Cum de a studia diversitatea genetică a Herba Cistanches?

Studiu privind diversitatea genetică a Herba Cistanches de RAPD

Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi *, Xiao Suping, Li Da

(Institutul de Chineză Materia Medica, China Academia de Medicina Chineza, Beijing 100700)

Abstract

Scop:Pentru a studia populațiadiversitatea geneticădeCistanche deserticolașiCistanche tubulosa.

Metode:Două populații sălbatice deCistanche deserticolași patru populații sălbatice deCistanche tubulosaau fost analizate de RAPD, iardiversitatea geneticădin populatii a fost analizata de versiunea software 1.31 a POPGENE.

Rezultatele:Procentul mediu de loci polimorfi deCistanche deserticolaa fost de 47,37%, locii polimorfi ai celor două populații au fost de 39,47% și 35,53%, iar diversitatea genetică medie a lui Nei a fost de 0,135 8. Shannon a fost mai mult. Indicele informațiilor de stare este 0,207 2, iar coeficientul de diferențiere a genelor Gst = 0,254 6. Procentul mediu de loci polimorfi din Cistanche a fost de 27,59%, iar procentul de loci polimorfi din fiecare populație a variat de la 19,54% la 25,29%, din care populația Andier a avut cea mai mare 25,29%, iar diversitatea genetică medie a lui Nei a fost de 0. 082 3, indicele de informații privind polimorfismul lui Shannon este de 0,1258, coeficientul de diferențiere a genelor Gst =0,175 5.

Concluzie:Cistanche deserticolașiCistanche tubulosaau o anumită diferențiere între populații. Celdiversitatea geneticădin Deșertul Cistanche este semnificativ mai mare decât cel al Cistanche tubulosa și s-a diferențiat în două ecotipuri.

Cuvinte cheie: Cistanche deserticola; Cistanche tubulosa; RAPD; diversitatea genetică

[Numărul de clasificare al bibliotecii chineze] S 567 [Cod de identificare a documentului] A [Numărul articolului] 1001-5302 (2004) 08-0727-04

Cistanche este o plantă parazitară aparținând genului Cistanche din familia Lidanaceae, cunoscută și sub numele de Dayun, care este un material medicinal chinezesc prețios. Principalele plante sursă de Cistanche deserticola în țara mea suntCistanche deserticolaY.C.Ma și C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. Plantele gazdă ale deșerticola Cistanche sunt Haloxylon ammodendron și Haloxylon ammodendron, care sunt distribuite în principal în Liga Alashan în Mongolia Interioară, nordul Xinjiang, Qinghai, Gansu, și în alte locuri. Distribuția Cistanche deserticola este aceeași cu cea a plantelor gazdă. În țara mea, Cistanche cistanche este distribuit numai în județele din jurul deșertului Taklimakan la sud de Munții Tianshan din Xinjiang, iar distribuția sa nu este complet sincronizată cu gazda Tamarix. Alte regiuni, cum ar fi nordul Xinjiang, Gansu, Qinghai, Ningxia, Mongolia Interioară, Shaanxi, și alte locuri de Tamarix Plante nu sunt parazitare Cistanche Tubula[2]. Datorită creșterii rapide a cererii pentru Cistanche în ultimii ani, care a dus la dispariția resurselor sale, resursele de cistanche sălbatică s-au redus la doar câteva zone principale producătoare. Ambele au fost enumerate ca specii de plante protejate pe cale de dispariție în țara mea [3], printre care șiCistanche deserticolaa fost inclus în apendicele II la CITES [4].

După mai mulți ani de cercetare, cercetarea privind reproducerea artificială a Cistanche a avut succes și se află în stadiul de promovare și plantare pe scară largă. Cu toate acestea, modul de prevenire a declinului speciilor Cistanche în timpul producției industriale, modul de restabilire a populației sălbatice limitate cât mai curând posibil și conservarea resurselor prețioase de germplasmă sălbatică sunt cheile pentru a obține utilizarea durabilă a acesteia. În ceea ce privește patrimoniul protejat al Cistanche [Data primirii], 2004-03-11 [Proiectul Fondului] Proiectul Ministerului Științei și Tehnologiei privind asistența socială (2001.109); Ministerul Științei și Tehnologiei "Al zecelea plan cincinal" Proiect (2001BA701A09a) [Autor corespondent] * Huang Luqi, Tel:( 010) 64014411-2955, E-mail: huangluqi @263.net Studiul transmiterii este încă gol. Acest studiu utilizează tehnologia RAPD pentru a studia 2 populații sălbatice deCistanche deserticolași 4 populații sălbatice deCistanche tubulosa, și să analizeze atât diferența îndiversitatea geneticăeste de așteptat să ofere o bază genetică experimentală importantă pentru protecția Cistanche, un medicament chinez prețios.

