Cistanozidul de Cistanche Herba ameliorează daunele reproductive masculine induse de hipoxie prin suprimarea stresului oxidativ-Ⅱ

Efectele Cis asupra viabilității celulelor GC-1 induse de hipoxie in vitro.

Pentru a investiga dacă Cis poate preveni efectele inhibitoare ale hipoxiei asupra viabilității celulelor GC{{0}}, a fost efectuat un test CCK-8. Celulele GC-1 au fost tratate cu diferite subtipuri (Cis-A, B, C, H) și intervale de concentrație (0.02 μM, 0,2 μM, 2 μM) de Cis timp de 72 ore. O comparație a grupului model cu grupul DMSO a arătat că DMSO nu a promovat direct viabilitatea celulelor GC{{10}} (Figura 2A). Cu toate acestea, viabilitatea celulară a fost restabilită semnificativ (P <0.05) cu tratamente Cis. În comparație cu grupul model, Cis-A, Cis-B, Cis-C și Cis-H au prezentat toate anumite efecte de protecție asupra daunelor induse de hipoxie asupra viabilității celulelor GC-1, iar Cis-B a arătat cel mai semnificativ efect (Figura 2A). Efectele protectoare ale Cis la 0.2 μM au fost semnificativ mai mari decât efectele protectoare ale Cis la 0.02 μM, în timp ce diferența dintre 2 μM și 0,2 μM nu a fost evidentă, indicând faptul că restabilirea Viabilitatea celulelor GC-1 indusă de Cis a demonstrat o creștere dependentă de doză a intervalului de concentrație de la 0,02-0,2 μM (Figura 2A). Prin urmare, în funcție de nevoile experimentale, 0,2 μM Cis a fost selectată ca concentrație optimă în următoarele experimente in vitro. Pentru a confirma în continuare dacă celulele germinale au fost într-adevăr protejate prin colorarea Cis, FCM și Ki-67, au fost efectuate pentru a evalua alterarea proliferării celulelor GC-1 după tratamentul cu Cis. La tratamentul Cis, proporția de celule GC-1 în faza G1 a fost redusă. În schimb, mai multe celule au intrat în faza S, sugerând că tratamentul cu Cis ar putea crește indicele de proliferare a celulelor germinale (P <0,01; Figura 2B). Statisticile pentru ciclul celular GC-1 sunt prezentate în Figura 2Bb. Rezultatele colorării Ki-67 au arătat, de asemenea, că tratamentul cu Cis-A, Cis-B, Cis-C și Cis-H a îmbunătățit semnificativ raportul celular Ki{-67-pozitiv al GC indus de hipoxie{{54} } celule in vitro (Figura 2C).

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mecanismul Cis protejează celulele germinale de hipoxie in vitro.

Pentru a investiga dacă efectele protectoare ale Cis asupra celulelor GC-1 au fost legate de eliminarea ROS excesiv, colorantul fluorescent DCFH-DA a fost utilizat pentru a detecta nivelurile de ROS în fiecare grup. După cum se arată în figurile 3A și 3B, tratamentul cu DMSO nu a schimbat conținutul intracelular de ROS sau nivelul LPO în comparație cu grupul model. Cu toate acestea, nivelurile de ROS din celulele GC-1 au fost reduse semnificativ în grupurile tratate cu Cis (Figura 3A). Mai mult, a fost observată o scădere a LPO și în celulele GC-1 supuse Cis (Figura 3B).

Pentru a explora în continuare mecanismul prin care Cis protejează celulele germinale de leziuni hipoxice, au fost efectuate colorarea TUNEL și analize Western blot pentru a evalua apoptoza. Colorarea TUNEL (Figura 3C) a arătat apoptoză semnificativă în grupele model și DMSO. Cu toate acestea, au fost observate mai puține celule apoptotice cu tratamentul Cis, ceea ce a indicat că tratamentul cu Cis a redus apoptoza celulelor GC-1. În plus, expresia PARP, Caspaze-3, Bax și Bcl-2 a fost măsurată pentru a corobora mecanismul molecular. Așa cum este prezentat în Figura 3D, Caspaza-3 și PARP au fost activate în celulele GC-1 sub hipoxie, iar această activare a fost inhibată prin tratamentul Cis. În plus, raportul Bax/Bcl-2 a fost mai mare în grupul model decât în ​​grupul de control, iar tratamentul cu Cis a redus raportul Bax/Bcl-2 (Figura 3D). Aceste date au indicat că Cis avea o capacitate potențială de a atenua daunele oxidante induse de hipoxie, iar acest efect protector ar putea fi obținut prin reducerea acumulării de ROS și inhibarea activării căii de apoptoză legată de Caspasere.

