Crisogenamidă A dintr-o ciupercă endofitică asociată cu Cistanche Deserticola și efectul său neuroprotector asupra celulelor SH-SY5Y

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Introducere

Cistanche deserticola(YC Ma) este o plantă parazită originară din nord-vestul Chinei. Tulpina acestei plante este o importantă medicină tradițională chineză și este folosită pentru tratamentul deficienței renale și neurasteniei („The Chinese Medicine Dictionary”, 1977). Glicozide feniltanoide dinCistanchedeserticolaau fost raportate că au activități în prevenirea și tratarea bolilor nervilor cranieni și eliminarea radicalilor liberi [1, 2]. Pe baza faptului că ciupercile endofitice pot produce noi componente medicinale și aceleași/asemănătoare cu cele din plantele gazdă, căutarea de noi compuși activi din ciupercile endofitice ale plantelor medicinale importante arată valoarea pentru dezvoltarea de noi resurse medicinale. În cursul căutării noastre pentru noi compuși neuroprotectori din ciupercile endofitice dinCistanchedeserticolacolectate din Mongolia Interioară în nord-vestul Chinei, trei tulpini active au fost analizate folosind celule SH-SY5Y. Printre acestea, bulionul de cultură al ciupercii nr. 005, autentificat ca Penicillium chrysogenum, a arătat un efect semnificativ de protecție a neurocitelor împotriva morții celulare induse de stres oxidativ în celulele SH-SY5Y. Studiile asupra constituenților activi ai acestei tulpini au condus la izolarea crisogenamidei A (1) (Fig. 1) printr-o procedură de izolare ghidată de biotest. În plus, patru compuși cunoscuți au fost izolați și identificați ca circumdat în G (2) [3], 2-[({{2-hidroxipropionil) amino] benzamidă (3) [4], 2- ,3-dihidrosorbicilină (4) [5] și (9Z,12Z)-2,{3-dihidroxipropil octadeca{-9,12-dienoat (5) [6] , prin compararea datelor lor spectroscopice cu datele din literatură. Aici, raportăm despre izolarea, identificarea și efectul neuroprotector al crisogenamidei A.

Cistanche deserticola

Materiale și metode

Material fungic O probă de Penicillium chrysogenum nr. 005 a fost izolată din rădăcina de C. deserticola colectată din Mongolia Interioară din nord-vestul Chinei. Pe agar dextroză de cartofi, aspectul macroscopic era de colonii răspândite, netede, catifelate, de culoare albastru-verzuie, uneori acoperite cu hife ușoare; suprafața coloniilor prezenta adesea numeroase picături galbene deschise; galben invers. A fost efectuată o căutare GenBank cu secvența genei ADN ribozomal 18S de nr. 005 (1676 nucleotide; numărul de acces Gen-Bank EU203859). Rezultatele indică o specie de Penicillium chrysogenum ca cea mai apropiată potrivire. Pe baza aspectului său macroscopic și a secvenței genei ADNr 18S, No.005 este o tulpină de Penicillium chrysogenum.

Fermentare și extracție

Ciuperca a fost crescută în condiții statice la 24 de grade timp de 3{{10}} zile în baloane conice de 35 1000-ml conținând un mediu lichid (30{{2{{22} }}} ml/balon) compus din glucoză (10 g/litru), maltoză (20 g/litru), manitol (20 g/litru), glutamat monosodic (10 g/litru), KH2PO4 (0,5 g/litru), MgSO4·7H2O (0,3 g/litru), lichior de porumb (1,0 g/litru) și extract de drojdie (3,0 g/litru) și apă de mare după ajustarea pH-ului său la 7,0. Bulionul întreg fermentat (10,5 litri) a fost extras de trei ori cu EtOAc pentru a da o soluţie de EtOAc, care a fost concentrată sub presiune redusă pentru a da un extract brut (9,5 g).