cistanche

1. Materiale și metode

1.1 Materiale

Cistanche deserticolaa fost colectat din comitatul Jimsar din Xinjiang și din zona Jilantai a Ligii Antice Alxa din Mongolia Interioară. Populațiile de cistanche au fost colectate din comitatul Minfeng și din comitatul Yutian, Xinjiang. Comitatul Minfeng este în prezent zona cu cel mai mare randament al Cistanche cistanche, cu cea mai mare densitate și comunități relativ complete de păduri naturale. Punctele de prelevare Andil, Sawuzek, Yatongguz și Daheyan din comitatul Yutian sunt principalele zone de producție, care sunt situate în râul Andir, râul Yeyike, râul Yatongguzi și Kelaniya În cursul inferior al râului, distanța dintre populații este mai mare de 50 km. Fiecare populație a eșantionat aleatoriu 19-30 de persoane. Probele au fost rapid uscate în silicagel și utilizate pentru extracția ADN-ului (tabelul 1).

Tabelul 1 Eșantionarea populațiilor și zonele producătoare de Cistanche deserticola și Cistanche tubulosa

1.2 Extracția ADN-ului

Metoda de extracție totală a ADN-ului utilizează o metodă cu un nivel ridicat de sare, cu pH scăzut [5]. Proba de ADN a fost supusă unui spectrofotometru pentru a detecta concentrația șablonului ADN, apoi electroforeza gelului de agaroză 1%, colorarea EB, observarea și fotografierea sub lumină ultravioletă, ADN-ul electroforeză cu benzi clare și mai puțin steril au fost utilizate pentru analiza RAPD.

1.3 Screening-ul grundurilor RAPD

Deoarece experimentul a constatat că același grund are un efect nesatisfăcător asupra amplificării simultane a ambelorCistanche deserticolași Cistanche tubulosa, grundurile au fost proiectate independent. 150 grunduri aleatoare (10 bp), 25 μL sistem de reacție din Shanghai Shenggong Biotehnologie Co, Ltd. au fost folosite pentru amplificare și screening; fiecare grund a folosit 2 șabloane de populație și 1 apă dublu distilată sterilizată ca martor și a obținut 10 grunduri pentru amplificarea Cistanche deserticola cu benzi clare, polimorfism puternic și repetabilitate bună: S490, S1 101, S1 131, S1 137, S1 165, S1 218, S1 222, S2 015, S2 112, S2 140; 10 grunduri deCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.

1.4 Amplificarea PCR și detectarea produsului

Grundurile selectate au fost folosite pentru a amplifica ADN-ul șablonului deCistanche deserticolașiCistanche tubulosaprin PCR. ADN-ul genomic a fost diluat la 50 ng·μL -1 în funcție de concentrația măsurată ca șablon. Volumul total de reacție este de 25 μL, din care 10 × tampon PCR 2,5 μL, Mg2 + 1,5 μL, Taq (5 U·μL -1) 0,2 μL, amestec dNTP (fiecare 2,5 mM) 1 μL, 5 μM Primer 1 μL, șablon ADN 1 μL, apă dublu distilată sterilizată 18,8 μL, soluția de amplificare PCR de mai sus este produsul Shanghai Sangon. Amplificarea a fost efectuată pe un motociclist termic PTC-100. Programul de amplificare a fost de pre-denaturare la 94 °C timp de 5 minute și apoi 40 de cicluri. Fiecare ciclu a inclus 94 °C 45 s, 34 °C 1 min, 72 °C 1 min 30 s și, în cele din urmă, Extindeți la 72 °C timp de 5 minute. Produsele amplificate au fost electroforizate pe un gel de agaroză de 2,0% (conținând EB) în tampon de 1×TAE și observate și fotografiate în cadrul sistemului de imagistică cu gel SYNGENE.

