posibilitatea de a fi implementate în îngrijirea clinică și alegerile de imunodepresie înainte și după.rinichitransplant. Dacă această caracteristică este rezultatul oricărui factor care contribuie la scăderea diversității la indivizii stabili, cum ar fi factorii de mediu sau genetici, am putea nu numai să prezice respingerea, ci și să o prevenim. Într-adevăr, descoperiri foarte recente au arătat că variația sistemului imunitar este determinată de factori de mediu și genetici37,38. În studiul nostru, nu am putut găsi nicio asociere cu nicio caracteristică demografică și cu alte caracteristici clinice ale pacientului (vârstă, sex, rasă, imunosupresie, sursă de organe, nepotriviri HLA și ESRD). În acest sens, avem nevoie de o nouă analiză pentru a corobora dacă factorii specifici afectează diversitatea repertoriului celulelor B și rezultatele transplantului.

O altă descoperire interesantă a studiului nostru arată că repertoriul imunitar se comportă diferit de-a lungul timpului, în funcție de grupul de rezultat clinic. Pentru cei care prezintă respingere post-transplant a organului, diversitatea celulelor B este inițial mai mare și apoi scade în timp, în timp ce tendința de diversitate inversă este observată la pacienții care nu dezvoltă respingere sau leziune cronică a grefei. Chiar dacă toți indivizii au primit aceeași sarcină de imunosupresie după transplant, unele posibile explicații pentru diversitatea scăzută la pacienții care dezvoltă respingere se pot lega de faptul că acești pacienți primesc o încărcătură temporară mult crescută de imunosupresie pentru tratamentul respingerii și apoi sunt menținute pe linia de bază superioară. Deși acest lucru ar putea explica reducerea diversității celulelor B în timp și diferența la 24 de luni după transplant, este puțin probabil ca aceasta să fie cauza, deoarece diversitatea redusă în grupul PR este

Fig. 6 Heatmap și boxplot pentru analiza utilizării genelor IGHV. Harta termică care arată genele IGHV selectate ca semnificative nominal (valoarea P < 0.05)="" la="" momentul="" 0="" (a),="" 6="" (b)="" și="" 24="" (c)="" pentru="" np="" vs="" pr.="" scala="" de="" culoare="" roșie="" reprezintă="" expresia="" fiecărei="" gene="" în="" probe.="" benzile="" de="" sus="" arată="" rezultatul="" clinic="" și="" cauza="" brst.="" boxplot="" care="" arată="" expresia="" ighv3-23="" în="" momente="" de="" timp="" pentru="" np="" vs.="" pr="" (timpul="" 0:="" valoarea="" p="0.04," timpul="" 6:="" valoarea="" p="0.003," timpul="" 24:="" p="" -valoarea="0.02)" (d).="" banda="" din="" interiorul="" cutiei="" reprezintă="" valoarea="" mediană,="" caseta="" definește="" intervalul="" intercuartil="" (iqr),="" iar="" mustații="" definesc="" primul="" și="" al="" treilea="" quartila="" ±="" 1,5="" ×="" iqr.="" valorile="" p="" sunt="" obținute="" din="" ajustarea="" unui="" model="" de="" regresie="" liniară="" considerând="" genele="" v="" ca="" o="" variabilă="" dependentă="" și="" rezultatul="" clinic="" ca="" o="" variabilă="" independentă.="" (n="12" mostre).="" datele="" sursă="" sunt="" furnizate="" ca="" fișier="" de="" date="">

observat de asemenea la 6 luni post-transplant, într-un moment în care pacienții nu au dezvoltat încă respingere, sugerând că sunt probabil implicate și alte procese active. Observarea expansiunii clonale selective cu clone mai dominante numai la pacienții care dezvoltă atât respingere, cât și/sau cronicizare progresivă.rinichileziunea de transplant, sugerează o selecție, persistență și extindere a anumitor clone în timp, relevantă din punct de vedere biologic, determinată de aloantigen, ceea ce explică reducerea generală a diversității temporale. Chiar dacă putem emite ipoteza că extinderea acestor clone este probabil legată de o leziune aloimună a grefei, dovezile directe că expansiunea acestor clone este aloimună necesită studii suplimentare in vitro și pe animale.

