Cistanche Tubulosa protejează neuronii dopaminergici prin reglarea apoptozei și a factorului neurotrofic derivat din celulele gliale: in vivo și in vitro-Ⅰ

INTRODUCERE

Boala Parkinson (BP) este o boală neurodegenerativă frecventă care apare la persoanele în vârstă cu manifestări patologice ale pierderii neuronilor dopaminergici din substanța neagră (SN) din cauza degenerării. Severitatea bolii este corelată cu pierderea celulelor neuronale de dopamină (DA) în SN, ceea ce este în concordanță cu opinia că neurodegenerativeleprocesul progresează de-a lungul multor ani înainte de apariția oricăror simptome (Sawle și Myers, 1993). Natura progresivă a bolii sugerează posibilități interesante de intervenție terapeutică prin blocarea procesului neurodegenerativ subiacent. Căutarea unor acțiuni puternice și specifice induse de terapie ale factorilor neurotrofici asupra supraviețuirii neuronului DA este, prin urmare, de un interes considerabil.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCĂ PENTRU PROTECȚIA NEURONII DOPAMINERGIC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Factorii neurotrofici sunt proteine ​​esențiale, inclusiv factorul de creștere a nervilor (NGF), factorul neurotrofic derivat din creier (BDNF) și factorul neurotrofic derivat din celulele gliale (GDNF), care promovează creșterea nervilor, dezvoltarea neurologică, ghidarea axonală și funcția neuronală. Dintre toți factorii neurotrofici care protejează și promovează repararea neuronilor dopaminergici, GDNF are cele mai puternice efecte (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). S-a demonstrat că GDNF posedă efecte neurotrofice puternice asupra neuronilor DA in vitro (Lin și colab., 1993) și exercită efecte neuroprotective in vivo. S-a demonstrat că GDNF salvează neuronii DA nigrali de la moartea celulelor induse de leziune după axotomie chirurgicală sau indusă de toxine la șobolani (Beck și colab., 1995; Kearns și Gash, 1995; Sauer și colab., 1995) și parțial, de asemenea, după administrarea sistemică aN-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridină (MPTP)la şoareci (Tomac şi colab., 1995). Incidenta crescuta a apoptozei neuronale si efectele protectoare reduse ale factorilor neurotrofici, potential declansate de diversi factori patologici, stau la baza degenerarii neuronilor dopaminergici (Holden et al., 2006).

C. tubulosa este un medicament pe bază de plante care provine din mai multe plante din genul Cistanche. Este o opțiune terapeutică majoră pentru sindromul de deficiență renală, care este strâns legată de hormonii androgeni din medicina tradițională chineză (TCM). Până în prezent, o mulțime de cercetări clinice și de bază privind C. tubulosa au arătat activitățile bolilor neurodegenerative. Identificarea prescripțiilor de tonifiere a rinichilor TCM în tratamentul PD poate oferi astfel un tratament clinic alternativ pentru PD.Echinacozid (ECH)este o componentă bioactivă majoră găsită în planta medicinală C. tubulosa. Studiile au arătat efectele terapeutice ale glicozidelor Cistanche și ECH,verbascozid(VER) și icariin (ICA) pentru boala Alzheimer (AD), PD și alți pacienți cu demență vasculară (Urano și Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). Wu şi colab. (2014) au sugerat că extractele de C. tubulosa care au conținut suficient ECH și acteozidă au ameliorat disfuncția cognitivă cauzată de A -42 prin blocarea depunerilor de amiloid și inversarea funcției neuronale dopaminergice colinergice și hipocampice. Tao și colab. (2015) au constatat căglicozide feniletanoidede la C. tubulosa (Ph Gs-Ct) a prevenit edemul cerebral la altitudine mare prin scăderea expresiei proteinei și ARNm a AQP4 în țesutul cerebral al modelelor de șobolani.

