Studiul profilului chimic și al metaboliților de Cistanche Deserticola brută și prelucrată la șobolani de către UPLC-Q-TOF-MSE

emailul de contacttina.xiang@wecistanche.compentru mai multe informatii

Abstract

fundal: Prelucrarea materiei medicale chineze este o tehnică farmaceutică distinsă și unică în medicina tradițională chineză (TCM) utilizată pentru reducerea efectelor secundare și pentru creșterea sau chiar modificarea eficacității terapeutice a ierburilor crude. Modificările componentelor esențiale induse de o procedură de procesare optimizată sunt în primul rând responsabile pentru creșterea eficacității plantelor medicinale. Efectul revigorant al rinichilor-yang al vinului de orez fiert la aburCistanche deserticola(C.deserticola) a fost mai puternic decât C.deserticola brută (CD).

Metode: A fost efectuată o analiză de comparație folosind UPLC-Q-TOF-MS cu platforma informatică UNIFl pentru a determina influența prelucrării. Au fost efectuate studii in vitro pentru caracterizarea constituenților precum șimetabolițiin vivo. Componentele chimice au fost determinate în CD și produsele sale prelucrate. Analizele statistice multivariate au fost efectuate pentru a evalua variațiile dintre ele, în timp ce OPLS-DA a fost utilizat pentru compararea perechilor.

Rezultate: Rezultatele acestui studiu au relevat variații considerabile ale glicozidelor feniletanoide (PhG) șiiridoideledupă prelucrare. Un total de 97 de compuși au fost detectați în extractele de CD și produsul său procesat. PhG-urile care au grupa 4-O-cafeoil în partea 8-O{- -D-glucopiranozil, cum ar fi actozida, cistanozida C, campneozida Il, osmantuzida au scăzut după procesare, în timp ce PhG-urile cu 6' Gruparea -O-cafeoil din partea 8-O{- -D-glucopiranosil, cum ar fi izoacetozida, izocistanozida C, izocampneozida l, izomartinozida a crescut, în special în grupul CD-NP. De asemenea, a crescut intensitatea echinacozidei și cistanozidei B a căror structură posedă porțiune 6'-O- -D-glucopiranozil. În studiul in vivo, 10 componente prototip și 44 de metaboliți au fost detectați în plasma de șobolan, fecale și urină. Rezultatele obţinute au arătat că procesarea conduce la variaţia considerabilă a constituenţilor chimici ai CD şi a afectat dispunerea compuşilor in vivo, iar procesele metabolice de fază Ⅱ sunt cascadele cheie ale fiecărui compus, iar majoritatea metaboliţilor sunt asociaţi cu echinacozidul sau acteozid.

Concluzii: Aceasta este prima cercetare comparativă globală a CD-urilor brute și procesate. Aceste constatări adaugă la înțelegerea noastră asupra impactului procesării CD-urilor și oferă date importante pentru investigațiile viitoare de eficacitate.

Cuvinte cheie: Cistanche deserticola, Procesare, UPLC-Q-TOF-MS5, Profile chimice, Metaboliți in vivo

Introducere

Procesarea materiei medicale chineze (CMM) a demonstrat o aplicabilitate semnificativă în practica clinică a medicinei tradiționale chineze (MTC) și a fost considerată un tratament viabil de câteva secole. Aceasta este o tehnologie farmaceutică unică care a fost derivată din teoria MTC. În urma procesării, au fost identificate diferențe semnificative în aspectul, constituenții chimici, caracteristicile și semnificația medicinală a tuturor tipurilor de MTC, ceea ce duce la presupunerea că prelucrarea ar putea îmbunătăți eficacitatea sau reduce efectele toxice ale MTC.

Pentru sute de ani,Cistanche deserticola(Rou Cong Rong în chineză, CD) este folosit în mod obișnuit în practica clinică MTC pentru completarea funcțiilor rinichilor. De asemenea, ajută la hidratarea intestinului, ceea ce duce la relaxarea intestinului [1].Cistanchea fost înregistrat pentru prima dată în ShenNongBencaoJing. Se găsește frecvent în habitatele aride și semi-aride din Eurasia și Africa de Nord, inclusiv Iran, China, India și Mongolia [2]. Prelucrarea CD a fost efectuată prin aburire cu vin de orez la presiune normală, care este o metodă de preparare documentată în farmacopeea chineză (Jiucongrong în chineză, denumită în continuare „CD-NP”). Iar aburirea CD cu vin de orez la presiune ridicată este o metodă de preparare mai eficientă (denumită în continuare „CD-HP”) [3, 4]. Mai multe studii au fost dezvăluite că efectele farmacologice ale CD sunt diferite de produsele sale procesate [5]. CD-ul poate tonifica yang-ul rinichilor și relaxa intestinul, în timp ce, după ce a fost aburit de vinul de orez, efectul de completare a yang-ului rinichilor ar fi întărit. În studiul nostru anterior, s-a descoperit că CD-NP ar putea îmbunătăți tonifcarea rinichilor și poate sprijini yang-ul și ameliorează efectul de umezire a intestinelor și defecare [6-8]. În practica clinică, produsele procesate sunt cea mai frecvent utilizată formă.

Până în prezent, mai multe studii au analizat componentele chimice ale CD, urmate de izolarea și identificarea a peste 100 de compuși [9–11], cum ar fi glicozidele de feniletanol (PhGs),iridoidele, lignani și oligozaharide ca constituenți chimici principali. De asemenea, s-a raportat că există multe activități farmacologice ale PhG, inclusiv imunomodulatoare, neuroprotectoare, hepatoprotectoare, antiinflamatorii, antioxidative etc.[12–14]. Iridoizii posedă activități antiinflamatorii [15, 16]. De asemenea, a fost relevat de studiile anterioare că unele componente chimice au prezentat variații în timpul procesării [17–20]. Pe baza acestor rapoarte, se poate presupune că după procesare, variațiile în compoziția chimică conduc la diferite efecte farmacologice, care trebuie explorate în continuare.