Respingerea acută rămâne cel mai puternic factor negativ pentru supraviețuirea pe termen lung a grefei, în ciuda îmbunătățirilor rapide ale terapiilor de imunosupresie39,40. Acest studiu găsește, de asemenea, o asociere a utilizării unor gene IGHV cu respingerea, deși legătura cauzală ar trebui explorată în studiile viitoare. IGHV3-23 este cea mai interesantă genă din analiza ADNg, deoarece este mult mai utilizată la pacienții care dezvoltă respingere în toate momentele măsurate și este suprareprezentată în clonele persistente împărtășite între indivizi și clonele îmbogățite între indivizi. pacienți respinși la 24 de luni post-transplant. Această genă este, de asemenea, validată la 24 de luni după transplant în ambele izotipuri IgD și IgM în analiza ADNc. IGHV3-23 a fost asociat pe scară largă cu un prognostic prost în leucemia limfocitară cronică41 și s-a demonstrat că marea majoritate a secvențelor IGHV3-23 și-au păstrat capacitatea de a media interacțiunile superantigenelor42. Superantigenele celulelor B sunt produse de viruși și bacterii, despre care se știe că se leagă la imunoglobuline în afara site-urilor convenționale de legare a antigenului43. S-a demonstrat că întâlnirile de celule B cu un superantigen induc proliferarea, activarea, migrarea și deleția44. În transplantatrinichi, există potențialul de expunere continuă la virus și antigene bacteriene, legată fie de o etiologie a refluxului vezicoureter primar ca cauză a BRST, fie de reflux urinar secundar după reimplantarea ureterului transplantat, fie de reflux după infecția tractului urinar, riscul de care este crescută cu expunerea la imunosupresie cronică după transplant. Am ajustat rezultatele analizelor pentru cauza insuficienței renale, printre alți factori clinici și demografici; rezultatele discutate anterior rămân semnificative, deși ne-am dat seama că pacientul clasificat greșit NP în analiză (Fig. 6) avea o boală de reflux. Cheng şi colab. au descoperit anterior, de asemenea, că clonele din țesutul de biopsie ale primitorilor de transplant de rinichi infiltrate de celule B au avut o predominanță a genei IGHV3-23 printre altele45. Grover et al.46 au demonstrat că anticorpii pentru această genă particulară nu recunosc antigenele HLA donatorilor, ci mai degrabă erau specifici pentru E. coli, iar Modena et al.47 au arătat că sarcina numărului de bacterii din urină a fost mult mai mare la pacienții cu fibroză interstițială și atrofie tubulară decât cei cu grefe care funcționau bine. Extindem aceste constatări demonstrând că utilizarea genei IGHV3-23 este semnificativ mai mare la pacienții cu respingere multiple din sângele periferic și poate implica antigene obișnuite particulare în respingerea conducerii. În viitor, expresia IGHV3-23 ar putea fi utilizată pentru a monitoriza răspunsul imun față de transplantulrinichi.

Extinzând studiul nostru folosind secvențierea ADNc, am putea replica majoritatea rezultatelor noastre în două dintre izotipuri (IgM și IgD), prezentând o diversitate mai mică pre-transplant în NP, fiind cele două cele mai semnificative în analiza longitudinală cu mai multă expansiune și dominantă. clonele din analiza rețelei și, de asemenea, replicarea genei IGHV3-23. Primii anticorpi care sunt produși într-un răspuns imun umoral sunt întotdeauna IgM și progresează rapid la producerea tuturor izotipurilor diferite, IgD, IgA, IgG și IgE, dar un interes deosebit necesită izotipul IgD48. IgD este co-exprimată cu IgM și IgD secretată există și are o funcție în sânge, secrețiile mucoase și pe suprafața celulelor efectoare imune înnăscute, cum ar fi bazofilele49. Bazofilele sunt celule albe care luptă împotriva virușilor, bacteriilor, paraziților și ciupercilor și sunt implicate în bolile renale și în respingerea transplantului50. Astfel, o altă dovadă care leagă răspunsurile celulelor B la procesul de respingere cu viruși și bacterii.

Sunt necesare studii viitoare pentru a demonstra că această activare se datorează diferențelor în microbiomul receptorului cu implicații în diagnostic și terapie.

Acest studiu ne-a permis să identificăm relevanța unora dintre aceste clone BCR, să identificăm clonele BCR de relevanță clinică cu respingerea alogrefei și să arătăm că există o relevanță probabilă a acestor clone cu imunitate heterologă, având în vedere îmbogățirea acestor clone la pacienții cu tractul urinar colonizat înainte de transplant și relevanța lor biologică pentru răspunsurile patogenilor. O mai bună înțelegere a comportamentului repertoriului imunitar înrinichitransplanturile nu ar fi fost posibile fără aplicarea BCRSeq în combinație cu o implementare robustă a conductelor computaționale și statistice. Cu toate acestea, există câteva limitări ale abordării noastre care ar trebui recunoscute: în primul rând, dimensiunea eșantionului nostru este foarte selectată și relativ mică la un set de pacienți pediatrici și chiar dacă am atins o semnificație statistică în analiza noastră și am validat în două surse diferite de date, vor fi necesare analize suplimentare pentru a confirma rezultatele noastre. În al doilea rând, rezultatele noastre nu sunt scutite de influența pe care o poate avea eșantionarea biologică și tehnică în analiza noastră. Măsurile de diversitate depind de mai multe aspecte: faptul că doar o fracțiune de miliarde de celule dintr-un repertoriu este reprezentată într-un eșantion, diferențele în adâncimea secvenței și posibile erori experimentale. Am controlat pe scară largă toate aceste probleme, mai întâi în laborator, rulând aceeași cantitate de sânge pentru fiecare probă din același lot și al doilea, din punct de vedere computațional și statistic, aplicând instrumentul de reconstituire pentru a estima repertoriul general și efectuând eșantionarea pentru a controla adâncimea secvenței. și erori experimentale. În al treilea rând, am efectuat BCRSeq folosind două surse diferite, gDNA și cDNA. Secvențierea ADNg facilitează estimarea clonalității unei secvențe date de Ig, deoarece numărul de citiri de secvență va fi proporțional cu numărul de molecule de ADNg. Secvențierea ADNc oferă o estimare a nivelului de expresie relativ al diferitelor secvențe de Ig din repertoriu. S-a demonstrat că, pentru receptorii celulelor T, caracterizarea clonotipului efectuată pe ADNc nu este la fel de bună ca în ADNg, demonstrând că proporția relativă a clonelor individuale diferă foarte mult15 sau că urmărirea clonelor specifice HIV are succes numai cu ADNg, dar nu ARNm51. În al patrulea rând, influența imunosupresiei poate fi un factor de confuzie în acest tip de analiză. În acest studiu, toate probele provin dintr-un studiu clinic în care toți pacienții au primit aceeași sarcină de imunosupresie după transplant. Cu toate acestea, am controlat cele două tipuri de steroizi pe bază de steroizi și fără steroizi pentru a ne asigura că aceasta nu a fost o problemă, observând nicio diferență între rezultate. În sfârșit, cohorta pe care o prezentăm aici este cea a transplanturilor pediatrice. Majoritatea aspectelor clinice transplantate sunt similare la copii și adulți. Imunosupresia și regimurile utilizate sunt similare, creatinina este biomarkerul seric major, respingerea acută este determinată în primul rând prin biopsie cu utilizarea criteriilor Banff, iar mecanismele de respingere alerinichigrefa sunt în general similare52, prin urmare majoritatea cercetărilor efectuate la adulți sau la copii se pot aplica ambelor. Cu toate acestea, alte aspecte precum nerespectarea/neaderarea la imunosupresie, aspectele imunologice, bolile renale primare, care duc la insuficiență renală, adesea asociate cu probleme urologice, și imunizările care sunt necesare înainte de transplant pot diferi, prin urmare analize suplimentare în o populație adultă va fi necesară pentru a generaliza aceste constatări.