SNACKS NATURAL CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT IMBUNĂȚĂȚI MEMORIA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Studiile anterioare au arătat că compușii din plante chineze, inclusiv cele trei ingrediente ale C. tubulosa, epimedium și rhizoma polygonati, au atenuat deteriorarea neuronilor dopaminergici și au crescut nivelurile de dopamină prin reglarea expresiei factorilor neurotrofici (Wu et al., 2013). Astfel, nu se știe încă dacă efectele neuroprotectoare induse de C. tubulosa sunt de lungă durată și în ce măsură salvarea neuronilor DA nigrali prin administrarea de GDNF poate permite păstrarea semnificativă a comportamentelor motrice relevante pentru simptomatologia animalelor PD. Acest studiu a folosit o rețetă de tonifiere a rinichilor TCM, nanopulbere de C. tubulosa, care a primit un brevet național (număr de brevet: 2011103028541) în China și a demonstrat anterior un anumit efect terapeutic în PD. Prin urmare, prezentul studiu a fost conceput pentru a examina efectele neuroprotective și regenerative ale tratamentului cu C. tubulosa și pentru a investiga apoptoza asupra celulelor MES23.5 și a șobolanilor definitivi comportamentali și reglarea GDNF, măsurată printr-o baterie de teste țintă. .

MATERIALE ȘI METODE

Materiale, reactivi și echipamente

C. tubulosa a fost achiziționat de la Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Beijing, China. ECH, VER și ICA provin de la Institutele Naționale pentru Controlul Alimentelor și Drogurilor, China. Linia de celule neuronale dopaminergice MES23.5 a fost un cadou de la profesorul Biao Chen, Laboratorul de Neurobiologie, Universitatea de Medicină Capitală, Beijing, China. Cincizeci de șoareci masculi C57BL/6 (cu o greutate de 20-25 g fiecare) au fost achiziționați de la Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (număr de licență: SCXK2012-0002), Shanghai, China.

MPP+, MTT și glutamina au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, SUA); Mediul DMEM/F12 și serul fetal bovin au fost achiziționate de la Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, SUA); și MPTP, standard DA și standard de acid homovanilic (HVA) au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, SUA). -actină, Bax, Bcl2, GDNF, anticorpi alfa receptorului familiei GDNF (GFR 1) și Ret au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, SUA); Trusa de reactivi de colorare cu 3,3'-diaminobenzidină (DAB) a fost achiziţionată de la Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, China); și trusa de preparare a probei de gel SDS-PAGE, trusa de detecție cu chemiluminiscență îmbunătățită ultrasensibilă (ECL) și testul acidului bicinchoninic (BCA) au fost achiziționate de la Institutul de Biotehnologie Beyotime (Beijing, China).

Acest studiu a folosit următoarele instrumente: cititor de microplăci ELX800 (Bio Tek Winooski, VT, SUA); Incubator cu CO2 (Heraeus, Hanau, Germania); Sistem de analiză a imaginilor pe gel Gel DOC 2000, celulă de electroforeză și rezervor de electroforeză (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA); Analizor de proteine ​​DU-650 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, SUA); centrifuga frigorifica de mare viteza 5417R (Eppendorf, Hamburg, Germania); Moara planetară cu bile dublă SXQM (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, China); Moara mixer MM400 (Retsch GmbH, Haan, Germania); Cromatografie lichidă de înaltă performanță Agilent 1200 (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA); Electroforeză PowerPac Basic, sistem de transfer transmembranar PowerPac Basic, imager cu chemiluminiscență Universal Hood II, sistem de transcripție inversă ARN Thermal Cycler S1000 (Bio-Rad); Sistem de analiză a imaginii de țesuturi și celule Motic Med 6.0 (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, China).