În studiul curent, a fost efectuată o metodă sensibilă și eficientă, adică cromatografia lichidă de ultra-înaltă performanță cuplată cu TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE) pentru analiză comparativă și au fost efectuate studii in vitro pentru a analiza calitativ extractele. de CD, CD-NP și CD-HP pentru elucidarea profilurilor lor chimice. În general, substanțele chimice exogene cu expunere ridicată în organele țintă au fost considerate componente eficiente. Prin urmare, la șobolani, CD și produsele sale procesate au fost administrate oral, respectiv, urmate de caracterizarea lor. Studiul existent relevă pentru prima dată un studiu comparativ (atât in vitro, cât și in vivo) al CD-ului brut și procesat. Rezultatele obținute ne-ar extinde înțelegerea cu privire la efectul procesării CD, ceea ce ar putea fi util pentru studii ulterioare.

Materiale și metode

Materiale

Compușii standard de ajugol (180120) și 2’-acetil-acetozidă (M0601AS) au fost furnizați de Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, China). Cistanozida F(MUST-17022620), echinacozida (D1105AS), partea cistano A(M0906AS) și izoacteozida (M0106AS) au fost furnizate de compania Must (Sichuan China);acteozida (O0618AS), salidrozida (J0526AS), catalpol (S0728AS), geniposida (A0407AS) și acidul genipozidic (MB6001-S) au fost achiziționate de la Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Dalian, China).8-acidul oxiloganic epidei (B31123) a fost obţinut de la Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, China. Metanolul și acetonitrilul au fost de calitate MS și au fost obținute de la Merck KGaA, Darmstadt, Germania. Acidul metanoic (CH, O,) de gradul HPLC a fost furnizat de Merck KGaA (Darmstadt, Germania). Apa utilizată în studiul existent a fost procesată prin sistemul Milli-Q (18,2 MQ, Millipore, Ma, SUA). Vinul de orez a fost furnizat de Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, China).

Cistanch deserticola a fost colectat de la Neimenggu wangyedi cistanche Co.Ltd. Probele au fost identificate de prof. Yanjun Zhai (școala de farmacie, Universitatea Liaoning din TCM). Specimenele au fost trimise la Universitatea de Medicină Tradițională Chineză Liaoning.

animale

Șobolani masculi Sprague-Dawley (grad SPF) cu 180-220 g greutate corporală totală au fost furnizați de Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Centrul de resurse animale de laborator al provinciei Liaoning, numărul de licență: SCXK-2015-0001). Acești șobolani au fost găzduiți într-o cameră de reproducere cu temperatură și umiditate bine întreținute, adică 20-26 de grade, 50-70 la sută timp de o săptămână. Șobolanii au fost hrăniți cu hrană obișnuită de laborator și apă înainte de experimentare. Animalele au postit peste noapte, cu toate acestea, apa ad libitum a fost furnizată înainte de experimentare. Sobolanii au fost executati cu un anestezic de hidrat de cloral de 10%. Comitetul instituțional de etică a animalelor al Spitalului Provincial de Medicină Chineză Liaoning a aprobat toate protocoalele experimentale (2019.3.25, 2019015).

Prepararea extractului de CD, CD-NP și CD-HP

CD-NP, CD-HP au fost prelucrate din același lot de Cistanch deserticola. Pentru a prepara CD-NP, bucăți CD uscate (5 mm grosime, 100 g) au fost hidratate cu vin de orez (30 ml) și au fost aburite la 100 de grade timp de 16 ore, urmate de uscare la 55 de grade prin cuptor de uscare. În timp ce CD-HP a fost preparat prin infiltrarea bucăților CD uscate (5 mm grosime, 100 g) cu vin de orez (30 ml), urmată de abur la 1,25 presiune atmosferică timp de 4 ore. si apoi uscat intr-un cuptor de uscare la 55 de grade.

Într-un balon dozator de 100 ml, un gram de pulbere a fost cernut prin sita #4, urmată de adăugarea a 50% metanol (50 ml) și apoi acoperit strâns și amestecat. Acest amestec a fost cântărit, urmat de jumătate de oră. macerare. După macerare, amestecul a fost ultrasunet (putere 250 W, frecvență 35 kHz) timp de 40 de minute, urmat de răcire și cântărire din nou. Pierderea în greutate a fost completată cu 50% metanol, amestecată corespunzător și lăsată să stea, urmată de filtrarea supernatantului și apoi utilizarea filtratului obținut ca soluție de testare.

Analiza MSE a componentelor active

Prepararea substanțelor standard: tubulozid-A (3,02 mg), echinacozidă (3,00 mg), 2'-acetilacteozidă (2,34 mg), acteozidă (2,45 mg), izoacteozidă (0,61 mg), cistanozid-F (2,14 mg), salidrozidă (3,39 mg), genipozidă (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), catalpol (2,39 mg), acid geniposidic (2,56 mg) și 8-epideoxiloganic acid (2,34 mg) s-au adăugat într-un recipient volumetric de 10 mL, s-au adăugat metanol în volum constant la scară, s-au configurat într-o soluție de referință de concentrație corespunzătoare. Fiecare dintre cei 100 μL a fost configurat într-o soluție de referință mixtă.

Condiția analizei MS: valoarea masei a fost corectată înainte de experiment și a fost utilizat modul ion negativ. Intervalul de masă a fost 50–1200 Da, iar proba a fost injectată printr-o pompă de injecție cu debit. Viteza conului a fost de 100 L/h, debitul de dizolvant a fost stabilit la 800 L/h. Tensiunile capilare și conice au fost fixate la 2500 și 40 V, în consecință. Temperatura sursei de ioni și a gazului dizolvant a fost de 100, respectiv 400 de grade, iar frecvența de achiziție a semnalului a fost de 0,5 S-1.

