MiRNA circulant la pacienții cu diabet de tip 2 cu și fără albuminurie în Malaezia

AbstractIntroducere: Boală renală diabetică(DKD) rămâne principala cauză a bolii cronice de rinichi. A fost raportată dereglarea miARN-urilor circulante, sugerând rolurile lor patologice în DKD. Acest studiu și-a propus să investigheze miARN-urile exprimate diferențial în serurile pacienților cu diabet zaharat de tip 2 (T2DM) cu și fără albuminurie la o populație selecționată din Malaezia.Metodă:Patruzeci și unu de pacienți cu T2DM aflați în urmărire la o clinică comunitară au fost împărțiți în grupuri normale (NA), micro (MIC) și macroalbuminurie (MAC). Nivelurile diferențiale de miARN din 12 probe au fost determinate utilizând matricea qPCR miScript miRNA concentrată pe cale (fibroză umană) și au fost validate în 33 de eșantioane, utilizând matricea qPCR personalizată miScript (CMIHS02742) (Qiagen GmbH, Hilden, Germania).Rezultate:Tendințele de reglare ascendentă a 3 miARN-uri în ser, și anume, miR-874-3p, miR-101-3p și miR-145-5p ale pacienților cu T2DM cu MAC în comparație cu cei cu NA. Supreglare semnificativă statistic a miR- 874-3p (p= 0.04) și miR-101-3p (p= 0.01) a fost văzut în cohorta de validare. Corelații negative semnificative între rata estimată de filtrare glomerulară (eGFR) și miR-874-3p (p= 0.05), miR-101-3p (p= 0.03) și miR-145-5p (p= 0.05), precum și corelația pozitivă între miR-874-3p și vârstă (p= 0.03) au fost arătate prin analiza coeficientului de corelație a lui Pearson.Concluzie:În acest studiu a fost găsită reglarea în sus a miARN-ului cunoscut anterior, și anume, miR-145-5p și, eventual, a altora noi, și anume, miR-874-3p și miR{-101-3p în serul pacienților cu DZ2. . A existat o corelație semnificativă între eGFR și aceste miARN. Concluziile acestui studiu au oferit dovezi încurajatoare pentru a investiga în continuare rolurile presupuse ale acestor miARN-uri exprimate diferențial înDKD.

Faceți clic pentru a cistanche herba pentru boli de rinichi

Introducere

Boala diabetică a rinichilor (DKD) reprezintă 39% din apariția bolii renale în stadiu terminal în SUA [1]. De asemenea, DKD continuă să fie cauza principală a bolii renale cronice (CKD) în Malaezia, contribuind la 69% dintre pacienții noi dializați în 2018 [2]. Se crede că patologia DKD este determinată în principal de hiperglicemie, care are ca rezultat activarea căilor de semnalizare intracelulară și, în cele din urmă, fibroza renală [3]. În ciuda progreselor în management, biomarkerii și terapiile actuale nu reușesc să prevină progresia acesteia către boală renală în stadiu terminal [3]. Prin urmare, este nevoie urgentă de o mai bună înțelegere a mediatorilor și a mecanismelor DKD.

Acidul microribonucleic (miARN) este o familie de mici ARN necodificatori care au apărut ca regulatori post-transcripționali importanți ai expresiei genelor [4]. Au fost observate expresia aberantă a miARN-urilor și implicarea lor în mecanismul celular al DKD [3]. Acest studiu și-a propus să identifice modelul de exprimare a miARN-urilor selectate în serurile pacienților cu diabet zaharat de tip 2 (T2DM) cu și fără albuminurie. La nivel mondial, au fost efectuate studii similare la diferite populații, așa cum a fost revizuit anterior [5-7]. Ne-am propus să investigăm modelul de expresie diferențială a unei selecții de miARN care sunt asociate cu căi fibrotice la pacienții cu DZ2, dintre care unele au fost studiate anterior în DKD. Studiile anterioare au sugerat diferențe legate de etnie în expresia miARN [8, 9]. Prin urmare, pe lângă faptul că poate confirma concluziile anterioare, acest studiu poate dezvălui noi miARN-uri, probabil exprimate în mod unic în populația din Malaezia.