Purificare

Extractul brut (9,5 g) a fost separat în 15 fracții pe o coloană de silicagel utilizând o eluare în trepte cu gradient de eter de petrol/Me2CO. Fracția 2, eluată cu 8:2 eter de petrol/Me2CO, a fost recristalizată din MeOH, rezultând 3 sub formă de ace incolore (8,{{10}} mg). Fracția 3 (19,{{30}} mg), eluată cu 7:3 eter de petrol/Me2CO, a fost separată în continuare printr-o coloană cu fază inversă (RP18, 40 6{{38 }} mm, Merck; MeOH - H20 3:2→4:1→MeOH) pentru a da fr. 3 7 (8,0 mg), care a fost purificat prin PHPLC extins (60 procente MeOH care conține {{7{0}},1 procente TFA, 4.{{77} } ml/minut) pentru a da 4 (2.{{80}} mg). Fracția 4 (26,0 mg), eluată cu 6:4 eter de petrol/Me2CO, a fost separată în continuare prin coloană cu fază inversă (RP18, 40 x 60 mm, Merck; MeOH - H2O 3:2 → 4:1 → MeOH) pentru a se obține fr. 4-3 (5,4 mg) și fr. 4-9 (7,6 mg). Apoi, fr. 4-3 a fost separat prin PHPLC extins [YMC-pack ODS (A), 10 250 mm, 5 mm, 4,0 ml/minut] (60% MeOH, 4,0 ml/minut) pentru a da 2 (1,0 mg) și fr. 4-9 a fost separat prin PHPLC extins (80 procente MeOH, 4,0 ml/minut) pentru a da 1 (4,0 mg) și 5 (2,6 mg). 1: obţinut ca solid galben pal; [a]D25 24,5 grade (c 0,155, MeOH); UV (MeOH) l max 208, 251 nm; CD (MeOH) (vezi Fig. 4); IR (KBr) nmax 3433, 3200, 3076, 2928, 2862, 1677, 1440, 1370, 1324, 1188, 1029 cm1; 1H- şi 13C-RMN (vezi Tabelul 1); HRESI-MS m/z 448,2951 [MH] (calculat pentru C28H38N3O2, 448,2964)

DPPH Radical Scavenging Effect

La 40 ml DPPH (1,1- difenil{{8) s-a adăugat o soluție de MeOH (160 ml) cu diferite concentrații de probă (1,0 mg/ml 0,0001 mg/ml) }}picrhidrazil; Sigma) MeOH soluţie (1,5 10 4 M). După amestecare ușor și lăsat timp de 30 de minute la temperatura camerei, densitatea optică a fost măsurată la 520 nm folosind un spectrofotometru. Activitatea antioxidantă a fiecărei probe a fost exprimată în termeni de IC50 (mg/ml sau mM necesar pentru a inhiba formarea radicalilor DPPH cu 50 la sută) și a fost calculată din curba de inhibare log-doză.

neuroprotector al cistanche deserticola

Cultură celulară și tratament medicamentos

Celulele SH-SY5Y de neuroblastom uman au fost cultivate într-un mediu DMEM și menținute la 37 de grade într-o atmosferă umidificată cu 5,0 procente de CO2. Aceste suspensii de celule (180 ml) la o densitate de 5*104 ml de celule{-1 au fost placate în plăci de microtitrare cu 96- godeuri și incubate timp de 24 de ore la condiția de mai sus. S-a adăugat în fiecare godeu o soluție de crisogenamidă A (2,0 ml în DMSO) la diferite concentrații, cu excepția grupurilor de control și model și s-a incubat în continuare timp de 1 oră în aceleași condiții. S-a adăugat H2O2 (Sigma Chemical Co., MO, SUA) pentru a induce apoptoza în celulele SH-SY5Y la o concentrație finală de 200 mM timp de 24 de ore. Viabilitatea celulară a fost determinată folosind un test MTT. MTT dizolvat în soluție salină tamponată cu fosfat a fost adăugat la sfârșitul incubării la o concentrație finală de 5,0 mg/ml (PBS) și apoi incubat la 37 de grade timp de 4 ore. Aruncând supernatantul, produsul formazan rezultat a fost dizolvat.