Analiza UPLC-Q-TOF-MS a extractului de CD (15-16 min), 65 la sută până la 55 la sută A (16-18 min). Debitul a fost de 0,3 mL min-1, în timp ce temperatura camerei autosampler și a coloanei a fost de 30 grade și 8 grade separat. Volumul de injectare a fost de 1,0 μL.

Evaluarea spectrometrică de masă a fost efectuată prin Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, SUA), cuprinzând o sursă ESI. Debitul de azot gazos a fost fixat la 800 L·h-1 cu o temperatură de 400 grade, temperatura sursei a fost fixată la 100 grade, iar gazul conic a fost stabilit la 50 L h-1. Tensiunea conului și a capilarului a fost ajustată la 40 și 2000 V, în consecință. Energia de coliziune a rampei a fost utilizată în intervalul 20–30 V. Datele cu centroidă ale tuturor probelor au fost obținute de la 50 la 1200 Da, cu un timp de scanare 5-de 0,5 s pe un timp de analiză de 10 min. . LockSpray TM a fost folosit pentru validarea preciziei masei. Ca masă de blocare a fost utilizat ionul Te ​​[M–H]- al leucină encefalinei (200 pg·μL-1 debit de perfuzie 10 μL min-1) la m/z 554,2615. Software-ul MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, SUA) a fost utilizat pentru masa precisă, compoziția ionilor precursori și calculul ionilor de fragment.

Analiza datelor pe platforma Masslynx

În plus, pe baza literaturii de specialitate a fost creată o bibliotecă internă care cuprinde numele compusului, structura acestuia și formula moleculară (în mol.). Toți compușii au fost notați într-un șablon special, realizat în Excel. În plus, fișierele mol (Chemdraw Ultra 8.0, Cam-bridge soft, SUA) și fișierele Excel ale tuturor structurilor compuse individuale au fost, de asemenea, salvate pe computerul local. Foaia Excel stabilită cu date importante a fost importată direct în biblioteca științifică din UNIFI

UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, Marea Britanie a fost folosit pentru evaluarea caracteristicilor structurale, în special pentru fragmentele caracteristice și fragmentarea MS. A fost setată o zonă minimă de vârf de 500 pentru detectarea vârfului 2D. În timpul dezvăluirii vârfurilor 3D, au fost alese o intensitate de vârf de energie scăzută, de peste 300 de numărări, și o intensitate de vârf de energie ridicată de peste 80 de numărări. Eroarea de masă a fost găsită a fi de până la ± 10 ppm pentru compușii cunoscuți, iar toleranța timpului de retenție a fost stabilită în intervalul de ± 0,1 min. Am selectat aductii negativi care conțin -H, plus HCOOH. Prelucrarea datelor brute obținute de la MS a fost efectuată prin intermediul software-ului UNIFI simplificat pentru a identifica rapid componentele chimice care au îndeplinit standardele cu baza de date auto-construită și Biblioteca internă de medicină tradițională.

Apoi, pentru a verifica structura chimică a fiecărui compus țintă, izomerii s-au distins prin modelele lor caracteristice de fragmentare MS care au fost relevate în studiile raportate și prin compararea timpilor de retenție ai standardelor de referință.

Analiza metabolomica bazata pe analiza statistica multivariata

Înainte de procesarea datelor brute, parametrii au fost setați, cum ar fi masa cuprinsă între 150 și 1200 Da, intervalul timpului de retenție (0 până la 20 min), intensitatea pragului ( 2000 de numărări), toleranță la masă, adică 5 MDA, în timp ce fereastra de masă și timp de retenție a fost de 0,20 min și, respectiv, 0,05 Da. În lista ulterioară a bazei de date, identificatorul ionilor a fost perechile RT-m/ în raport cu timpii lor de eluție. Aceleași valori pentru RT și m/z în diferite loturi de probe au fost considerate ca același compus.

Analiza statistică multivariată a fost efectuată pentru a evalua biomarkerii eficienți care au contribuit considerabil la variațiile între diferite grupuri. În timpul analizei, analiza componentelor principale (PCA) a fost folosită pentru a indica diferențele maxime și recunoașterea modelelor pentru obținerea unei imagini de ansamblu și clasificare. OPLS-DA este un instrument de modelare care oferă vizualizarea încărcării componentei predictive OPLS-DA pentru a ajuta la evaluarea modelului. Importanța variabilă pentru proiecție (VIP) a fost utilizată pentru evaluarea evaluării diferitelor componente, iarmetabolițiwith VIP values>1.0 și valoarea P<0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r²/o²values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

Șobolanii din experimente pe animale au fost clasificați aleatoriu în patru grupuri (n{0}} pentru fiecare grup), urmate de administrarea orală a diferitelor extracte: (1) Grup martor martor: șobolanii au primit soluție salină normală (2 ml/100 g) ; (2) grup CD: șobolanilor li sa dat extract CD (2 mL/100 g); (3) Grupul CD-NP: șobolanilor li s-a administrat extract CD-NP (2 mL/100 g); (4) Grupul CD-HP: șobolanilor li sa dat extract CD-HP (2 mL/100 g). Categorizarea ulterioară a tuturor grupurilor a fost efectuată în trei subgrupe pentru plasmă, urină și fecale, în consecință. Două ore mai târziu, fiecare șobolan a fost administrat oral cu aceeași cantitate și egală de extracte.

După administrare, recoltarea probelor de sânge a fost efectuată la 1,0 h, 2,0 h și 4,0 h în tuburi de polietilenă heparinizate de 1,5 ml (din venele orbitale) , urmată de centrifugare (la 4500 rpm) a tuturor probelor timp de 15 min.

