Cistanche Glyside Rg1 ameliorează fibroza hepatică indusă de îmbătrânire prin inhibarea inflamazomului NOX4/NLRP3 la șoarecii SAMP8

Abstract.Îmbătrânireeste adesea însoțită deleziuni hepaticeșifibroză, ducând în cele din urmă la un declin înfuncția hepatică. Cu toate acestea, mecanismul deleziuni hepatice induse de îmbătrânireșifibrozănu este încă pe deplin înțeles, după cunoștințele noastre, și în prezent nu există opțiuni de tratament eficiente disponibile pentru îmbătrânirea ficatului. S-a raportat că Cistanche Glycoside Rg1 (Rg1) exercită efecte anti-îmbătrânire puternice datorită activității sale antioxidante și antiinflamatorii puternice. Prezentul studiu și-a propus să investigheze efectul protector și mecanismul de acțiune subiacent al Rg1 înleziuni hepatice induse de îmbătrânireșifibrozăînsenescență acceleratășoareci predispuși la șoarece 8 (SAMP8) tratați timp de 9 săptămâni.

Faceți clic aici pentru a obține mai multe informații despre Cistanche Tratament anti-îmbătrânire pentru ficat

Rezultatele histopatologice au arătat că aranjarea hepatocitelor a fost dezordonată, degenerarea asemănătoare vacuolelor a avut loc în majoritatea celulelor, iar colagenul IV și TGF- Nivelurile de expresie 1, care au fost detectate prin imunohistochimie, au fost, de asemenea, reglate semnificativ la nivelul grupului SAMP8. Tratamentul cu Rg1 sa îmbunătățit semnificativleziuni hepatice induse de îmbătrânire și fibrozăși a redus semnificativ nivelurile de expresie ale colagenului IV și TGF- 1. În plus, rezultatele colorării cu dihidroetilenă și Western blotting au arătat că tratamentul cu Rg1 a redus semnificativ nivelurile speciilor reactive de oxigen (ROS) și IL-1 și a reglat în jos nivelurile de expresie ale NADPH oxidazei 4 (NOX4), p47phox, p22phox, fosforilat-NF-κB, caspaza-1, proteină asemănătoare apoptozei, care conține un domeniu de recrutare a caspazei C-terminale și domeniul pirinei din familia NLR care conține inflamazomul 3 (NLRP3), care au fost reglați semnificativ în țesuturile hepatice ale șoarecilor vârstnici SAMP8. În concluzie, constatările prezentului studiu sugerează că Rg1 se poate atenualeziuni hepatice induse de îmbătrânire și fibrozăprin reducerea stresului oxidativ ROS mediat de NOX4 și inhibarea activării inflamazomului NLRP3.

Introducere

Fibroza hepatică este un proces dinamic asociat cu depunerea și resorbția continuă a matricei extracelulare, în principal a colagenului fibrilar (3), care este adesea primul pas în distorsiunea și disfuncția arhitecturală care împiedică funcționarea normală a ficatului (4). Dacă nu este tratată, fibroza hepatică poate duce la ciroză hepatică avansată și hepatom (4). Dovezile acumulate au sugerat că susceptibilitatea la fibroză hepatică și hepatită crește semnificativ odată cu vârsta (5). Astfel, rămâne de mare importanță să studiem îmbătrânirea ficatului și mecanismele care stau la baza asociate pentru a oferi strategii noi pentru a preveni fibroza hepatică legată de îmbătrânire.7

receptorul de recunoaștere al caspazei-1 și proteinei de tip speck asociate apoptozei, care conține un domeniu de recrutare a caspazei C-terminal (ASC). Conform descoperirilor din studiile anterioare, s-a descoperit că inflamazomul NLRP3, un tip de inflamazom exprimat omniprezent în numeroase țesuturi, inclusiv ficatul, este implicat în evoluția fibrozei hepatice și în progresia leziunilor hepatice și a bolilor hepatice legate de vârstă ( 20-22). Când este activat de diverși iritanți, cum ar fi cristalele de ATP și colesterol, precum și agenți patogeni bacterieni, virali și fungici (23,24), inflamazomul NLRP3 răspunde la inflamație prin promovarea maturării unei serii de citokine proinflamatorii, cum ar fi IL-1. și IL-18 (25). În plus, s-a raportat că acumularea excesivă de ROS a activat inflamazomul NLRP3 în ficat în timpul procesului de îmbătrânire, ducând în cele din urmă la boli hepatice asociate îmbătrânirii (26).