Rezultate si discutii

1 a fost obţinut ca solid galben pal. Formula moleculară a fost determinată ca C28H37N3O2 prin HRESI-MS (observat [MH] la m/z 448,2951, numit [MH] C28H38N3O2, 448,2964). Spectrul IR a sugerat prezența NH (3433 și 3200 cm1) și a grupării(e) carbonil (1677 cm-1). Spectrul 1H-RMN (Tabelul 1) înregistrat în DMSO-d6 a evidențiat trei grupări metil (d H 0.62, 0,87, 0,98) și două semnale de protoni schimbabili (d H 10,36 și 8,29). Mai mult, trei semnale aromatice cuplate orto (d H 6,90 dd, J 7,3, 7,3 Hz, 6,94 d, J 7,3 Hz și 7,18 J 7,3 Hz) au indicat un inel benzenic 1,2,3-trisubstituit. Protonii metilen (d H 3,23) cuplați cu un proton olefinic (d H 5,27), împreună cu doi metil vinilici (d H 1,67 și 1,70), au indicat prezența unei grupări 3-metil-2-butenil în 1. Conectivitățile cu o singură legătură ale acestor protoni și alți 14 protoni metină și/sau metilen au fost stabilite printr-un experiment HMQC. Spectrele 13C-RMN și DEPT (Tabelul 1), care au dezvăluit 28 de semnale, au confirmat, de asemenea, prezența acestor două fragmente [ciclu benzenic trisubstituit (dC 123,6 CH, 120,8 CH, 127,7 CH, 122,1 QC și 140,4 QC) și {a} {79}}metil-2-butenil (dC28CH2, 121,9 CH, 132,3 QC, 25,5 CH3 și 17,7 CH3)]; în plus, doi carbonili (dC 183,1 și 172,3), patru atomi de carbon cuaternar sp3 (dC 46,5, 58,7, 60,4 și 62,3), două sp3 metine (dC 46,1 și 58,7) și șase metilen sp3 (dC 21,3, 3,4, 3,3, 3,4, 3,3). 35,2, 39,9 și 64,9) au fost de asemenea observate. Deoarece 6 din 12 nesaturații au fost luate în considerare, s-a dedus că 1 conține șase inele. O evaluare ulterioară a acestor date spectrale, împreună cu rezultatele 1 H{-1 H COSY și HMBC, au arătat că 1 este strâns legat de grupul marcfortin al metaboliților fungici [7]. Interpretarea corelațiilor HMBC (Fig. 2) a indicat prezența structurii parțiale A (corelații HMBC 1-NH la C-8 și C-9; H{-6 la C{{ 136}}; H-5 în C{-7 și C{-9; H-26 în C{-28 și C{-8 și H{{143 }} la C-29 și C-30) și B (corelații HMBC H-10 la C-3, C{-22, C-21, C-11, C{-12; H-20 la C{-13, C-18, C{-22, C{-11 și { {157}}NH la C-13, C{-10) și C, un inel G cu șase atomi [8] cu un carbon metilat la C-17 (corelații HMBC H{{ 163}} la C-17, C{-16). Conectivitatea substructurii A la B prin C-3 a fost susținută de corelațiile cheie HMBC de la H-4 și 1-NH la C-3; De la H-10 la C-2 și C-9. Legătura dintre structura B și C cu un atom de azot a fost dedusă prin corelațiile cheie HMBC de la H-12 la C{-17 și C{-13 și comparând deplasările lor chimice corespunzătoare ale C{{176 }} și C-17 (dC 64,9 și 58,7). Analiza de mai sus a indicat că 1 a avut o structură similară cu marcfortinei A, cu excepția diferențelor catenei laterale la inelul benzenic și metil la C-17 a inelului G cu șase atomi. Deci, structura brută a lui 1 a fost atribuită așa cum se arată în Fig. 1

Stereochimia relativă a lui 1 a fost elucidată pe baza datelor NOESY (Fig. 3). Studiile anterioare au arătat că compușii de tip alcaloid 2-oxindol au adoptat o conformație în care inelul central cu cinci membri este ortogonal cu planul subunității oxindolului [9].