Pentru probele de urină și fecale, șobolanii au fost ținuți în cuști de metabolism, iar apoi colectarea probelor de urină și fecale a fost efectuată timp de 24 de ore după administrare. Centrifugarea probelor de urină a fost efectuată la 4500 rpm timp de 15 min, în timp ce probele de fecale au fost uscate la umbră, măcinate în pulbere, apoi au fost prelevate 0,2 g și adăugate în 0,5 ml ser fiziologic. soluție, ultrasunete timp de 5 minute și centrifugate la 12,000 rpm timp de 15 minute. Toate probele biologice au fost păstrate la -80 de grade până la analiză.

Pregătirea probelor biologice. Adăugarea probelor de plasmă, urină și fecale a fost efectuată cu 3 volume de metanol, urmată de agitare în vortex timp de 3 minute. Apoi, centrifugarea (la 12,000 rpm) a amestecurilor a fost efectuată timp de 10 minute, urmată de transferarea supernatantului în tubul EP și apoi uscat cu azot la 37 de grade. În plus, a fost efectuată adăugarea a 200 μL de soluție de HCN-H2O (50 la sută). Zece, vortexul a fost folosit pentru amestecare (1 min), urmat de centrifugare (la 12,000 rpm) timp de 5 min. Supernatantul (5 μL) al probelor tratate a fost injectat în sistemul UPLC-Q-TOF-MSE.

Condiție cromatografică lichidă și spectrometrică de masă Analiza ptmetaboliția fost realizată și de instrumentul Waters UPLC printr-o interfață ESI. Separările au fost efectuate folosind o coloană Acquity UPLC HSS T3 (100 mm x 2,1 mm, 1,8 µm), faza mobilă a fost acid formic 0,1 procente (A): acetonitril (B), starea de eluare a gradientului a fost de 0-3 min (99,8 la sută →98 la sută A).3-5 min (98 la sută →95 la sută A),5-8 min (95 la sută →90 la sută A), 5-8 min (95 la sută →90 la sută A), { {18}} min (90 la sută →85 la sută A),12-17 min (85 la sută →70 la sută A), 17-22 min (70 la sută →60 la sută A), 22-23 min. (60 la sută →58 la sută A), 23-25 min (58 la sută A),25-32 min (58 la sută →45 la sută A) și 32-37 min (45 la sută →35 la sută A) ),0,4 ml min-1 a fost debitul. Temperatura pentru coloană și camera de probă a fost stabilită la 40 de grade și, respectiv, 8 grade. Au fost utilizate condițiile de spectrometrie de masă menționate mai sus.

Strategia de analiză sistematică a metaboliților din probele biologice a fost utilizat software-ul UNIFI (1.8.2) pentru prelucrarea datelor. Funcția Binary Compare a fost utilizată pentru identificarea metaboliților eficienți. Metaboliții evaluați nu existau în proba de control echivalentă sau există la intensități scăzute ale ionilor. Pragul de intensitate relativă a fost stabilit la 3 sau 5, iar metaboliții care au îndeplinit criteriile subliniate au putut fi evaluați. Metaboliții comuni și previzibili au fost apoi determinați prin EIC. Pentru căutarea metaboliților în două faze, a fost aplicată funcția NLF. De exemplu, în software-ul UNIFI, parametrii ar putea fi setați la 176.0321 pentru căutarea posibililor conjugați de acid glucuronic. După procesare, o pierdere neutră poate fi setată în metodă sau identificată. MassFragment a fost utilizat pentru determinarea sau caracterizarea structurilor metaboliților detectați, funcția de interpretare spectrală a UNIFI este funcția principală utilizată pentru analiza fragmentării secundare a componentelor părinte. Această funcție poate fi utilizată pentru verificarea rapidă a căii de fragmentare dacă este rezonabil.

Rezultate

Regula de fragmentare în masă a glicozidelor feniletanoide și a iridoidelor

Glicozidele feniletanoide sunt principalii constituenți chimici ai CD. Soluțiile standard de izoacteozidă,

S-au luat cistanozide F, tubulozide A, echinacozide, acteozide și 2’-acetil-acteozide, urmate de furnizarea unui nivel diferit de energii de coliziune (Tabelul 1), iar apoi s-au obținut hărțile MS2 corespunzătoare (Fig. 1).

Analiza spectrometrică de masă a arătat că glicozidele feniletanoide au modele similare de fragmentare a spectrului de masă, căile de scindare în modul de ioni negativi includ în principal (1) scindarea legăturii ester: pierderea grupării cafeoil neutre (C, H, O162.03) și acetil neutru. grupa (C, H, O,42.00);(2) Scindarea glicozidică: pierderea reziduurilor neutre de ramnoză (C.HIO, 146,05) și a resturilor neutre de glucoză (CgHO, 162,05). Din spectrometria de masă de înaltă rezoluție se pot distinge cafeoil (162,03) și reziduuri de glucoză (162,05).

Au fost luate soluții standard de ajugol, catalpol, acid geniposidic, geniposid și 8-epide epide oxiloganic, urmate de furnizarea de diferite energii de coliziune și s-au obținut hărțile MS corespunzătoare (Fig. 2).

Glicozidele iridoide au modele similare de fragmentare a spectrului de masă, căile de scindare în modul de ioni negativi includ în principal (1) Clivaj glicozidic: Pierderea reziduului neutru de glucoză (CHoO, 162,05); (2) Pierderea CO neutru, (43,99) și H , O(18,01).