Materiale și metode

Animals and treatment. In total, 9 male senescence‑accelerated resistant mouse 1 (SAMR1) and 45 male SAMP8 mice (both age, 6 months; weight, 30‑40 g) were purchased from the Department of Experimental Animal Science, Peking University Medical Science Center (Beijing, China). The mice were maintained in an environmentally controlled room (temperature, 22‑25˚C; relative humidity, 50‑70%) under a 12‑h light/dark cycle with unlimited access to food and water. The SAMP8 mice were randomly divided into five groups (n=9 in each group): i) SAMP8 model group; ii) SAMP8 + apocynin (50 mg/kg) group; iii) SAMP8 + tempol (50 mg/kg) group; iv) SAMP8 + Rg1 (5 mg/kg) group; v) SAMP8 + Rg1 (10mg/kg) group; and vi) SAMR1 mice group, which were used as the control group. The treatments were administered intragastrically (0.1 ml/10 g body weight), and the mice treated with either apocynin (MilliporeSigma), tempol (MilliporeSigma) or Rg1 (content >98 la sută; Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.) o dată pe zi timp de 9 săptămâni. Grupurile SAMP8 și SAMR1 au fost tratate cu apă distilată timp de 9 săptămâni. După 9 săptămâni de tratament, șase șoareci din fiecare grup au fost sacrificați prin dislocare cervicală. Ficatii au fost recoltați și depozitați la -80˚C pentru utilizare ulterioară în experimente de western blot sau plasați

tome (Leica CM3050; Leica Microsystems GmbH) la ‑20˚C. Secțiunile au fost spălate cu PBS și incubate cu 5 mg/l soluție Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) la temperatura camerei timp de 5 minute. Apoi, secțiunile au fost sigilate cu un agent de stingere anti-fluorescență (Beyotime Institute of Biotechnology) și vizualizate folosind un microscop cu fluorescență (Olympus IX72; Olympus Corporation; mărire, x400). Software-ul Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.) a fost utilizat pentru a detecta densitatea medie a fluorescenței roșii din trei câmpuri vizuale selectate aleatoriu în fiecare secțiune pentru a indica producția de ROS.

Examenul patologic al țesutului hepatic.

Modificările morfologice ale ficatului au fost examinate utilizând tehnicile H&E, periodic acid-Schiff (PAS) și tehnicile de colorare tricrom Masson. Colorația H&E este cea mai comună metodă de observare a modificărilor patologice în țesuturi (38). Pe scurt, specimenele de ficat au fost fixate în paraformaldehidă 4% timp de 24-48 de ore, deshidratate și încorporate în parafină, apoi tăiate în secțiuni groase de 5 µm. Secțiunile hepatice (n=4) au fost deparafinate în xilen și rehidratate în serii de alcool gradat (etanol anhidru, 85% etanol, 75% etanol), apoi colorate cu hematoxilină timp de 3 minute și eozină timp de 30 de secunde. Toate aceste etape au fost efectuate la temperatura camerei. Secțiunile au fost sigilate cu rășină neutră și observate folosind un microscop cu lumină (Olympus IX72; Olympus Corporation; mărire, x200).

Colorație imunohistochimică.

Secțiunile încorporate în parafină (n=4) au fost deparafinate și rehidratate, conform metodei descrise pentru colorarea H&E. Apoi, secțiunile au fost incubate cu 3% H2O2 timp de 10 minute la 37°C pentru a bloca activitatea peroxidazei endogene înainte de a fi scufundate în tampon citrat de sodiu la fierbere timp de 7 minute într-un cuptor cu microunde pentru recuperarea antigenului. Ulterior, secțiunile au fost incubate cu 10% ser de capră (nr. cat. C0265; Institutul de Biotehnologie Beyotime) la 37 °C timp de 30 de minute pentru a bloca legarea nespecifică. Secțiunile au fost apoi incubate cu următorii anticorpi primari la 4°C peste noapte: Anti-colagen policlonal de iepure IV (1:100; Bioworld Biotechnology, Inc.; nr. cat. BS1072), anti-NLRP3 policlonal de iepure (1:100; Bioworld Biotechnology, Inc.; cat. nr. BS90949) și anti-TGF-1 policlonal de iepure (1:100; Abcam; cat. nr. ab92486).

Western blot.

Proteina totală a fost extrasă din țesuturile hepatice (n{{0}}) utilizând tampon de liză RIPA (nr. cat. P0013B; Institutul de Biotehnologie Beyotime) și o mașină automată de măcinat rapid pentru mostre (Jinxing Industrial Development Co.,Ltd). .) la 65 Hz timp de 60 sec la 4˚C. Proteina totală a fost cuantificată folosind un kit de analiză a proteinei BCA și proteinele (20 ug) au fost separate prin 8-15% SDS/PAGE. Proteinele separate au fost ulterior transferate pe membrane PVDF (MilliporeSigma) și blocate cu 5% lapte degresat în tampon TBS-0,05% Tween-20 (TBST) timp de 1 oră la temperatura camerei. Membranele au fost apoi incubate cu următorii anticorpi primari peste noapte la 4˚C: Anti-NLRP3 (1:1,000; Bioworld Biotechnology, Inc.; cat. nr. BS90949), anti-ASC (1:1). ,000; BIOSS; cat. nr. bs-67412-R), anti-caspază-1(1:1,000; Abcam; cat. nr. ab1872), anti-IL-1 (1:500; Abcam;nr. cat. ab9722), anti‑NOX4 (1:1,000; Bioworld Biotechnology,Inc.; nr. cat. BS60435), anti‑p47phox (1:1,{ {40}}; Bioworld Biotechnology, Inc.; cat. nr. BS4852), anti‑p22phox (1:1,000;Bioworld Biotechnology, Inc.; cat. nr. BS60290), anti‑NF‑κB p65 (1:1,000; Wuhan Service Technology Co., Ltd.;