În ciuda acestor limitări, datele noastre arată că se observă o diversitate mai mare înainte de transplant la persoanele care continuă să respingă organul, sugerând o predispoziție de respingere, care poate avea implicații viitoare în prezicerea riscului de respingere înainte de grefare, alegeri de imunodepresie și îngrijire clinică. practici. După 24 de luni de urmărire, se observă o reducere generală a diversității în timp, însoțită de persistența și expansiunea anumitor clone și de o utilizare mai mare a mai multor gene IGHV în grupul de respingere, ceea ce poate implica anumite antigene obișnuite în determinarea respingerii. Se observă un interes deosebit pentru utilizarea crescută a genei IGHV3-23 în rândul pacienților cu respingere, deoarece aceasta a fost asociată anterior curinichitransplant și ar putea fi o componentă cheie pentru a conduce procesul de respingere. Această lucrare prezintă o analiză longitudinală a repertoriului imunitar al celulelor B în transplanturile de organe, promovând mai multe studii pentru a confirma aceste constatări, deoarece ele pot avea implicații clinice în predicția, controlul, monitorizarea și tratarea.rinichirespingere.

Metode

Design de studiu. Am studiat 81 de eșantioane pentru ADNg și 56 de probe potrivite pentru ADNc longitudinal, la intervale de timp 0, 6 și 24 de luni, dintr-un număr total de 27 de primitori pediatrici care au primit un tratament primar.rinichitransplant. Subiecții din acest studiu provin dintr-un studiu clinic (studiu multicentric SNSO1) în care subiecții au fost randomizați (1:1) la un regim tradițional de imunosupresie cu doze mici de steroizi (steroizi, inducție standard cu daclizumab până în a doua lună după transplant, și imunosupresia de întreținere cu tacrolimus (Prograf, Astellas Pharma) și MMF (CellCept, Hoffman-La Roche) sau un regim de imunosupresie fără steroizi (inducerea prelungită a daclizumabului până la a șasea lună post-transplant, tacrolimus și MMF).Toți subiecții au fost s-au înrolat după aprobarea IRB și au avut consimțământul informat.În acest studiu, 14 pacienți au primit un regim de evitare a steroizilor, în timp ce 13 au primit un regim imunosupresor pe bază de steroizi53 și niciunul dintre acești pacienți nu a primit imunosupresie înainte de transplant, deoarece acesta a fost unul dintre criteriile de excludere. a constat din trei impulsuri de corticosteroid intravenos (10 mg/kg) și intensificarea imunosupresiei inițiale.