Identificarea compușilor din extractele CD, CD-NP și CD-HP

Analiza UPLC-QTOF-MSE

S-a realizat optimizarea condițiilor cromatografice. În continuare, compușii lui CistancheHerba au fost evaluați atât în ​​moduri de ioni negativi, cât și pozitivi, cu CE ridicate și scăzute. Rezultatele obținute au arătat că compatibilitatea modului negativ a fost mai mare față de modul pozitiv pentru acești compuși. Figura 3 a arătat cromatograma MS peak bazic ion (BPI) trasată cu vârfuri numerotate. Intensitatea fiecărui ion detectat în analiza UPLC-Q-TOF-MS a fost normalizată în raport cu întregul număr de ioni pentru generarea unei matrice de date care a cuprins valoarea m/z, zona de vârf normalizată și timpul de retenție.

Evaluarea componentelor din CD și a produselor procesate ale acestuia pe platforma UNIFl

Un total de 97 de compuși au fost identificați cu modul -SEM (n=6) din CD și produsul său procesat (Tabelul 2), inclusiv glicozide feniletanoide (PhGs), iridoizi, lignani și oligozaharide. Componentele 95, 91 și 94 au fost detectate în CD, CD-NP și CD-HP în consecință. Dintre aceștia, 64 au fost feniletanoizi, 13 au fost iridoizi și au fost determinate alte 20 de tipuri de compuși. A existat o asemănare în compoziția chimică a CD-ului și a produsului său procesat, cu toate acestea, s-a constatat că cantitatea de componente este diferită între CD și produsul său procesat.

Variații ale componentelor chimice ale produselor procesate Software-ul Simca-P 13.0 a fost utilizat pentru analiza matricei de date multivariate. Înainte de PCA, toate variabilele erau centrate pe medie și scalate Pareto, urmate de identificarea potențialelor variabile discriminante. Într-un grafic scor PCA, fiecare punct a arătat un eșantion individual. Probele care au arătat similarități în componentele lor chimice au fost împrăștiate unul lângă celălalt, în timp ce cele care au prezentat variații în componentele lor au fost împărțite. După cum se vede în PCA (Fig.4), grupul de CD-HP a fost separat de grupurile de CD și CD-NP.

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs.5, 6,7)The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP>1 și P<0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Din Fig.8, am găsit intensitatea acteozidei(54), cistanozidei C(74), campneozidei I(43), osmantuzidei (75) și 2’-actylacteoside(80) având grupa 4’-O-cafeoil în partea 8-O{- -D-glucopiranozil (vezi fig. 9) a scăzut după ce a fost procesată de vinul de orez, în timp ce intensitatea izoacetozidei (60) este castanozida (71), izo-campneozida I (69), izomartinozida (86) având gruparea 6'-O-cafeoil (vezi Fig. 9) a crescut, în special pentru gruparea CD-NP. Deși tubulozida B (72) are o grupare 6’-O-cafeoil, la fel ca izoacteozida, intensitatea a scăzut din cauza grupării sale 2’-acetil. Intensitatea echinacozidei (38) și cistanozidei B având grupări 6'-O- -D-glucopiranosil a crescut, dar intensitatea tubulozidei A (55) a scăzut și din cauza grupării sale 2'-acetil.

Echipa noastră de cercetare a studiat, de asemenea, stabilitatea termică a acteozidei și izoacteozidei și a constatat că actoside-ul este instabil în apă, metanol și soluție de vin de orez galben și poate fi transformat în izoacteozidă parțial în condiții de încălzire. Dar termostabilitatea izoacteozidei a fost mai bună, mai ales în soluția de vin de orez galben. Figura 10 a arătat posibilele modificări ale PhG în CD în timpul procesării:

Identificarea metaboliților la șobolani Din datele de spectrometrie de masă de înaltă rezoluție, greutatea moleculară exactă și compoziția elementară pentru metaboliți și compuși protomolecule au fost analizate și comparate. Deoarece aceleași tipuri de compuși din TCM au arătat similitudini în modificările metabolice, corelațiile constituenților fitochimici in vitro se pot extinde la metaboliții lor in vivo. Între timp, pe baza căilor convenționale de biotransformare, a fost dedusă o modificare rezonabilă a greutății moleculare. În cele din urmă, metaboliții au fost identificați prin analiza spectrelor de masă MSE ale metaboliților și căii de fragmentare a proto-compușilor în spectrul de masă [21, 22]. În comparație cu proba martor, componentele sale au fost identificate in vivo pe baza informațiilor furnizate de cromatogramă-spectrul de masă, posibilitatea unei reacții metabolice, caracteristicile structurii compusului și regula de fragmentare a spectrului său de masă. Vezi tabelul 3.

Identificarea metaboliților înrudiți cu feniletanol glicozide

Platforma UNIFI a fost folosită pentru procesare. Figura 11 a arătat cromatograful TIC al urinei, fecalelor și plasmei pentru CD și produsele sale procesate. Comparativ cu probele martor, un total de 54 de metaboliți au fost identificați la șobolani, inclusiv 10 componente prototip și 44 de metaboliți, în care 24, 49 și 6 au fost în fecale, urină și plasmă, în consecință.

Pe baza masei precise, a cascadei de fragmentare și a pierderilor neutre previzibile prin biotransformare, au fost evaluați provizoriu un total de 35 de metaboliți asociați cu glicozide feniletanoide. Metaboliții înrudiți ai glicozidelor feniletanoide au modele similare de fragmentare a spectrului de masă, cum ar fi fragmentul tipic decafeoil m/z 461,1605, apoi hidrolizați în continuare prin legături glicozidice și esterice in vivo și metabolizați în hidroxitirosol (HT)(m/). z153,0504, C.HO.4,73 min) și acid cafeic (CA) (m/z179,0389, CH, O0,77 min), vezi Fig.12A.