Pregătirea deC. tubulosaNanopulbere

C. tubulosa a fost cântărită, apoi purificată și deshidratată. După pulverizarea convențională, pulberea fină de C. tubulosa a fost trecută printr-o sită cu plasă 200-și uscată prin congelare. Pentru a prepara nanopulbere de C. tubulosa s-a folosit o moară cu bile cu vid cu temperatură controlată și de înaltă energie. În primul rând, nanopulbere brută de C. tubulosa a fost plasată într-un rezervor de măcinare cu bile în vid care a fost încărcat cu bile de măcinat cu carbură. Raportul dintre bile de măcinare și nanopulbere de C. tubulosa a variat de la 15:1 la 5:1. Pentru a obține o pulbere fină, viteza și durata morii cu bile de înaltă energie au fost setate la 300 rpm și, respectiv, 20 min. Pulberea fină a fost cântărită pentru prelucrarea materialelor la scară nanometrică și prelucrată în moara de amestecare cu o frecvență de 25/s și oscilație de 20s pentru trei repetări. PBS a fost folosit pentru a dizolva și a prepara o soluție stoc de 25 mg/mL, urmată de 30 de minute de ultrasunere, autoclavare și, în final, depozitare la -20◦C.

Controlul calității componentelor active aleC. tubulosaprin HPLC

ECH și VER au conținut gradient de eluție cu silice legată cu octadecilsilan ca umplutură, metanol ca fază mobilă A și soluție de acid formic 0,1% ca fază mobilă B. Lungimea de undă de detecție a fost de 330 nm. ICA a conținut gradient de eluție cu silice legată cu octadecilsilan ca umplutură și acetonitril-apă (30:70) ca fază mobilă. Lungimea de undă de detecție a fost de 270 nm. Proba, controlul și controlul negativ au fost măsurate ca 10 uL fiecare pentru test.

Cultură celulară și test MTT pentru a măsura viabilitatea MPP+-Celule tratate

Celulele MES23.5 au fost inoculate cu 5% ser fetal de vițel, 1% glutamină, 2% 50x soluție Sato și mediu DMEM/F12 cu 2% penicilină/streptomicina. Au fost incubate la 37◦C într-un incubator cu 5% CO2 cu umiditate saturată. Celulele au fost izolate și trecute cu 0,25% tripsină și suspensia de celule a fost recoltată în faza de creștere logaritmică. Celulele izolate cu o densitate de 1 × 105 au fost însămânțate în plăci de godeuri 96- acoperite cu polilizină, urmate de adăugarea de concentrații finale diferite (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 și 800 µmol/L ) din media MPP+. Celulele MES23.5 care au fost incubate cu mediu de cultură normal timp de 24 de ore și 48 de ore au fost utilizate ca martori negativi în experimentele in vitro. Celulele din diferitele grupuri de tratament au fost incubate cu reactiv MTT timp de 4 ore. Soluția din godeuri a fost ulterior aruncată și s-au adăugat 150 uL de DMSO și s-au oscilat timp de 10 min. Absorbanța fiecărei probe la o lungime de undă de 570 nm a fost măsurată folosind un cititor automat de microplăci. Procentul de viabilitate celulară (%)=absorbanța medie a grupului experimental/absorbanța medie a grupului martor negativ × 100%.

Concentrațiile relevante de mediu MPP+ au fost adăugate pentru tratamentul de 24-oră în celulele MES23.5 folosind aceeași abordare ca și pentru cultura in vitro. După tratament, soluția din godeu a fost aruncată. Medii care conţin diferite concentraţii (10, 50, 100, 200, 250, 500 şi 1000 pg/mL) de nanopulbere de C. tubulosa a fost adăugat la celulele MES23.5 în godeuri diferite şi lăsat la incubat timp de 24 ore şi 48 de ore. Celulele MES23.5 care au fost incubate cu mediu de cultură normal timp de 24 de ore și 48 de ore au fost utilizate ca martori negativi. Celulele MES23.5 care au fost incubate cu mediu MPP+ au fost utilizate ca vehicul. Măsurătorile au fost făcute în trei exemplare pentru fiecare probă. Absorbanța grupurilor de tratament și de control corespunzătoare a fost măsurată pentru a calcula viabilitatea celulară.