Toate probele utilizate în studiu au avut asociată o biopsie de alogrefă în serie, care a fost citită de un patolog central, folosind scoruri histologice semi-cantitative. Respingerea acută clinică a fost definită ca un episod acut de respingere, asociat cu disfuncția grefei, pe baza unei creșteri mai mari de 10% a creatininei serice față de valorile inițiale și confirmată printr-o citire patologică centrală a biopsiilor conform clasificării Banff actualizate23,24. Leziunea cronică a alogrefei a fost definită folosind scorul indicelui de deteriorare cronică a alogrefei (CADI). Pacienții au fost clasificați în trei rezultate clinice definite prin scorul CADI și episoadele de respingere. scorul la biopsiile lor în serie de peste 2 ani și incremental de-a lungul momentelor fără respingere și progresorii cu respingere (PR) au avut scoruri CADI crescute la biopsiile lor în serie de peste 2 ani cu episoade de respingere. Acești pacienți au fost selecționați cu mare atenție dintr-o cohortă mai mare de 120 de pacienți, potrivindu-se pentru variabilele demografice și pentru toate NP și PNR să nu aibă dovezi de inflamație la biopsie sau leziuni subclinice, măsurate prin absența anticorpilor specifici donatorului. Niciunul nu a avut HLA sau grefă haploidentică, deoarece acesta a fost un criteriu de excludere pentru înscriere54. Toate probele au fost colectate de la 12 programe diferite de transplant pediatric din SUA între 2004 și 2006, conform protocoalelor aprobate de IRB. Studiul a fost, de asemenea, aprobat de Human Research Protection Program (HRPP) al Universității din California, San Francisco și al Universității Stanford, pentru a permite o analiză a probelor de biobancă. Toți pacienții/tutorii și-au dat consimțământul informat pentru a participa la cercetare, în deplină aderență la Declarația de la Helsinki. Activitățile clinice și de cercetare raportate sunt în concordanță cu Principiile Declarației de la Istanbul, așa cum sunt subliniate în Declarația de la Istanbul privind traficul de organe și turismul transplantului.

Izolarea ADNg și ARN. Probele de sânge (4,5 ml) au fost colectate într-un tub superior roșu de 5 ml și incubate la temperatura camerei timp de 30 de minute până când s-a format cheagul. Proba a fost apoi centrifugată la 2000 × g timp de 5 minute folosind un rotor cu găleată oscilantă. Stratul superior de ser a fost apoi transferat într-un alt criotub și cheagul a fost depozitat în același tub la -80 de grade până la utilizare. ADN-ul genomic din cheaguri de sânge integral a fost extras utilizând Clotspin Baskets și Gentra PuregeneBlood Kit (Qiagen, Valencia, CA).

Pentru extragerea ARN dinrinichibiopsie cu ac (Qiagen, Valencia, CA) și păstrată la -80 de grade; ARN total a fost extras folosind un amestec principal de 790 pl TRIzol și 10 pl glicogen. Probele de țesut au fost omogenizate, incubate la 15 până la 25 de grade timp de 5 minute și s-au adăugat 160 ui cloroform pentru separarea fazelor. Amestecul a fost incubat din nou la 25 de grade timp de 2 minute, urmată de centrifugare la 4 grade și utilizat pentru extracția ARN folosind kit-ul RNeasy Micro (Qiagen Catalog nr.4004). Cantitatea și integritatea ARN au fost determinate cu spectrofotometrul Thermo Scientific NanoDrop ND-2000 UV–Vis și, respectiv, cu Bioanalyzerul Agilent.

Secvențierea celulelor B. Au fost preparate reacții PCR modelate de ADN genomic

de la 100 ng alicote de ADNg pentru a genera șase biblioteci independente de coduri de bare per probă. Au fost utilizați primeri multiplexați la regiunile cadru IgH J sau FR1 sau FR2 conform designului BIOMED-255. „Secvențele de cod de bare” de zece nucleotide din primeri au fost utilizate pentru a indica identitatea probei și a replica identitatea bibliotecii pentru fiecare reacție PCR. PCR a fost efectuată cu polimerază AmpliTaq Gold (Roche) cu următorul program: 94 grade timp de 5 min; 35 de cicluri de (94 grade pentru 30 s, 60 grade pentru 45 s, 72 grade pentru 90 s); și extensia finală la 72 de grade timp de 10 min. O a doua reacție PCR a fost efectuată pentru a se asigura că bibliotecile nu au fost amplificate până la saturație înainte de purificarea și secvențierea gelului. În total, 0,4 ul din fiecare prim produs PCR au modelat a doua reacţie PCR utilizând primeri externi specifici pentru secvenţele de 454 linker; amplificarea s-a realizat cu programul: 94 grade timp de 15 min, 12 cicluri de (94 grade pentru 30 s, 60 grade pentru 45 s, 72 grade pentru 90 s) si extensie finala la 72 grade timp de 10 min. Rata de eroare a AmpliTaq Gold ar trebui să aibă un efect minim asupra identificării secvențelor legate clonal sau estimării ratelor de mutație somatică în secvențe, așa cum s-a discutat în altă parte56. ADNc a fost sintetizat dintr-un total de 300 ng de ARN cu amorsare prin hexameri aleatori. Șabloanele au fost amplificate prin PCR utilizând primeri Biomed IGHV în cadrul 1 (FR1) și primeri specifici izotipului localizați în primul exon al regiunilor constante. Acești primeri18,57 au codificat, de asemenea, aproximativ jumătate din secvențele de linker Illumina necesare pentru generarea și secvențierea clusterului pe instrumentul MiSeq. Identitatea probei a fost codificată prin coduri de bare multiplex cu opt nucleotide în fiecare primer. Pentru recunoașterea clusterului Illumina, patru nucleotide randomizate au fost codificate în primeri imediat după secvența linker Illumina în primerii regiunii constante. Fiecare izotip de anticorp pentru fiecare probă a fost amplificat într-o reacție PCR separată, pentru a preveni formarea de produse PCR himerice de izotip încrucișat. PCR a fost efectuată cu AmpliTaq Gold (Roche) urmând instrucțiunile producătorului și a folosit un program de 94 de grade timp de 7 minute, 35 de cicluri de (94 de grade pentru 30 s, 58 de grade pentru 45 s, 72 de grade pentru 120 s) și final extensie la 72 de grade timp de 10 min. O a doua etapă PCR a fost utilizată pentru a adăuga porțiunea rămasă din linkerii Illumina la ampliconi și a fost efectuată cu kitul Qiagen Multiplex PCR (Qiagen) conform instrucțiunilor producătorului, folosind 0,4 microlitri din primul produs PCR ca șablon într-un Reacție de 30 microlitri. Programul PCR pentru a doua etapă PCR a fost de 94 de grade timp de 15 minute, 12 cicluri de (94 de grade pentru 30 s, 60 de grade pentru 45 s, 72 de grade pentru 90 s) și extensia finală la 72 de grade timp de 10 minute. Produsele fiecărei reacții PCR au fost reunite în cantități echimolare estimate, au fost supuse electroforezei pe geluri de agaroză și gelul extras cu kituri QIAquick (Qiagen). Secvențierea cu randament ridicat a bibliotecilor șablonate de ADN genomic a fost efectuată pe platforma 454 (Roche) folosind chimia titanului. Secvențierea bibliotecii de ADNc a fost efectuată pe un instrument Illumina MiSeq folosind kituri de secvențiere ciclului 600-. O listă completă a primerilor utilizați cu MiSeq (M154 și M155) și 454 Titanium (T7) este inclusă în Datele suplimentare 1.