M11 a indicat [MH]~ la m/153,0504 cu formula adică, C.HO, şi identificat ca HT. M16 a prezentat [MH]- la m/z 329,0851, care a fost cu 176 Da crescut decât cel al HT, dezvăluind că ar putea fi un metabolit glucuronitat al HT. [MH]-al M26 a fost la m/z 343,1037,14 Da mai mare decât cel al HT-glucuronidei. Prin urmare, M26 a fost identificat ca glucuronid HT-metilat. M17 a fost identificat ca HT-sulfat pe baza sa [MH]-la m/z 233,0112,80 Da peste HT, care ar putea fi metilat în continuare, apoi a produs M22, care a arătat m/z 247,0278, indicând că a fost HT- metabolit sulfatat metilat. M7 (m/167,0335) și M5 (m/z 167,0762) au fost considerate ca produși de oxidare și, respectiv, HT metilat (Fig.12B).

M1 a indicat [MH]- la m/z 179,0389, formula moleculară elucidată a fost CH-O și identificat ca acid cafeic (CA). că ar putea fi un metabolit glucuronizat al CA. M27 a avut m/z 258,994, care a fost cu 80 Da mai mare decât cel al CA, așa că l-am elucidat ca sulfat de CA și ar putea produce M35 (m/z 273,0064). Deoarece M4 dă [MH]7 la m/z 193,0524,14 Da mai mare decât CA, a fost identificat ca metabolit metilat de CA. M39 a fost metabolit de dehidroxilare a CA, cu m/z 163,04 și ar putea fi sulfatat în M32 (m/z 242,9951).

M33(m/z 181.0491, C.HO, 9,06 min) a fost produsul de reducere al CA, adică acidul 3,{4-dihidroxi-benzenpropionic, care ar putea fi metilat în M19 (m /z 195,0623, C10H1204, 0,93 min). M33 ar putea fi deshidratat în M43, adică 3-HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 min) și M31 (m/z 341,0942, C15H17O9, 8,90 min) și M29 (m/z 01265, C01265 8,52 min) au fost produșii glucuronidați și sulfatați (Fig. 12C).

Pentru metaboliții asociați cu glicozide feniletanoide, cascadele metabolice cheie au fost reacțiile metabolice de fază II, adică glucuronidarea, metilarea și sulfatarea. Cascadele metabolice propuse de feniletanoizi sunt prezentate în Fig. 13.

Identificarea metaboliților înrudiți cu iridoizi

Prin analiza compoziției elementare a metaboliților, fragmentarea MSE și literatura asociată, au fost evaluați în mod provizoriu un total de 19 metaboliți asociați iridoid. Glicozidele iridoide au fost hidrolizate prin legături glicozidice pentru a forma agliconii corespunzătoare. M/z 185,117 a fost pentru M8, 162 Da mai mic decât ajugol, care a fost obținut prin pierderea reziduului de glucoză.

M40 (m/z 199,0641, Rt 10,91 min) a fost produsul glicozilat al catalpolului. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 min) a fost mai mică de 30 Da a metabolitului catalpol glicozilat și a fost identificat ca îndepărtarea unei molecule de metabolit CH,O. M34 (m/z 151,0352, Rt 9,08 min), a fost o pierdere suplimentară a metabolitului H,O.

M44 (m/z 211,0665, Rt 11,31 min) a fost un metabolit glicozilat al genipozidei, iar M37 (m/z 197,0833, Rt 15,03 min) a fost glicozilarea acidului 8-epideoxiloganic. Reacțiile metabolice pentru iridoizi ar putea fi dezvăluite ca metabolism de faza I de glicozilare (Fig. 12D).

Comparația profilului metabolic în plasmă, urină și fecale între CD și produsele sale procesate

Au fost comparate 2 prototipuri în plasmă, 7 în urină și 3 în fecale. Au fost 7 prototipuri absorbite în CD, 7 prototipuri absorbite în CD-NP și 8 prototipuri în CD-HP. M21 a fost detectat doar în grupul de fecale al CD-NP, iar M38 și M51 au fost detectate doar în grupurile de urină ale CD-HP. Comparativ cu metaboliții, metaboliții identici din plasmă, urină și fecale au fost 4, 42 și, respectiv, 21. Au fost absorbiți 34 de metaboliți în grupul CD, 39 în CD-NP și 40 în grupul CD-HP. M5, M7, M40 și M52 au fost detectate doar în grupurile CD-NP, în timp ce M24, M4l și M48 tocmai au fost detectate în grupurile CD-HP.

Au fost observate variații în absorbția, precum și în metabolismul compușilor activi în diverse produse procesate de CD. Din Fig.14, am constatat că intensitatea conjugării HT-sulfat (M17) a fost cea mai mare în urină, urmată de 3-conjugarea cu sulfat HPP (M29), conjugarea cu sulfat HT metilat (M22), sulfatul CA dehidroxilat. conjugare (M32) și 3,4-conjugare sulfat de acid dihidroxibenzen propionic (M19). Conținutul de produse metabolice în grupul procesat a fost mai mare decât în ​​grupul CD, în special pentru M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2. Gruparea lor precursor 6'-O-cafeoil din partea 8-O{- -D-glucopiranozil, compușii, cum ar fi hidroxitirosolul, au proprietăți antitumorale, antiinflamatorii, antibacteriene, antivirale și antifungice [ 23]. Acidul cafeic posedă activități antiinflamatorii, anticancerigene și antivirale [24]. A fost în concordanță cu utilizarea clinică a CD și a produselor sale procesate.

Discuţie

CD este un MTC, iar componentele sale bioactive majore, inclusiv PhG, iridoizi, polizaharide au fost documentate prin diferite studii de cercetare. În practica clinică MTC, produsele procesate de CD au fost utilizate pe scară largă în comparație cu cele brute. Compoziția chimică va fi modificată în timpul procesării, ceea ce poate duce la modificări ale efectelor medicinale (Fig. 14).