EXTRACT NATURAL DE CISTANCHE TUBULOSA ANTI OBOSEA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Expresia TH măsurată prin imunocitochimie

Când nanopulbere de C. tubulosa a fost în 100, 200 și 250 µg/ml, rata de supraviețuire a celulei a crescut semnificativ (Figura 2G). Astfel, în experimentele ulterioare, am testat cele trei concentrații: grupuri cu doză mică, doză medie și grupe cu doză mare. Au fost testate trei replicări pentru fiecare dintre grupurile de C. tubulosa. Lamele sterilizate, acoperite cu polilizină au fost plasate în plăci 6-godeuri. Apoi, 5 × 104 celule au fost însămânțate în fiecare godeu și incubate timp de 24 de ore. Mediul proaspăt convențional a fost înlocuit în grupul de control normal și o concentrație finală de 100 umol/L mediu MPP+ a fost înlocuită în grupurile de tratament rămase pentru incubare timp de 24 de ore. Mediile proaspete convenționale au fost apoi înlocuite în grupurile de control și vehicul normal, iar concentrațiile finale de 100, 200 și 250 µg/mL nanopulbere de C. tubulosa au fost incubate cu celule timp de 24 de ore în doze mici, moderate și mari. grupele de tratament C. tubulosa, respectiv. Celulele MES23.5 din diferitele grupuri au fost spălate de trei ori în PBS pentru a îndepărta supernatantul și fixate în continuare în paraformaldehidă 4% timp de 15 minute. După spălarea cu PBS, celulele au fost incubate cu un blocant de peroxidază la 37°C timp de 30 de minute și apoi spălate din nou cu PBS. O soluție Triton X-100 0,2% a fost utilizată pentru permeabilizarea celulelor timp de 10 minute, urmată de spălare cu PBS. Ser normal de capră a fost adăugat la fiecare probă și incubat la temperatura camerei timp de 30 de minute. Serul normal de capră a fost apoi îndepărtat și anticorpul primar diluat 1:400 în PBS a fost adăugat la fiecare probă și incubat la 4°C peste noapte. Celulele din grupul martor negativ au fost incubate cu PBS la 4°C peste noapte. După spălarea cu PBS, celulele au fost incubate cu anticorpi secundari marcați cu biotină în camera de umiditate la 37°C timp de 20 de minute. Fiecare probă a fost apoi spălată în PBS și marcată cu conjugați de peroxidază de hrean-streptavidină (soluție de lucru C) la 37 °C timp de 20 de minute. După spălarea cu PBS, celulele au fost colorate cu reactiv DAB la întuneric timp de aproximativ 1-10 minute și dezvoltarea unei culori maro a fost monitorizată la microscopie cu lumină. Fiecare probă a fost apoi spălată de două ori în apă distilată timp de 1-2 min și nucleele au fost contracolorate cu soluție de hematoxilină timp de 0,5-1 min. După clătirea temeinică a fiecărei probe în apă, celulele au fost scufundate în alcool acid clorhidric 1% pentru diferențiere și amoniac apos 1%, urmate de spălarea temeinică a celulelor în apă. Celulele din fiecare probă au fost apoi deshidratate în etanol 70% timp de 2 minute, etanol 80% timp de 2 minute, etanol 90% timp de 2 minute de două ori, etanol 95% timp de 2 minute de două ori și etanol 100% timp de 2 minute de două ori. Celulele au fost apoi scufundate în soluție de xilen timp de 2 minute de două ori și montate pe o lamă de sticlă cu rășini neutre. La microscopie luminoasă, fiecare probă a fost supusă capturii de imagini și selectării aleatorii a 5-10 câmpuri vizuale eficiente pentru a determina expresia proteinelor selectate în neuronii dopaminergici, indicată de intensitatea particulelor maro și pentru a semi-cuantifica conținutul de proteine ​​prin valoarea medie de gri. .