Mecanismul enzimatic care inhibă OS implică captatori de radicali liberi, cum ar fi glutation reductază (GR), glutation peroxidaza (GPx) și superoxid dismutază (SOD) [23]. Mecanismul enzimatic care inhibă OS joacă un rol esențial în prevenirea daunelor oxidative în celule și țesuturi [23]. Pentru a valida în continuare mecanismul potențial al inhibării Cis a OS indus de hipoxie în celulele GC-1, au fost măsurate activitățile GR, GPx și SOD. Rezultatele au arătat că activitățile GR, GPx și SOD toate semnificativ (P <0.01, Figura 3E) au scăzut în condiții de hipoxie în comparație cu grupurile de control, iar tratamentul cu Cis le-a restabilit semnificativ activitățile în Celulele GC-1 expuse la hipoxie (P < 0,05, Figura 3E), sugerând că acești compuși ar putea activa puternicul sistem antioxidant endogen.

CISTANCHE TUBULOSA PENTRU STIMULAREA PRODUCȚIEI DE SPERME PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Efectele Cis asupra reproducerii la șobolanii induși de hipoxie hipobară.

Pentru a determina efectele hipoxiei hipobare asupra șobolanilor masculi, am testat mai întâi modificările morfologice ale testiculelor la șobolani induși de hipoxie hipobară. Rezultatele colorației HE au arătat că, în grupul de control, celulele spermatogene normale în diferite stadii au fost aranjate într-o manieră ordonată de la membrana bazală la lumen, iar spermatozoizii maturi au fost vizibili în lumenii tubulari (Figura 4A). În comparație cu martorii, s-au observat modificări patologice ale țesutului testicular în grupul model, membrana bazală a celulelor epiteliale testiculare a fost aranjată lejer, epiteliul spermatogen a fost extrem de subțire, iar nivelul și numărul de celule germinale au fost reduse semnificativ (Figura 4A) . Cu toate acestea, tratamentul cu Cis a îmbunătățit remarcabil histologia leziunilor testiculare induse de hipoxie hipobară in vivo (Figura 4A). Am măsurat, de asemenea, greutatea corporală, greutatea testiculelor, greutatea epididimului și greutatea glandei veziculelor seminale, ceea ce a condus la calcularea indicelui organelor de reproducere (raportul organului de reproducere/greutatea corporală). După cum se arată în Figura 4B-D, indicele organelor de reproducere (testiculele, epididimul și glanda veziculelor seminale) a fost semnificativ mai scăzut în grupul model (P < 0.01) decât în ​​grupul de control. Cu toate acestea, efectul hipoxiei hipobare asupra indicelui organului reproducător al șobolanilor a fost inversat cu tratamentul cu Cis (Figura 4B-D).

Apoi, activitatea enzimei acrozomale și rata spermatozoizilor vii a spermatozoizilor de șobolani masculi au fost, de asemenea, măsurate pentru a elucida afectarea funcției testiculare. După cum se arată în Figura 4E, 4F, activitatea enzimei acrozomale și motilitatea spermatozoizilor au fost mai scăzute la șobolanii din grupul model decât în ​​grupul de control (P <0.01). Cu toate acestea, în comparație cu șobolanii din grupul model, activitatea enzimei acrozomale a fost restabilită la șobolanii tratați cu 8 mg/kg/zi Cis (P <0,05) (Figura 4D). Mai mult, așa cum se arată în Figura 4F, tratamentul cu Cis de asemeneaa crescut rata spermatozoizilor vii; șobolanii tratați cu 8 mg/kg/zi Cis au prezentat toți o rată semnificativ crescută a spermatozoizilor vii (55,83 ± 6,03%, P < 0.05; 69.{ {8}} ± 2,29%, P <0,01, P < 0,05 și respectiv 53,67 ± 2,25%, P < 0,05) în comparație cu șobolanii model (43,83 ± 4,01%); .