PhG-urile sunt un tip de compus fenolic caracterizat printr-o structură -glucopiranozidă care poartă o porțiune hidroxi-feniletil sub formă de aglicon. Acești compuși cuprind adesea acid cafeic și ramnoză atașate la reziduul de glucoză prin legături esterice sau, respectiv, glicozidice. În studiul actual, analizele calitative ale CD, CD-NP. au fost efectuate și CD-HP și au fost identificați un total de 97 de compuși, inclusiv glicozide feniletanoide (PhGs), iridoide etc. Rezultatele obţinute au arătat variaţii ale compoziţiei chimice înainte şi după prelucrare. Intensitatea PhG-urilor care au grupa 4'-O-cafeoil în partea 8-O{- -D-glucopiranozil, cum ar fi acteozida, cistanozida C, campneozida II, partea osmanthus a scăzut după procesare, în timp ce PhGs cu

cum ar fi izoacetozide, izocistanozide, izocampneozide I, izomartinozide au crescut, în special în grupul CD-NP. De asemenea, a crescut intensitatea echinacozidei și cistanozidei B a căror structură posedă porțiune 6'-O- -D-glucopiranozil. PhG-urile care au o grupare 2’-acetil au scăzut adesea din cauza reacției de hidroliză în timpul procesului, cum ar fi tubulozida B, 2-acetilacteozida.

Investigarea metaboliților absorbiți in vivo a fost efectuată după administrarea orală de CD și produsele sale procesate. Procesele metabolice ale fazei II au fost cascadele cheie și majoritatea metaboliților au fost sulfat, glucuronid și conjugați metilati. Glicozidele de feniletanol au o absorbție și o utilizare orală scăzută. Sunt greu de absorbit în sânge și acționează ca progenitori pentru a-și juca rolul după activarea metabolică in vivo. Feniletanoizii produși în feniletanolaglicon, cum ar fi hidroxitirosol (HT) și acidul cafeic (CA) și derivatul său 3-acidul hidroxifenilpropionic (3-HPP), acești metaboliți pot fi absorbiți mai ușor în plasmă și au o efect medicinal mai bun.

CD și produsele sale procesate. Conjugarea HT-sulfat (M17) are cea mai mare intensitate în urină, urmată de 3-conjugarea cu sulfat HPP (M29), conjugarea cu sulfat HT metilat (M22), conjugarea cu sulfat CA dehidroxilat (M32) și 3,{{ 7}}conjugare cu sulfat de acid dihidroxi benzenpropionic (M19). Conținutul de produse metabolice în grupul procesat a fost mai mare decât în ​​grupul CD, în special pentru M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2.

În general, componentele cu expunere mare în organele țintă ar putea fi eficiente. O cantitate suficientă de feniletanoizi și derivații acestora au fost evaluate și determinate in vitro. Acteozidul este compusul caracteristic, al cărui conținut a scăzut după ce a fost prelucrat de orez-vin, iar conținutul de izoacteozidă, izocistanozidă C, izocampneozidă I a crescut în mod corespunzător. Produșii de degradare ai PhG, cum ar fi derivații CA și HT, ar putea fi evaluați în probele biologice, iar procesarea orez-vin poate îmbunătăți absorbția metaboliților in vivo.

Concluzie

În acest studiu, 97 de compuși au fost detectați în extractele de CD și în produsul său procesat. Degradarea câtorva glicozide a avut loc la o temperatură ridicată și, ca urmare, au fost sintetizați niște izomeri și complecși noi. În studiul in vivo, componentele prototip (10) și metaboliții (44) au fost determinați sau evaluați provizoriu în plasma de șobolan, fecale și urină. Procesele metabolice de fază II au fost cascadele cheie, majoritatea metaboliților au fost asociați cu echinacozidă sau acteozidă, cum ar fi HT, CA și derivații acestora 3-acidul hidroxifenilpropionic 3-HPP. Acești metaboliți pot fi absorbiți mai ușor în plasmă și pot avea un efect medicinal mai bun. Rezultatele obţinute au arătat că compoziţia chimică a CD a fost diferită şi a afectat dispunerea compusului in vitro şi in vivo.

Abrevieri

PhGs: glicozide feniletanoide; CD: Cistanche deserticola; CMM: Chinese Materia Medica; MTC: Medicina Traditionala Chineza; CD-NP: Gistanche deserticola Procesat prin aburire cu vin de orez la presiune normală; CD-HP: Cistanche deserticola Procesat prin aburire cu vin de orez la presiune mare; UPLC-Q-TOF-MS: Cromatografie lichidă de ultra-înaltă performanță cuplată cu TOF-MS; PCA: Analiza componentelor principale; VIP: Importanță variabilă pentru proiecție; CA: Caffeicacid; HA: Hidroxitirosol.

Mulțumiri

Nu se aplică.

Contribuții ale autorilor

LZ, LBN, SJ au participat la redactarea, scrierea manuscrisului. RJ, LPP au asistat la experimentele pe animale și au elaborat și finalizat toate figurile și tabelele. ZC, HY. ITZ a asistat la proiectarea și performanța acestui studiu și a revizuit manuscrisul. Toți autorii au citit și au aprobat manuscrisul final.

Finanțarea

Această lucrare a fost susținută de Fundația Națională pentru Științe Naturale din China (grant nr. 81874345) și de fundația de științe naturale din provincia Liaoning (grant nr: 2020-MS-223).

Disponibilitatea datelor și materialelor

Seturile de date utilizate și/sau analizate în timpul studiului curent sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere rezonabilă.

Declarații

Aprobarea etică și acordul de participare

Aprobarea etică pentru utilizarea animalelor experimentale pentru acest studiu a fost obținută de la Comitetul de etică medicală al Universității de Medicină Tradițională Chineză Liaoning (Număr de aprobare: 2018YS(DW)-044-01), Toate procedurile experimentale din acest studiu au fost conform standardelor etice ale Comitetul de etică medicală al Universității de Medicină Tradițională Chineză Liaoning.

Consimțământ pentru publicare

Nu se aplică.