1.5 Statistici și analiza datelor

În spectrul electroforezei, poziția corespunzătoare a produsului de reacție pe gel este comparată în conformitate cu standardul de greutate moleculară și se estimează greutatea moleculară a produsului amplificat. Banda cu banda este înregistrată ca 1, iar banda fără bandă este înregistrată ca 0, formând un grafic matriceal 0/1 și introducând în computer, folosind POPGENE32 pentru a calcula procentul de situri polimorfe (PPL) din fiecare populație, indicele diversității genelor lui Nei (H), indicele de informații polimorfism al lui Shannon (I), coeficientul de diferențiere a genelor (Gst), diversitatea genelor (Ht),Diversitatea genetică(Hs), identitatea genetică a lui Nei (1978) (I) și distanța genetică (D) în cadrul unei populații și analiza clusterelor au fost efectuate folosind metoda UPGMA.

2. Rezultate și analize

2.1 Diversitatea genetică a Cistanche

Toate probele au obținut benzi cu o greutate moleculară cuprinsă între 200 și 2 200 bp (figura 1, 2). Un total de 76 de loci au fost depistate în 60 de probe din 2 populații deCistanche deserticola, dintre care 36 au fost loci polimorfi, reprezentând 47,37%, H = 0,135 8, I = 0,207 2. Dintre acestea, PPL-ul lui Jimsar este de 39,47%, iar cel al lui Gilanty este de 35,53%. H este 0. 0 95 3 și, respectiv, 0,1 070, iar eu sunt 0,15 12 și, respectiv, 0,163 7. Un total de 87 de loci au fost depistate la 86 de persoane din 4 populații de Cistanche, dintre care 24 au fost loci polimorfi, reprezentând 27,59%, H = 0,084 8, I = 0,1278. Cel mai mare PPL a fost Andil la 25,29%, în timp ce PPL a fost mai mic în Savuzek și Yatungusi (ambele la 19,54%). H este 0.062 1 ~ 0.080 0, eu este 0.095 0 ~ 0.116. Mărimea lui H și I este în concordanță cu tendința de mărime a PPL a fiecărei populații, iar coeficienții sunt cei mai mari din Andier, urmați de Dayan. În cazul aceluiași PPL, H-ul lui Savuzek = 0,064 1 Suma I = 0,097 0 este puțin mai mare decât 0,062 1 și 0,095 0 din Yatunguska (tabelul 2).

Figura 1 RAPD amplificat benzile unor mostre de deșertCistanche deserticola, grund S490 1 ~ 10. Garantie probe; 11 ~ 20. Jimpster probe M-ADN Marker (200 ~ 2 000 bp)

Figura 2 RAPD amplificat benzi de unele probe de Cistanche Tubulosa, grund S2 042 1-20. Xinjiang Andier probă M-ADN Marker (200 ~ 2 000 bp)

Tabelul 2diversitatea geneticădeCistanche deserticolașiCistanche tubulosaPopulaţii

2.2 Analiza variației genetice a Cistanche

În funcție de nivelul dediversitatea geneticăîn populații (Hs), diferențierea între populații (Dst) și proporția diferențelor genetice dintre populații în diferențele genetice totale (Gst), se poate observa că diversitatea genetică totală a Cistanche deserticola Ht = 0,13 5 8, unde Hs = 0,101 2, Gst = 0,254 6. Cistanche Ht=0.082 2, din care Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (Tabelul 3). Rezultatele de mai sus indică faptul că există un anumit grad de variație genetică în rândul populațiilor. Variația dintre populațiile deșertice din Cistanche deserticola a reprezentat 25,46% din variația totală, iar variația populațiilor de Cistanche tubulosa a reprezentat 17,55% din variația totală.

Tabelul 3 Analiza variației genetice aCistanche deserticolașiCistanche tubulosa.