Luate împreună, aceste rezultate au sugerat că mediul hipobaric hipobaric a dus la modificări morfologice testiculare, pierderea în greutate a organelor de reproducere și deteriorarea funcției testiculare la șobolanii masculi, iar Cis ar putea proteja eficient organele de reproducere de deteriorarea indusă de hipoxie.

Efectele Cis asupra OS la testiculele șobolanilor induși de hipoxie hipobară.

Nivelurile de ROS și LPO în testiculele șobolanilor au fost măsurate pentru a analiza efectele Cis asupra OS indusă de hipoxie hipobară. Analiza ROS a arătat că, în comparație cu grupul de control, nivelurile ROS în testiculele din grupul model au fost semnificativ crescute (P <0.01 Figura 5A). În schimb, LPO a fost crescut în mod dramatic la nivelul testiculelor (P < 0.01) în hipoxie hipobară în comparație cu condițiile normoxice (Figura 5B). Cu toate acestea, tratamentul cu Cis a modificat modificările de mai sus (P <0,05), în care Cis-B a exercitat efecte mai bune decât alte Cis (Figura 5A, 5B). Cis părea să protejeze testiculele prin reducerea OS în condiții hipobarice hipobare in vivo.

În plus, au fost efectuate analize de apoptoză pentru a evalua în continuare mecanismul prin care Cis a protejat împotriva leziunii funcției testiculare induse de hipoxie hipobară. Rezultatele colorării TUNEL (Figura 5C) au arătat că a existat apoptoză semnificativă în grupul model în comparație cu grupul de control. Cu toate acestea, după tratamentul cu Cis (8 mg/kg/zi), au apărut mai puține celule apoptotice (P <0.05) (Figura 5C). Datele Western blot au arătat, de asemenea, că hipoxia și tratamentul hipobaric au dus la activarea Caspazei-3 și PARP și o creștere a raportului Bax/Bcl{-2 în țesutul testicular, indicând o creștere a apoptozei (Figura 5D). În plus, diferite tipuri deTratamentul cisa redus semnificativ apoptoza în țesutul testicular (Figura 5D). În mod similar, analiza IHC a țesutului testicular a arătat rezultate similare (Figura 1 suplimentară).

Pentru a verifica mecanismul OS redus cu Cis declanșat de hipoxia hipobară, am testat în continuare activitățile GR, GPx și SOD în țesutul testicular. După cum se arată în Figura 5E, în comparație cu grupul de control, tratamentul cu hipoxie hipobară a redus semnificativ activitățile GR, GPx și SOD (P <0.01). Cu toate acestea, tratamentul cu Cis a restabilit activitățile enzimatice (GR, GPx și SOD) ale țesutului testicular la șobolanii tratați cu hipoxie hipobară (P < 0,05). În concluzie, Cis părea să protejeze testiculele prin activarea unui puternic mecanism de apărare endogen al enzimelor antioxidante în condiții de hipoxie hipobară.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Discuţie

În zonele de mare altitudine, se știe că hipoxia hipobară afectează mai multe sisteme la oameni, inclusiv sistemul reproducător masculin [4, 20]. Investigațiile experimentale recente sunt orientate spre înțelegerea mecanismelor modului în care hipoxia hipobară afectează sistemul reproducător masculin. În acest studiu, a fost investigat efectul terapeutic al extractului de Cis din Cistanches Herba asupra afectarii reproducerii induse de hipoxie. Rezultatele au demonstrat că Cis poate proteja sistemul reproducător masculin de daune hipoxice prin reducerea acumulării de ROS induse de hipoxie și OS prin îmbunătățirea activității enzimelor antioxidante endogene.