Corelațiile NOESY între H{{0}} și H-10a, H-25 și între 19-NH și H{-10a au indicat că ambele erau pe fața inelului ciclopentanonic care le orientează spre H-4, fixând stereochimia relativă la C-3 așa cum se arată. Interacțiunile NOESY dintre H-21, H-12a, H-10b, H{-23 și H{-24 au plasat substituenții corespunzători împreună pe fața frontală a inelul ciclopentanonic. Stereochimia relativă propusă pentru 1 este în acord cu caracteristicile relevante ale stereochimiei relative a marcfortinei A [7]. Efectul de bumbac la 200-250 nm apare dintr-o tranziție np* a legăturilor de amidă de diktopiperazina, care este diagnostic pentru miezul de biciclo-[2.2.2] diazaoctan dicetopiperazină [10, 11]. Spectrul CD de 1 (Fig. 4) sa corelat cu regiunile relevante ale celei ale -brevianamidei A [11]. Deci stereochimia absolută a lui 1 ar trebui să fie 3S, 11S, 13S, 17S, 21R și i s-a dat numele de crisogenamidă A. Evaluarea preliminară a efectului protector al crisogenamidei A asupra neurocitelor a fost evaluată folosind moartea celulară indusă de stres oxidativ în SH-SY5Y celule printr-un test MTT. Activitatea de captare a radicalilor liberi a crisogenamidei A a fost examinată mai întâi folosind DPPH ca donor de radicali liberi. Spre deosebire de vitamina C (IC50: 29,0 mM), crisogenamida A nu a prezentat nicio capacitate (IC50 mai mare sau egală cu 100 mM) de a elimina radicalii liberi DPPH la o concentrație de până la 100 mM. Între timp, am testat dacă crisogenamidă A a protejat celulele împotriva morții celulare induse de stresul oxidativ în neuroblastomul uman SH-SY5Y

celule. Stresul oxidativ provocat de peroxidul de hidrogen a dus la o scădere a viabilității celulare cu 43% în comparație cu grupul de control. Crisogenamida A a inhibat moartea celulară indusă de peroxidul de hidrogen prin îmbunătățirea viabilității celulelor cu 59,6% la o concentrație de 1*10-4 mM. Aceste date au sugerat că crisogen amidă A a arătat un efect de protecție a neurocitelor împotriva morții celulare induse de stresul oxidativ, nu prin activitatea sa antioxidantă. Alcaloizii indolici care posedă un sistem ciclic biciclo [2.2.2] diazaoctanic neobișnuit au fost izolați din diferite genuri de ciuperci, cum ar fi Aspergillus [12, 9, 13], Penicillium [14 16] și Malbranchea [17]. 1 a fost un nou membru al acestui grup de compuși, poseda un schelet care se aștepta a fi un intermediar în biosinteza administratorilor de citrină A și B raportați ca o nouă clasă de alcaloizi pentaciclici spiroin dolinone în 2005 [18]. Din punct de vedere structural, este important de subliniat că 1 este o structură unică cu metilare în poziția C-17 și un fragment 2- oxindol care posedă o unitate izopren la C-7. Unii dintre acești alcaloizi indolici izolați până în prezent prezintă o activitate antiparazitară puternică [19], inhibarea celulelor tumorale umane [13] și citotoxicitate [10]. Din câte știm, este primul raport de neuroprotecție de către acest tip de alcaloid.

ConfirmareAceastă lucrare a fost susținută financiar de Fondul național chinez pentru științe naturale (nr. 30472136).

neuroprotector al cistanche deserticola: anti-boala Alzheimer

Cistanche deserticola are multe efecte, click aici pentru a afla mai multe

Referințe

1. Li LL, Wang XW, Wang XF. Peroxidarea antilipidica si actiunea antiradiatie a glicozidelor inherba Cistanches. China J Chin Mater Med 22: 364–367 (1997)

2. Xie JH, Wu CF. Efectul extractului etanolic deCistanche deserticolaasupra conținutului de neurotransmițători monoamine din creierul de șobolan. Chin Trad Herb Drugs 24: 417–419 (1993)

3. Dai JR, Carte BK, Sidebottom PJ, Yew ALS, Ng SB, Huang Y, Butler MS. Circumdatin G, un nou alcaloid din ciuperca Aspergillus ochraceus. J Nat Prod 64: 125–126 84 Fig. 2 Cheie HMBC și 1 H-1 H COZY corelații de 1. Fig. 3 NOESYs de 1. Fig. 4 Spectru CD de 1. (2001)