Citirile de secvențiere au fost procesate după cum urmează: citirile de la capătul pereche au fost îmbinate folosind FLASH58, unde secvențele de după au fost demultiplexate și tăiate de coduri de bare și secvențe de primer IGHV. Regiunile V, D și J și joncțiunile V–D (N1), D–J (N2) au fost identificate folosind programul de aliniere IgBLAST59. Secvențele au fost filtrate pentru a elimina artefactele non-IGH, secvențele cu inserție sau deleții ale genei V, secvențe himerice și secvențe nefuncționale. La nivel de eșantion, i-am exclus pe cei cu<100 clones="" (defined="" by="" same="" v="" and="" j="" segments,="" same="" cdr3="" length,="" and="" 90%="" nucleotide="" identity)="" as="" a="" control="" for="" bad="" quality="" samples.="" after="" quality="" control,="" for="" gdna,="" we="" had="" complete="" longitudinal="" data="" for="" 69="" samples="" at="" times="" 0,="" 6,="" and="" 24="" with="" a="" total="" number="" of="" 327,703="" reads="" (mean="" 4045="" per="" sample).="" for="" cdna,="" we="" had="" complete="" data="" for="" 55="" matched="" samples,="" although="" no="" time="" 0="" samples="" were="" further="" available.="" in="" this="" case,="" we="" had="" isotype-="" specific="" information="" (1,773,330="" reads="" for="" igd="" (31,667="" per="" sample),="" 1,708,227="" reads="" for="" igm="" (30,504="" per="" sample),="" 973,444="" reads="" for="" iga="" (17,383="" per="" sample),="" 139,7345="" reads="" for="" igg="" (24,953="" per="" sample),="" and="" 29,000="" reads="" for="" ige="" (5,178="" per="">

Analiza diversității. Diversitatea este măsurată prin bogăția speciilor luând în considerare numărul de clone per probă. Această măsură nu ia în considerare frecvența fiecărei specii, așa că am folosit și entropia Shannon (H) pentru a măsura diversitatea oferind

informații despre distribuția mărimii speciilor în populație. H este definit ca:

unde N este numărul de clone unice și pi este frecvența clonei i. H variază de la 0 (eșantion cu o singură clonă) la Hmax ¼ log2N (eșantion cu o distribuție uniformă a clonelor).

Apoi, am folosit un model liniar general pentru a găsi asocierea dintre bogăție și entropie cu rezultatul clinic la diferite momente. Am ajustat acest model cu toate variabilele clinice disponibile prezentate în tabelul 1 pentru a ne asigura că oricare dintre caracteristicile pacientului a fost un factor de confuzie

Pentru a modela componenta longitudinală a datelor, am aplicat un model liniar cu efect mixt luând în considerare un model de creștere condiționată, așa cum se arată în Fig. 10 suplimentară. Pentru a aplica acest model, am folosit pachetul lme4 în R luând în considerare interacțiunea dintre rezultatul clinic și timpul de până la Găsiți asocierea cu bogăția și diversitatea cu timpul fiind un efect aleatoriu.