Rata de apoptoză a celulelor MES23.5 măsurată prin citometrie în flux

Celulele aderente au fost spălate o dată cu PBS. Pentru izolarea celulelor, a fost adăugată o cantitate adecvată de soluție de tripsină fără EDTA la temperatura camerei și soluția a fost pipetată ușor pentru a permite celulelor aderente să se desprindă. S-a adăugat apoi un mediu de cultură celulară pentru a opri tripsinizarea. Amestecul a fost transferat într-un tub de centrifugă nou și apoi centrifugat timp de 5 minute la 1500 rpm pentru a colecta celulele izolate. După eliminarea supernatantului, peletul celular a fost resuspendat ușor folosind PBS și celulele au fost numărate. Aproximativ 1 × 105 până la 5 × 105 celule resuspendate au fost centrifugate timp de 5 minute la 1500 rpm și supernatantul a fost aruncat. Cinci microlitri de soluție de legare a anexinei V-FITC au fost adăugați la peleta celulară pentru a resuspenda ușor celulele. S-au adăugat încă 5 ui de anexină V-FITC și s-au amestecat bine. Cinci microlitri de soluție de iodură de propidiu au fost utilizați pentru colorarea celulelor prin incubare la temperatura camerei timp de 10 minute cu puțin timp înainte de citometria în flux.

Analiza Western Blot pentruin vitro

Celulele au fost împărțite într-un grup normal, grup de tratament cu MPP+, cu doză micăC. tubulosagrup de tratament, grup de tratament cu doză moderată C. tubulosa și grup de tratament cu doză mare C. tubulosa. Expresia Bcl2 și Bax a fost măsurată în fiecare. Un total de 1 × 105 celule per godeu din 6-placa de godeuri au fost utilizate pentru modelare și tratament în fiecare grup înainte de recoltarea celulelor. Un lizat mixt, care conține tampon RIPA, inhibitor de protează și inhibitor de fosfatază, a fost adăugat pentru a liza celulele timp de 30 min pe gheață. După centrifugare, supernatantul a fost utilizat pentru analiza proteinelor. Proteina totală a fost cuantificată utilizând un test BCA și separată cu 10% SDS-PAGE. Proteinele separate au fost transferate pe o membrană și incubate cu un tampon de blocare a laptelui degresat 5% la temperatura camerei timp de 2 ore. Membrana a fost apoi incubată în anticorp primar (Bcl-2 0,34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, diluție 1:200) la 4°C peste noapte. După o etapă de spălare, membrana a fost incubată într-un anticorp secundar (0,5 mg/ml, diluție 1:5000) la 4°C timp de 1 oră și apoi în dezvoltator ECL timp de 2 minute pentru dezvoltarea convențională. Software-ul Quantity One a fost utilizat pentru analiza semi-cantitativă a expresiei proteinei.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ANTIOBOSOARE PROTEJĂ FICAT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Modelarea animalelor experimentale și administrarea medicamentelor

Cincizeci de șoareci masculi în vârstă de 8-săptămâni fără agenți patogeni specifici au fost împărțiți aleatoriu în cinci grupuri: un grup normal, grup de tratament MPTP (Vehicul), grup de tratament cu doză mică de C. tubulosa, tratament cu doză moderată de C. tubulosa grup și grupul de tratament cu doze mari C. tubulosa. Animalele au fost adăpostite la 20–22◦C, cu acces liber la hrană și apă. Şoarecii din grupul normal au fost injectaţi intraperitoneal cu un volum egal de soluţie salină normală timp de şapte zile consecutive. Șoarecii din celelalte grupuri de tratament au fost injectați intraperitoneal cu MPTP (30 mg/kg/zi) timp de șapte zile consecutive pentru a stabili vehicule.

În timpul modelării PD, șoarecilor din grupurile de tratament cu doză mică, doză moderată și doză mare C. tubulosa li s-au administrat intragastric volume clinice echivalente de 4 g/kg/zi, 8 g/kg/zi și 16 g/zi. kg/ziC. tubulosa nanopulbere, respectiv, timp de 14 zile consecutive. Şoarecilor din grupul martor şi vehicul li s-au administrat intragastric volume echivalente de soluţie salină normală timp de 14 zile consecutive. Toate procedurile experimentale au fost aprobate de Comitetul de etică al Universității Fujian din TCM și au fost efectuate conform principiilor acceptate la nivel internațional pentru utilizarea și îngrijirea animalelor de laborator. Toate eforturile au fost depuse pentru a minimiza suferința animalelor în acest studiu.