Materiale și metode

Studiază Populația

Acest studiu transversal a implicat 41 de pacienți existenți cu DZ2 în urmărire la o clinică comunitară, din ianuarie până în aprilie 2019. Acest studiu a implicat o procedură în 2-etape: (1) miARN în serurile a 12 pacienți (cohorta de screening). ) au fost profilate și (2) cele mai relevante miARN au fost validate cu serurile de la 33 de pacienți (denumită cohorta de validare). Acesta a inclus 4 pacienți din cohorta de screening. Consimțământul scris a fost obținut de la pacienți individuali. Aprobarea etică pentru acest studiu a fost obținută de la Comitetul pentru Cercetare Medicală și Etică (MREC), Ministerul Sănătății Malaezia. Criteriile de includere au fost pacienții cu T2DM și informațiile clinice și de laborator disponibile. Pacienți cu DZ tip 1; non-DKD; comorbidități cum ar fi cancerul, bolile febrile acute sau infecțiile recente; sarcina; și postpartum au fost excluse.

Din fișele medicale ale pacientului au fost extrase informații despre următoarele: (1) date demografice, inclusiv vârsta și sexul; (2) date clinice, cum ar fi tensiunea arterială, greutatea, durata DZ2, tratamentul și alte complicații ale diabetului; (3) date de laborator, inclusiv glucoza plasmatică a jeun, hemoglobina glicata A1c (HbA1c), raportul albumină-creatinină și creatinina serică. Pacienții au fost împărțiți în 3 grupuri în funcție de nivelurile lor de albuminurie, normoalbuminurie (NA), microalbuminurie (MIC) și macroalbuminurie (MAC).

Definiție

In acest studiu,

NA, MIC și MAC au fost definite ca un raport albumină-creatinină de<30, between 30 and 300 and >300 mg/g creatinină, respectiv, în cel puțin 2 din 3 colecții de urină spot [10]. Rata de filtrare glomerulară estimată (eGFR) a fost calculată pe baza ecuației creatininei Boala renală cronică-Epidemiologie.

Prepararea serului

Vacutainer Probele colectate de sânge integral (mai puțin sau egal cu 8 ore) în tuburi BD ®SSTTM de 10- ml (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, SUA) au fost lăsate la temperatura camerei timp de 30- min. coagulare înainte de 10- min centrifugare la 1,900 g. Faza superioară a fost recoltată, filtrată cu filtru Minisart®PES de 0,22-μm (Sartorius, Gottingen, Germania) și alicotată în tuburi de microcentrifugă pentru depozitare la -80 de grade până la analiză.

miARN total

Izolarea MiARN total a fost izolat folosind kitul miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen GmbH) conform protocolului producătorului. Pe scurt, reactivul de liză Qiazol a fost adăugat la o alicotă de 200 μL de ser pentru denaturare, urmat de miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control C. elegans miR-39 miRNA miRNA (Qiagen GmbH) pentru a monitoriza recuperarea ARN și invers. eficiența transcripției. S-a adăugat cloroform pentru separarea fazelor urmată de adăugare de etanol 100% la faza apoasă superioară. Etapele de clătire au fost realizate prin tampon RWT, tampon RPE și etanol 80%. ARN-ul a fost eluat prin adăugarea a 14 μL de apă fără RNază la membrana coloanei spin RNeasy MinElute. Cantitatea și calitatea ARN au fost determinate de un spectrofotometru NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE, SUA), înainte de depozitare la -80 de grade până la utilizare. Transcripția inversă (RT) a miARN la ADNc și preamplificarea au fost efectuate cu kitul miScript RTII (Qiagen GmbH) și, respectiv, cu kitul miScript PreAMP PCR (Qiagen GmbH), conform protocolului producătorului, folosind 6 μL ARN șablon și 5 μL de ARN diluat. ADNc, respectiv

Analiza cantitativă a reacției în lanț a polimerazei în timp real

MiRNA-urile circulante în serul cohortei de screening au fost identificate prin matricea miScript qPCR miRNA focalizată pe cale (fibroză umană) (Qiagen GmbH), iar miARN-urile selectate au fost validate ulterior în cohorta de validare cu o matrice personalizată miScript miRNA qPCR (CMIHS02742) ( Qiagen GmbH) conform instrucțiunilor producătorului. Fiecare reacție a inclus un șablon de ADNc, 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 10x miScript Universal Primer, 10x miScript Primer Assay și apă fără RNază și ADNc șablon diluat pentru a obține un volum total de 25 μL. PCR cantitativ în timp real a fost efectuat pe Eppendorf Mastercycler ep realplex 4, care a fost programat după cum urmează: 15 min la 95 de grade, 15 s la 94 de grade, 30 s la 55 de grade și 30 s la 70 de grade cu 40 de cicluri.