Pentru a face față faptului că măsurile de diversitate pot fi afectate de problema speciilor lipsă (sunt reprezentate doar o fracțiune de miliarde de celule dintr-un repertoriu) și erorile de secvențiere și experimentale, am efectuat două strategii în plus față de analiza completă a datelor. În primul rând, am folosit instrumentul Recon (reconstrucție a clonelor estimate din numerele observate)29 pentru a rezolva problema speciilor dispărute. Recon este o metodă de probabilitate maximă modificată care emite diversitatea generală a unui repertoriu din măsurători pe un eșantion. Recon produce estimări precise și robuste ale unui set de măsuri de diversitate, inclusiv bogăția și entropia, permițând comparații robuste ale diversității între indivizi. În al doilea rând, am efectuat o strategie de subeșantionare luând un subset aleatoriu de citiri pentru fiecare probă egal cu cea mai mică dimensiune de secvențiere, urmată de recalcularea clonelor de celule B pentru a ajusta în funcție de adâncimea de secvențiere și pentru a trata posibile erori experimentale. Pentru gDNA, există mostre cu citiri foarte scăzute (< 1000),="" iar="" pentru="" a="" evita="" pierderea="" multor="" secvențe="" și="" realitatea="" datelor,="" am="" exclus="" un="" total="" de="" nouă="" mostre="" care=""><1000 reads.="" in="" the="" case="" of="" cdna,="" this="" was="" not="" necessary.="" we="" generated="" ten="" random="" subsamples="" to="" account="" for="" possible="" stochastic="" effects="" and="" performed="" the="" diversity="" analysis="" at="" each="" time="" point="" and="" the="" longitudinal="" data="" analysis="" on="" the="" mean="" value="" of="" ten="" independently="" downsampled="" diversity="">

Analiza rețelei. Algoritmul de generare a rețelei este foarte asemănător cu cel definit anterior31. Pe scurt, fiecare vârf reprezintă o secvență de celule B în care dimensiunea este definită de toate secvențele identice. Marginile sunt calculate utilizând definiția clonei (aceleași segmente V și J, aceeași lungime CDR3 și identitate de nucleotidă de 90% între CDR3) și clusterele reprezintă fiecare clonă din repertoriu. Analiza a fost efectuată utilizând pachetul de grafic în R folosind opțiunea layout_cu_graphopt pentru a genera diagrama.

Pentru a cuantifica rețeaua, am calculat indicele Gini pentru dimensiunea vârfurilor și dimensiunea clusterului. Indicele Gini este o măsură a inegalității utilizată pe scară largă pentru a măsura distribuția bogăției. Măsoară inegalitatea dintre valorile distribuției de frecvență. Am folosit funcția Gini dintr-un pachet din R pentru a calcula coeficientul Gini pentru dimensiunea vârfurilor și distribuția mărimii clusterului. Un coeficient Gini de zero exprimă egalitatea perfectă, iar un coeficient Gini de 1 exprimă inegalitatea maximă.

Analiza clonală. Pentru a studia clonele specifice asociate cu rezultatele clinice, am construit o matrice cu toate clonele care sunt prezente în mai mult de o probă (număr total=118, 223) de către toate probele la fiecare moment de timp. Am studiat apoi asocierea cu rezultatul clinic al fiecărei clone particulare, definind o variabilă per clonă ca prezentă/fără prezentă. În cele din urmă, am aplicat testul exact al lui Fisher pentru a ține seama de semnificația în tabelele 2 × 3 pentru fiecare clonă în fiecare moment de timp. De asemenea, am studiat clonele de persistență definite de acele clone care se află în mai mult de un moment de timp la fiecare individ. Apoi, pentru a explica diferențele în funcție de rezultatul clinic, am aplicat un model liniar care definește ca variabilă dependentă numărul de clone (pentru a măsura diferențele de persistență) și numărul de numărări ale fiecărei clone (pentru a măsura expansiunea clonală) și rezultatul clinic ca un predictor independent.

Analiza utilizării genei IGHV. Pentru a studia genele IGHV, am evaluat utilizarea genei IGHV per probă, deoarece numărul de ori fiecare genă este utilizată normalizat de numărul de clone pentru a evita suprareprezentarea anumitor gene IGHV. Pentru analiza statistică, am filtrat acele gene cu expresie foarte scăzută (utilizare IGHV/clone < {{0}},05)="" în="" cel="" puțin="" 10="" la="" sută="" din="" probe.="" în="" total,="" am="" analizat="" 27="" de="" gene="" ighv="" corespunzătoare="" la="" 63="" de="" probe.="" apoi,="" am="" aplicat="" un="" model="" liniar="" pentru="" a="" găsi="" acele="" gene="" care="" au="" fost="" asociate="" cu="" rezultatul="" clinic="" în="" fiecare="" moment="" și="" am="" corectat="" aceste="" rezultate="" prin="" teste="" multiple="" folosind="" benjamini="" și="" hochberg="" fdr="">< 0,05.="" am="" ajustat="" acest="" model="" cu="" toate="" variabilele="" clinice="" disponibile="" prezentate="" în="" tabelul="" 1="" pentru="" a="" ne="" asigura="" că="" oricare="" dintre="" caracteristicile="" pacientului="" a="" fost="" un="" factor="" de="">

Rezumat raportare. Informații suplimentare despre proiectarea cercetării sunt disponibile în Rezumatul de raportare a cercetării în natură, legat de acest articol.

Referințe

1.Cai,J.& Terasaki,PI Monitorizarea anticorpilor post-transplant și HLA 1.(identificarea epitopului de anticorpi. Curr.Opin.Immunol. 20,602-606(2008).

2. Sigdel, TKet al.Anticorpii non-HLA la epitopii imunogeni prezic evoluția leziunii cronice de alogrefă renală.J. A.m. Soc. Nephrol.23,750-763 (2012).

3. Li, L.et al. Localizarea compartimentală și relevanța clinică a anticorpilor MICA după transplantul renal. Transplant 89,312-319(2010).