4. Kettering M, Sterner O, Anke T. Antibiotice în comunicarea chimică a ciupercilor. Zeitschrift fuer Naturforschung, C: Journal of Biosciences 59: 816–823 (2004)

5. Trifonov LS, Bieri JH, Prewo R, Dreiding AS, Hoesch L, Rast DM. Izolarea și elucidarea structurii a trei metaboliți din Verticillium intertextum: sorbicilină, dihidrosorbicilină și bisvertinochinol. Tetraedrul 39: 4243–4256 (1983)

6. Zhang GL, Xing QY, Zhang MZ. Glicolipide din Mirabilis Himalaya. Phytochemistry 45: 1213–1215 (1997)

7. Polonsky J, Merrien MA, Prange T, Pascard C, Moreau S. Izolarea și structura (analiza cu raze X) a marcfortinei A, un nou alcaloid din Penicillium roqueforti. JCS Chem Comm 13: 601–602 (1980)

8. Lee BH, Kornis GI, Cialdella JI, Clothier MF, Marshall VP, Martin DG, McNally PL, Mizsak SA, Whaley HA, Wiley VH. Hidroxilarea microbiologică la șase atomi de carbon individuali ai marcfortinei A. J Nat Prod 60: 1139–1142 (1997)

9. Whyte AC, Gloer JB, Wicklow DT, Dowd PF. Sclerotiamidă: un nou membru al clasei paraherquamidelor cu activitate antiinsectan puternică din scleroții Aspergillus sclerotiorum. J Nat Prod 59: 1093–1095 (1996)

10. Kato H, Yoshida T, Tokue T, Nojiri Y, Hirota H, Ohta T, Williams RM, Tsukamoto S. Notoamides AD: alcaloizi indol prenilați izolați dintr-o ciupercă derivată din marin, Aspergillus sp. Angew Chem Int Ed 46: 2254–2256 (2007)

11. Williams RM, Kwast E, Coffman H, Glinka T. Biogeneza remarcabilă, enantio-divergentă a brevianamidei A și B. J Am Chem Soc 111: 3064–3065 (1989)

12. Banks RM, Blanchflflower SE, Everett JR, Manger BR, Reading C. Metaboliți antihelmintici noi de la o specie Aspergillus: aspergillimides. J Antibiot 50: 840–846 (1997)

13. Qian-Cutrone J, Haung S, Shu YZ, Vyas D, Fairchild C, Menendez A, Krampitz K, Dalterio R, Klohr SE, Gao Q. J Am Chem Soc 124: 14556–14557 (2002)

14. Wilson BJ, Yang DTC, Harris TM. Producția, izolarea și studiile preliminare de toxicitate ale brevianamidei A din culturi de Penicillium Viridicatum. Appl Microbiol 26: 633–635 (1973)

15. Birch AJ, Russell RA. Studii în legătură cu biosinteza XLIV. Elucidări structurale ale brevianamidelor B, C, D și F. Tetrahedron 28: 2999–3008 (1972)

16. Liesch JM, Wichmann CF. Agenți antinematozi și antiparazitari noi de la Penicillium Charles. II. Determinarea structurii paraherquamidelor B, C, D, E, F și G. J Antibiot 43: 1380–1386 (1990) 17. Martinez-Luis S, Rodriguez R, Acevedo L, Gonzalez MC, Lira-Rocha A, Mata R Malbrancheamida, un nou inhibitor de calmodulină din ciuperca Malbranchea aurantiaca. Tetraedrul 62: 1817–1822 (2006)

17. Mishima T, Tsuda M, Kasa Y, Ishiyama H, Fukushi E, Kawabata J, Watanabe M, Akao K, Kobayashi J. Absolute stereochemistry of citrinadins A and B from a marine-derived fungus. J Org Chem 70: 9430–9435 (2005)

18. Lopez-Greta MP, Gonzalez MC, Ciavatta L, Ayala I, Moya P, Primo J. Activitatea insecticida a paraherquamidelor, paraherquamidelor, incluzând paraherquamide H și paraherquamide I, Two New Alcaloids Isolated from Penicillium cluniae. J Agric Food Chem 54: 2921–2925 (2006)

neuroprotector al cistanche deserticola: anti-boala Alzheimer și boala Parkinson