2.3 Distanța genetică și analiza clusterelor în rândul populațiilor de cistanche deserticola

Distanța genetică a celor două populații deCistanche deserticolaeste 0.080 0, iar identitatea genetică este 0.9231. Distanța genetică a celor patru populații de Cistanche a fost de 0,012 0~0,031 5, iar identitatea genetică a fost de 0,9690~0,988 1 (Tabelul 4). Gruparea indivizilor Cistanche deserticola și cistanche tubulosa arată că deșerticola Cistanche poate fi grupată în două grupuri distincte în funcție de populație, în timp ce diferiții indivizi ai cistanche tubulosa nu pot fi grupați în funcție de populație, ceea ce indică, de asemenea, că diferențierea genetică între populațiile de cistanche deserticola este relativ ridicată. Mare, dar diferențierea genetică între populațiile de Cistanche tubulosa este mic.

Tabelul 4 Identitatea genetică (stânga jos) și distanța genetică (dreapta sus) acistanche tubulosa.

3. Discuții

3.1 Diversitatea genetică a Cistanche

Nivelul dediversitatea geneticăplantelor este inseparabilă de caracteristicile lor biologice, habitatele, originea și evoluția lor. Printre acestea, sistemul de reproducere, gama de distribuție, forma de viață și metodele de dispersie a polenului și a semințelor au cea mai mare influență [6]. Conform rezultatelor statistice ale datelor de alozime a 499 de specii de plante din 165 de genuri de Ge Song et al. [7], polimorfismul Cistanche la nivel de specie ar trebui să fie de aproximativ 50%, iar polimorfismul la nivelul populației ar trebui să fie de aproximativ 40%. În jur de 0,17. Nivelurile de polimorfism obținute în acest experiment sunt toate mai mici decât aceste valori medii. În același timp, în comparație cu nivelurile de loci polimorfi obținuți prin metode RAPD pentru mai multe plante comune pe cale de dispariție, cum ar fi 32% din speciile pe cale de dispariție Bradul de argint[18], 22,5% din bujorul pitic și 27,6% din bujorul purpuriu[9] ] Se poate observa că diversitatea genetică a bujorului pitic și 27,6% din bujorul purpuriu[9] ] Se poate observa că diversitatea genetică a bujoruluiCistanche deserticola este puțin mai mică decât nivelul mediu, în timp ce diversitatea genetică a Cistanche tubulosa este deja extrem de scăzută.

3.2 Motive pentru diversitatea genetică scăzută a Cistanche

Cistanche este o plantă parazitară specifică, distribuită în zone deșertice înguste în același timp. Prin urmare, stilul de viață unic și zona de locuit relativ îngustă pot fi motivul inerent pentru carediversitatea geneticădin Cistanche este în general mai mică decât cea a plantelor obișnuite.

Diferența îndiversitatea geneticăîntre Cistanche deserticola și Cistanche tubulosa pot fi legate de diferența din gama de distribuție a celor două și dacă acestea sunt sincronizate cu distribuția gazdă. Zona de distribuție a Cistanche tubulosa este semnificativ mai mică decât cea a deșerticola Cistanche, iar distribuția sa este extrem de sincronizată cu planta gazdă. Studiile au arătat că există o mare diversitate în rândul speciilor Tamarix. De exemplu, Zhang Juan et al. a raportat că diversitatea genetică a Tamarix sibiricus a fost de până la 98,7 %[10], în timp ce diversitatea genetică a Cistanche este extrem de slabă, indicând evoluția pe termen lung. Este posibil ca Cistanche tubulosa să fi experimentat blocaje grave în istorie, ducând la pierderea unei cantități mari dediversitatea genetică.

Totodată, potrivit cercetărilor, s-a constatat că niciuna dintreCistanche deserticolala 20 km de așezările umane ar putea fi descoperite și înflorite în mod normal. Gropile mari și mici ale Cistanchei au fost excavate, în special în principalele zone producătoare ale florii tubului Cistanche. Prin urmare, a fost cauzată de o cantitate mare de excavare. Lipsa provenienței și distrugerea habitatului pot fi principalele motive create de om pentru persoanele cu un nivel scăzutdiversitatea geneticădin Cistanche.