4. Lamb, KE, Lodhi, S. & Meier-Kriesche, H.-U.Long-term renal allogref supraviețuire în Statele Unite: O reevaluare critică. Am.J. Transplant. 11, 450-462(2011).

5. Registrul științific al beneficiarilor de transplant. Disponibil la: https://rtr. transplant.hrsa.gov/annual_reports/2012/Default.aspx.(Accesat:24 mai 2018)Pineda, S. et al. Variante noi de antigen de non-histocompatibilitate nepotrivite

6. Îmbunătățirea capacității de a prezice riscul de respingere mediat de anticorpi în cazul transplanturilor de rinichi. Față. Imunol. 8.1687 (2017).

7. Valuiskikh, A.Baldwin, WM & Fairchild, RRLProgres recent și noi perspective în studierea răspunsurilor celulelor T la alogrefe. Am.J. Transplant.10, 117-1125 (2010).

8. Zarkhin, V, Chalasani, G. & Sarwal, MM Yin și yang ale celulelor B în respingerea și toleranța grefei. Transplant. Rev.24,67-78(2010).

9. Georgiou, G. et al. Promisiunea și provocarea secvențierii cu randament ridicat a repertoriului de anticorpi plus. Nat. Biotechnol.32,158-168(2014).

10. Schroeder, HW Similaritate și divergență în dezvoltarea și expresia repertoriilor de anticorpi umani și de șoarece. Dev. Comp. Imunol. 30,119-135(2006).

11. Yaari, G. & Kleinstein, SH Ghiduri practice pentru analiza de secvențiere a repertoriului receptorilor de celule B. Genomul Med.7,121(2015).

12. Shugay, M. și colab. VDJtools: Unificarea post-analiză a repertoriilor receptorilor de celule T. PLOS Comput. Biol.11, e1004503 (2015).

13. Alachkar, H. et al. Caracterizarea cantitativă a repertoriului celulelor T și a biomarkerilor în respingerea transplantului de rinichi. BMC Nephrol.17,181(2016). 14. Morris, H. şi colab. Urmărirea celulelor T reactive la donator: dovezi pentru deleția clonală la pacienții toleranți cu transplant de rinichi. Sci. Transl. Med.7,272ral0 (2015).

15. Dziubianau, M.et al. Analiza repertoriului TCR prin secvențierea de generație următoare permite diagnosticul diferențial complex al patologiei legate de celulele T. A.m. J.Transplant.13,2842-2854 (2013).

16. Palanichamy, A.et al. Celulele B cu schimbare de clasă de imunoglobuline formează o axă imunitară activă între SNC și periferie în scleroza multiplă. Sci. Transl. Med.6, 248ra106-248ra106(2014).

17. Strauli, NB & Hernandez, RDStatistical inferența unui răspuns convergent de repertoriu de anticorpi la vaccinul antigripal. Genomul Med. 8,60 (2016).

18. Roskin, KM şi colab. Secvențele IgH în deficiența imună variabilă comună relevă dezvoltarea și selecția celulelor B alterate. Sci. Transl. Med.7,302ra135 (2015).

19.Massart, A.,Ghisdal,L.,Abramowicz, M.& Abramowicz,D.Toleranța operațională în transplantul de rinichi și biomarkeri asociați. Clin. Exp. Immunol.189,138-157(2017).

20. Beausang, JFet al. Repertorii de celule B în candidații de transplant de rinichi sensibilizați la HLA, supuși terapiei de desensibilizare.J. Transl. Med.15, 9 (2017).

21. Ferdman, J. şi colab. Expansiunea și hipermutația somatică a clonelor de celule B în grefe de rinichi umani respinse.Transplantation 98,766-772(2014).

22. Vollmers, C. et al. Monitorizarea imunosupresiei induse farmacologic prin secvențierea repertoriului imun pentru a detecta respingerea acută a alogrefei la pacienții cu transplant de inimă: Studiu de acuratețe a diagnosticului cu dovezi de concept.PLOS Med. 12,e1001890 (2015).

23. Solez, K. et al. Raportul întâlnirii Banff'05: Diagnosticul diferențial al leziunii cronice de alogrefă și eliminarea nefropatiei cronice de alogrefă (CAN). A.m. J. Transplant.7,518-526(2007). imunosupresia în transplantul de rinichi: este timpul să o considerăm ca o terapie standard? Kidney Int.76,825-830(2009).

28. Legendre, C. et al. Rezultatele de trei ani la pacienții cu transplant de rinichi randomizati la imunosupresie fără steroizi sau sevraj de steroizi, cu micofenolat de sodiu acoperit enteric și ciclosporină: studiul infinit. J. Transplant.2014,1-8(2014).

29. Kaplinsky, J. & Arnaout, R. Estimări robuste ale diversității generale a repertoriului imunitar din măsurători cu randament ridicat pe probe. Nat. Commun.7, 11881(2016).

30. Stern, JNHet al. Celulele B care populează creierul de scleroză multiplă se maturizează în ganglionii limfatici cervicali drenați. Sci. Transl. Med.6,248ra107 (2014).

31. Bashford-Rogers, RJMet al. Proprietățile rețelei derivate din secvențierea profundă a repertoriilor receptorilor de celule B umane delimitează populațiile de celule B. Genome Res.23,1874-1884 (2013).