Interese concurente

Autorii declară că nu au conflicte de interese de dezvăluit.

Detalii autor

„Departamentul de Farmaceutică, Universitatea de Medicină Tradițională Chineză Liaoning, Dalian, Liaoning, China.” Institutul de Cercetare a Medicamentului al Grupului Monos, Ulaanbaatar 14250, Mongolia.

Primit: 31 mai 2021 Acceptat: 17 septembrie 2021 Publicat online: 28 septembrie 2021

Zhe Li1, Lkhaasuren Ryenchindorj2, Bonan Liu1, Ji Shi1* , Chao Zhang1, Yue Hua1, Pengpeng Liu1, Guoshun Shan1 și Tianzhu Jia1

Referințe

1. Comisia de Farmacopeea Chineză. Farmacopeea Republicii Populare Chineze, voi. I. Beijing: China Medical Science Press; 2020. p. 140.
2. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng CM. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): unul dintre cele mai bune daruri farmaceutice ale medicinei tradiționale chineze. Front Pharmacol. 2016;7:41.
3. Liu BN, Shi J, Zhang C, Li Z, Hua Y, Liu PP, Jia TZ. Efectele diferitelor metode de prelucrare prin uscare pentru Fresh Cistanche deserticola asupra conținutului de componente. J Chin Med Mater. 2020;10:2414–8.
4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Optimizarea procesului de aburire la presiune înaltă pentru Cistanches Herba. Chin Trad Patent Med. 2019;11:2576–80.
5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. Efectele Cistanches herba înainte și după procesare asupra funcției anti-îmbătrânire și a funcției imune a șobolanilor îmbătrâniți indus de D-galactoză. Chin Arch Trad Chin Med, 2017; 11:2882–2885.
6. Gao YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Studiu asupra constituenților laxative în Cistanche deserticola YMCA. Modern Chin Med. 2015;17(4):307–10.
7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Studiu privind funcția neuroendocrină-imună a Cistanche deserticola și produsele sale de aburire a vinului de orez în modelul de șobolan indus de glucocorticoizi. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;22:5321976.
8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Îmbunătățirea funcției de revigorare a rinichilor în modelul de șoarece prin Cistanches herba uscată rapid la o temperatură medie-înaltă. J Med Food. 2019;22(12):1246–53.
9. Wang T, Zhang X, Xie W. Cistanche deserticola YC Ma, „Desert ginseng”: o recenzie. Am J Chin Med. 2012;40(6):1123–41.
10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: O privire de ansamblu asupra proprietăților sale chimice, farmacocinetice și farmacocinetice. J Etnofarmacol col. 2018;219:233–47.
11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. Herba Cistanche (Rou Cong Rong): o revizuire a fitochimiei și farmacologiei sale. Chem Pharm Bull. 2020;68(8):694–712.
12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Efectele neuroprotective ale echinacozidei în modelul MPTP de șoarece al bolii Parkinson. Eur J Pharmacol. 2007;564:66–74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Efectul protector al tubulozidei B asupra apoptozei induse de TNF alfa în celulele neuronale. Acta Pharmacol Sin. 2004;25(10):1276–84.
14. Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y, Tu PF. Iridoide antiinflamatoare din tulpinile de Cistanche deserticola cultivate în deșertul Tarim. Chin J Nat Med. 2016;14(1):61–5.
15. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF. Glicozide feniletanoide cu activitate antiinflamatoare din tulpinile de Cistanche deserticola cultivate în deșertul Tarim. Fitoterapia. 2013;89:167–74.
16. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, Yoshikawa M, Hayakawa T, Muraoka O. Iridoid și glicozide monoterpenice aciclice, kancanozide L, M, N, O și P din Cistanche tubulosa. Chem Pharm Bull. 2010;58(10):1403–7.
17. Li SL, Song JZ, Qiao CF, et al. O strategie nouă pentru a explora rapid potențialii markeri chimici pentru discriminarea dintre Radix Rehmanniae brut și procesat prin UHPLC-TOF-MS cu analiză statistică multivariată. J Pharm Biomed Anal. 2010;51(4):812–23.
18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Modificări ale nivelurilor de glicozide feniletanoide, activitate antioxidantă și alte trăsături de calitate în feliile de Cistanche deserticola prin procesare cu abur. Chem Pharm Bull. 2016;64:1024–30.
19. Ma ZG, Tan YX. Modificări ale conținutului a șase glicozide feniletanoide în intervale de timp de aburire cu vin în Desertliving Cistanche. Chin Trad Pat ent Med. 2011;33(11):1951–4.
20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Efectul procesului de aburire asupra calității cistanche deserticola post-recoltare pentru uz medicinal în timpul uscării la soare. Biol Pharm Bull. 2016;39(12):2066–70.
21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Metaboliți ale acteozidei dietetice: profile, izolare, identificare și capacități hepatoprotective. J Agric Food Chim. 2018;66(11):2660–8.
22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Caracterizarea sistematică a metaboliților echinacozidei și acteozidei din Cistanche tubulosa în plasma, bilă, urină și fecale de șobolan pe baza UPLC-ESI-Q-TOF -DOMNIȘOARĂ. Biomed Chromatogr. 2016;30(9):1406–15.
23. Bertelli M, Kiani AK, Paolacci S, Manara E, Kurti D, Dhuli K, Bushati V, Miertus J, Pangallo D, Baglivo M, Beccari T, Michelini S. Hidroxitirosol: un compus natural cu activități farmacologice promițătoare. J Biotechnol. 2020;309:29–33.
24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Cafeic Acid, a versatile pharmacophore: an overview. Mini Rev Med Chem. 2011;11(8):695–713.

Nota editorului

Springer Nature rămâne neutră în ceea ce privește revendicările jurisdicționale în hărțile publicate și afilierile instituționale.