3.3 Diferențierea genetică a Cistanche

Datorită distanței geografice dintre Xinjiang și Mongolia Interioară, izolarea geografică a cauzat diferențierea și izolarea întreCistanche deserticolapopulațiile și cele două populații au format ecotipuri diferite genetic diferite datorită adaptării lor la condițiile de habitat locale. Din cauza gamei sale de distribuție înguste și a schimburilor frecvente de gene între populații, diferențierea genetică între populații este mai mică decât cea a Cistanche deserticola.

3.4 Recomandări pentru protecția Cistanche

Diversitatea geneticăeste condiția prealabilă pentru supraviețuirea pe termen lung a speciilor pentru a evita dispariția. Reducereadiversitatea geneticăva reduce capacitatea populațiilor de a se adapta la schimbările de mediu atât pe termen scurt, cât și pe termen lung [11]. Prin urmare, protejarea diversității genetice a Cistanche este foarte importantă pentru protejarea acestui medicament chinez rar și prețios. Deoarece Cistanche este o specie cu un tip ecologic special, aceasta ar trebui protejată în principal in situ, iar baza de protecție naturală Cistanche ar trebui să fie stabilită în funcție de diversitatea sa genetică. De exemplu, pentruCistanche tubulosa, deoarece diversitatea genetică provine în principal din interiorul populației, populațiile cu o mare diversitate genetică vor fi obiectele de protecție prioritare [12], cum ar fi Angier minfeng și Daheyan yutian poate fi Acesta este listat ca o bază de protecție naturală pentru Cistanche. În ceea ce priveșteCistanche deserticola, populațiile din Mongolia Interioară și Xinjiang au suferit schimbări semnificative, astfel încât cercetarea experimentală ar trebui consolidată în continuare pentru a determina populațiile care sunt prioritizate pentru protecție. În același timp, efectuați cercetări de bază privind biologia reproductivă și ecologia polenizării din Cistanche pentru a oferi informații pentru protecția ulterioară a acesteia.

Referinţe

[1] He Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei, et al. IdentificareaCistancheși investigarea materialelor medicamentoase comerciale. Materiale medicinale chinezești, 1997, 20(3):117.

[2] Liu Mingting. Cercetare cuprinzătoare și aplicarea generală a plantelor Tamarix. Lanzhou: Lanzhou University Press, 1995.

[3] Fu Guoli. Cartea Roșie a Plantelor Chinezești. Beijing: Science Press, 1992.

[4] Biroul de gestionare a importului și exportului de specii pe cale de dispariție din Republica Populară Chineză, Comitetul științific al speciilor pe cale de dispariție din Republica Populară Chineză. Convenția privind comerțul internațional cu specii ale faunei și plantelor sălbatice pe cale de dispariție (CITES), apendicele II. 2003.41.

[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding, et al. Extragerea și identificarea ADN-ului total al mai multor plante pe cale de dispariție și al rudelor acestora. Acta Botanica, 1994, 36:528.

[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. Sistemul de ameliorare a plantelor, structura genetică și protecțiadiversitatea genetică. Biodiversitate, 1996, 4(2): 92.

[7] Chen Jiakuan, Yang Ji. Biologia evoluționistă a plantelor. Wuhan: Wuhan University Press, 1994.

[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming, et al. RAPD analiza diversității genetice a bradului de argint. Chinese Science (C), 1997, 40 (2): 145.

[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen, et al. Un raport preliminar privind analiza RAPD a bujorului pitic și a bujorului violet. Jurnalul chinez de taxonomie a plantelor, 1995, 33 (4): 350.

[10] Zhang Juan, Yin Linke, Zhang Daoyuan. Un studiu preliminar privindDiversitatea geneticăde populații naturale de Tamarix lanceolate. Yunnan Botanical Research, 2003, 25(5):557.

[11] Ellstrand N C, Elam D R. Consecințe genetice ale populației de dimensiuni mici ale populației: Implicații pentru conservarea plantelor. Revista anuală Ecologie și sistematică, 1993, 34:217.

[12] Liu Zhanlin, Zhao Guifang. Principiul geneticii populației și aplicarea acestuia în protecția plantelor rare și pe cale de dispariție. Biodiversitate, 1999, 7(4): 340.

De la: China Journal of Chinese Materia Medica; Vol. 29, Numărul 8 august 2004