Cuantificare relativă a miARN

Analiza datelor PCR în timp real a fost efectuată folosind software-ul Qiagen Gene Globe Data Analysis Center (https://geneglobe.qiagen.com/analyze/). Expresia relativă (RE) a fost derivată prin metoda 2-∆Ct, prin care expresia fiecărui miARN a fost normalizată la cea a genei de menaj SNORD95 sau Global Ct Mean. Schimbarea de ori a fost calculată din expresia miARN normalizată în fiecare grup (MIC sau MAC) împărțită la expresia miARN normalizată în grupul de control (NA). Valorile p au fost calculate pe baza unui test t de eșantioane independente al valorilor RE (2−∆Ct) replicate pentru fiecare genă din grupul de control și grupurile de testare. Verificarea ulterioară a analizei datelor qPCR a fost efectuată manual folosind Microsoft Excel și IBM SPSS (Statistical Package for the Social Science; IBM Corp, Ar monk, NY, SUA) versiunea 25 pentru software-ul Microsoft Windows.

Selectarea miARN-urilor în cohorta de screening pentru validare

Initially, the relative quantification of miRNAs in the screening cohort was based on the global Ct mean normalization method, and Ct >30 a fost considerată expresie negativă, așa cum este recomandat de Centrul de analiză a datelor Qiagen GeneGlobe (https://geneglobe.qiagen.com/analyze/). Tabelul suplimentar online 1 (pentru tot materialul de furnizare online, a se vedea www.karger.com/doi/10.1159/000518866) arată un RE de 84 de miARN în cohorta de screening normalizată la media globală a Ct. MiRNA-urile cu modificări semnificative de ±2.0-ori și de bună calitate au fost alese pentru validare, așa cum este definit de software. În plus, alți miARN-uri au fost aleși pe baza clasificării valorilor lor p și a implicării lor în studiile anterioare în DKD și căile legate de DKD, prin care miARN-urile cu cel mai mare număr de ținte presupuse de ARN mesager au fost alese. Tabelul suplimentar online 2 prezintă criteriile suplimentare utilizate pentru selectarea miARN-urilor pentru validare. În analiza de validare, expresia miARN a fost normalizată la SNORD95, deoarece metoda medie globală a Ct nu a fost adecvată și Ct > 35 a fost considerată o expresie negativă. Pentru a standardiza, am reanalizat RE al miARN-ului selectat în cohorta de screening pe baza normalizării SNORD95, iar aceasta a fost folosită pentru analiza ulterioară în comparație cu cohorta de validare.

Analize statistice

Normality check of continuous variables was done using both statistical tests (Shapiro-Wilk, Kolmogrov-Smimov, skewness, and kurtosis) and visual inspection of plots (histogram, normal Q-Q, and detrended normal Q-Q). Continuous data were presented as either mean ± standard deviation or median (interquartile range). A comparison of 2 independent groups was done using an independent samples t-test (Tables 2–4). Comparison of >2 grupuri independente au fost realizate folosind testul Kruskal-Wallis pentru probe independente (Tabelul 1). Compararea variabilelor categorice a fost făcută folosind fie testul χ2 al contingențelor, fie testul exact al lui Fisher (Tabelul 1). Corelația dintre miRNA RE selectat și variabilele continue (date demografice și clinice) a fost realizată folosind coeficientul de corelație al lui Pearson. Testul de regresie multiplă a fost utilizat pentru a analiza relația liniară dintre miRNA RE selectat și predictorii săi semnificativi. Calculele statistice au fost efectuate utilizând IBM SPSS (Statistical Package for the Social Science; IBM Corp) versiunea 25 pentru Microsoft Windows și pachetul de programe de software statistic Prism 8 (GraphPad, San Diego, CA, SUA). Semnificația statistică a fost definită ca p < 0.05.

Serviciul de asistență al Wecistanche-Cel mai mare exportator de cistanche din China:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Cumpărați pentru mai multe detalii despre specificații:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

OBȚINEȚI EXTRACT DE CISTANCHE ORGANIC NATURAL CU 25% ECHINACOSIDE ȘI 9% ACTEOSIDE PENTRU INFECȚIA RINCHILOR