32. Sarwal, Met al. Heterogenitatea moleculară în respingerea acută a alogrefei renale

identificate prin profilarea de microarray ADN. N.Engl.J. Med.349,125-138(2003). 33.Zarkhin, V., Lovelace, PA, Li, L., Hsieh, S.-C. & Sarwal, MMPenotipică Evaluarea subgrupurilor de celule b după rituximab pentru tratamentul respingerii acute a alogrefei renale la primitorii pediatrici. Transplant 91,1010-1018 (201).

34. Clatworthy, MR& Targeting, B. Celulele și anticorpii în transplant.Amm. J. Transplant.11,1359-1367 (2011).

35. Dijke,EIet al.Bcells in transplantation.J. Heart Lung Transplant.35,704-710(2016).

36. Nankivell, BJ & Kuypers, DR Diagnosticul și prevenirea pierderii cronice de alogrefă renală. Lancet 378,1428-1437(2011).

37. Patin, E. et al. Variația naturală a parametrilor celulei imune înnăscute este determinată de factori genetici. Nat.Immunol.19,302-314(2018). 38. Liston, A. & Goris, A. Originile diversității în imunitatea umană.Nat. Imunol. 19,209-210(2018).

39. Meier-Kriesche, H.-U, Schold, JD, Srinivas, TR& Kaplan, B. Lipsa de îmbunătățire a supraviețuirii alogrefei renale în ciuda unei scăderi marcate a ratelor de respingere acută în cea mai recentă epocă.Am.J. Transplant.4,378-383 (2004).

40. Keith, DS, Vranic, G. & Nishio-Lucar, A. Funcția grefei și rezultatele pe termen mediu ale transplanturilor de rinichi s-au îmbunătățit în ultimul deceniu: Analiza bazei de date a transplantului de rinichi din Statele Unite. Transplant. direct 3,el66 (2017).

41. Bomben, R. şi colab. Exprimarea genelor IGHV3-23 mutante în leucemia limfocitară cronică identifică un subgrup de boală cu caracteristici clinice și biologice deosebite. Clin. Cancer Res. 16,620-628(2010).

42. Levinson, AI, Kozlowski, L, Zheng, Y. & Wheatley, L. Superantigenele celulelor B: definiție și impact potențial asupra răspunsului imun.J. Clin.Immunol.15, 26S-36S(1995.

43. Silverman, GJ & Goodyear, superantigenul celulelor B model CSA și imunobiologia limfocitelor B. Clin.Immunol.102,117-134(2002).

44. Silverman, GJ & Goodyear, CSConfundarea apărării celulelor B: lecții de la un superantigen stafilococic. Nat. Rev. Immunol.6,465-475(2006). 45. Cheng, J.et al. Grupurile de celule B ectopice care se infiltrează în rinichii umani transplantați sunt clonale. Proc. Natl Acad. Sci. 108,5560-5565 (2011).

46. ​​Grover, RKet al. Imunogenul costimulator LPS induce clonele de celule B care se infiltrează în rinichii umani transplantați. Proc. Natl Acad. Sci. SUA 109, 6036-6041(2012).

47,Modena,BDet al. Modificările în populațiile microbiomului urinar se corelează în transplanturile de rinichi cu fibroza interstițială și atrofia tubulară documentate în biopsiile de supraveghere timpurie. A.m. J. Transpl.17,712-723 (2017).

48. Chen, K. & Cerutti, A. Noi perspective asupra enigma imunoglobulinei D. Immunol. Rev. 237,160-179 (2010).

49. Chen, K. şi colab. Imunoglobulina D îmbunătățește supravegherea imună prin activarea programelor antimicrobiene, proinflamatorii și de stimulare a celulelor B la bazofile. Nat. Imunol. 10, 889-898(2009).

50. Mack, M. & Rosenkranz, AR Bazofile și mastocite în leziunea renală.KidneyInt.76,1142-1147 (2009).

51. Nixon, DFet al. Urmărirea moleculară a unui virus al imunodeficienței umane

Clona de celule T citotoxice specifice nef arată persistența ADN-ului receptorului de celule T specific clonei, dar nu ARNm în urma terapiei antiretrovirale combinate precoce.Immunol. Lett.66,219-228(1999).

52. Dharnidharka, VR, Fiorina,P.& Harmon, WEKidney transplantation in children.N.Engl. J. Med. 371,549-558(2014).

53. Sarwal, MMet al. Evitarea completă a steroizilor este eficientă și sigură la copiii cu transplant renal: un studiu randomizat multicentric cu o urmărire de trei ani. Am.J.Transplant.12,2719-2729(2012).

24. Solez, K. et al.Banff 07 clasificarea patologiei alogrefei renale: actualizări și direcții viitoare. Am.J.Transplant.8,753-760 (2008).

54. Li, L şi colab. Imunosupresie fără steroizi din 1999:129 transplanturi renale pediatrice cu grefă susținută și beneficii pentru pacient. Am.J. Transpl. 9, 1362-1372(2009).

25. Chaudhuri, A.et al. Impactul clinic al imunității umorale în transplantul renal pediatric.J. A.m. Soc.Nephrol.24,655-664 (2013).