După incubarea anticorpilor primari, membranele au fost spălate cu TBST de trei ori (10 minute de fiecare dată) și incubate cu IgG de capră anti-iepure conjugată cu HRP (1:10,000; Affinity Biosciences; cat. nr. S. 0001) și anticorpi secundari IgG anti-șoarece de capră (1:10.000 Affinity Biosciences; cat. nr. S0002) timp de 1 oră la temperatura camerei. Benzile de proteine ​​au fost vizualizate folosind un kit ECL (Bio‑Rad Laboratories, Inc.) și un sistem de imagistică Bioshine Chemi (Q4600 Mini; Shanghai Bioshine Technology). Densitatea optică a fiecărei benzi a fost semi-cuantificată folosind software-ul ImageJ 1.53a (National Institutes of Health) și normalizată la expresia GAPDH.

Analize statistice.

Toate datele sunt prezentate ca medie ± SD a Mai mare sau egală cu 3 experimente independente. Pentru efectuarea analizelor statistice a fost utilizat software-ul GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, Inc.). ANOVA unidirecțională urmată de testul post-hoc al lui Tukey a fost efectuat pentru a compara diferențele dintre grupuri. P< 0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

Rezultate

explorați dacă Rg1 atenuează fibroza hepatică legată de îmbătrânire, depunerea de colagen a fost măsurată în țesuturile hepatice folosind colorația lui Masson. Rezultatele au arătat că zonele pozitive albastre au fost semnificativ crescute în țesuturile hepatice ale grupului SAMP8 în comparație cu grupul SAMR1 (Fig. 2A și B). Cu toate acestea, în comparație cu grupul model SAMP8, nivelurile de depunere de colagen au fost semnificativ reduse în grupurile de tratament cu tempol, apocinină și Rg1 (5 și 10 mg/kg) (Fig. 2A și B). În plus, nivelurile de expresie ale colagenului IV și TGF-1 au fost măsurate în țesuturile hepatice prin utilizarea colorării imunohistochimice.

Rezultatele colorațiilor cu colagen IV au arătat că colagenul IV a fost exprimat la niveluri scăzute în țesuturile hepatice din grupul SAMR1 (Fig. 3A și C). Cu toate acestea, în comparație cu grupul SAMR1,

Tratamentul cu Rg1 reduce producția de ROS și expresia NOX4 în ficatul șoarecilor SAMP8. ROS este un factor important în dezvoltarea fibrozei hepatice (41). În studiul de față, o sondă ROS, DHE, a fost utilizată pentru a detecta nivelul producției de ROS în țesuturile hepatice. Rezultatele au arătat că au existat niveluri scăzute de producție de ROS în țesuturile hepatice din grupul SAMR1. Cu toate acestea, în comparație cu grupul SAMR1, nivelurile de producție de ROS au crescut semnificativ în grupul SAMP8 (Fig. 4A și B), în timp ce în comparație cu grupul SAMP8, tratamentul cu tempol, apocinină și Rg1 (5 și 10 mg/kg) a fost semnificativ. a redus nivelurile producției de ROS în țesuturile hepatice (Fig. 4A și B). Pentru a confirma efectul NOX4 asupra acumulării de ROS în timpul îmbătrânirii, au fost analizate nivelurile de expresie ale proteinelor legate de NOX4. Rezultatele au demonstrat că, în comparație cu grupul SAMR1, nivelurile de expresie ale NOX4, p22phox și p47phox în țesuturile hepatice au fost reglate în mod semnificativ în grupul SAMP8 (Fig. 5A-D).

Cu toate acestea, în comparație cu grupul SAMP8, tratamentul cu tempol, apocinină și Rg1 (5 și 10 mg/kg) a redus semnificativ nivelurile de expresie ale NOX4, p22phox și p47phox în țesuturile hepatice în timpul îmbătrânirii (Fig. 5A-D). Aceste date au sugerat că tratamentul cu Rg1 poate ameliora leziunea de stres oxidativ indusă de ROS în țesuturile hepatice prin inhibarea NOX4 în timpul îmbătrânirii la șoareci.