ROS sunt radicali liberi derivați din oxigen care joacă un rol vital în fiziologia și patologia umană. Dozele mici de ROS sunt esențiale pentrucapacitarea spermatozoizilor, reacția acrozomală și fuziunea spermatozoid-ovocite [24, 25]. Cu toate acestea, acumularea excesivă de ROS duce adesea la deteriorarea celulelor germinale și a celulelor stromale, ducând la infertilitate masculină [26]. ROS poate deteriora cu ușurință membranele celulare, acizii nucleici, proteinele, enzimele și alte macromolecule biologice prin peroxidare. Mai mult decât atât, ele conduc, de asemenea, la potențiale daune celulare și ADN-ului atunci când depășesc capacitatea de purtare a antioxidanților. Dovezile acumulate susțin rolul pivot al ROS în patogeneza fertilității masculine [27, 28]. Producția de ROS este reglată de tensiunea oxigenului. În condiții hipoxice, oxigenul disponibil în mediu scade și vâscozitatea sângelui crește, afectând astfel multe procese metabolice dependente de oxigen din organism [29, 30]. Cu toate acestea, presiunea atmosferică mai scăzută la altitudini mari determină întoarcerea venoasă slabă și o scădere a cantității de oxigen transportată de fluxul sanguin către toate celulele organismului, ceea ce crește și mai mult hipoxia organelor și celulelor [29, 30]. Astfel, expunerea la o altitudine mare dă naștere unei serii de răspunsuri fiziologice hipoxice, inclusiv producerea și acumularea de ROS, atunci când necesarul de oxigen depășește aportul vascular. După cum sa menționat anterior, acumularea de ROS duce la o varietate de efecte intracelulare, dintre care cel mai critic este provocarea OS în celule.

OS se referă la un dezechilibru între reacțiile de oxidare și reducere, ceea ce duce la generarea de oxidanți în exces sau molecule care acceptă un electron dintr-un alt reactant, care la rândul său produce ROS [31, 32]. OS este bine înțeles că poate fi declanșat de o serie de factori endogeni și exogeni, inclusiv expunerea la altitudine mare. Spermatozoizii sunt celule care sunt deosebit de sensibile la OS, având în vedere sistemele lor inadecvate de reparare a celulelor și conținutul ridicat de acizi grași polinesaturați în membrana plasmatică [33]. Țesuturile testiculare și epididimale nu fac excepție, deoarece prezența OS severă a fost observată la spermatidele rotunde la șobolanii supuși hipoxiei [4]. OS afectează stabilitatea ADN-ului, punând astfel în pericol integritatea materialului genetic al gameților [34-36]. Cu toate acestea, s-a confirmat că un nivel ridicat de deteriorare a ADN-ului în gameți masculini conduce la activarea semnalizării apoptozei, ceea ce are ca rezultat o reducere a numărului de spermatozoizi epididimal și o creștere a procentului de celule defecte [28, 37]. În studiul de față, hipoxia a redus semnificativ viabilitatea celulelor GC-1 prin inducerea apoptozei și oprirea ciclului celular. Mai important, niveluri semnificativ crescute de ROS au fost demonstrate de analiza FCM după stimularea hipoxiei, cu o rată de apoptoză crescută și activare mai mare a raportului Caspaze-3, PARP și Bax/Bcl-2, indicând faptul că ROS ar putea activa apoptoza prin activarea căii de semnalizare a caspazei în timpul leziunilor fertilității induse de hipoxie. Prezentele descoperiri au demonstrat că hipoxia a dus la acumularea excesivă de ROS, provocând leziuni oxidative celulelor reproductive. Astfel, este semnificativ să identificăm noi antioxidanți care pot servi ca o abordare eficientă pentru a atenua leziunile de fertilitate induse de hipoxie.

Pentru a proteja împotriva OS, există în organism un sistem antioxidant complex, compus în principal din factori enzimatici. În condiții fiziologice, conținutul de ROS și sistemul antioxidant mențin un anumit echilibru. Cu toate acestea, supraproducția de ROS epuizează sistemul antioxidant al spermatozoizilor, ceea ce duce la OS, care provoacă leziuni ale ADN-ului spermatozoizilor și duce la rate mai scăzute de fertilitate și sarcină [23]. Astfel, pentru a aborda supraproducția de SRO și efectele nocive asociate la nivel celular în sistemul reproducător masculin, au fost testate diferite strategii antioxidante [23]. În prezent, literatura de specialitate privind utilizarea compușilor cu activitate antioxidantă șiîmbunătățirea funcției spermatozoiziloreste extins. Important este că majoritatea rapoartelor descriu o îmbunătățire a parametrilor spermatozoizilor după aportul oral de antioxidanți, inclusivîmbunătățiri ale concentrației spermatozoizilorși motilitatea sau o scădere a leziunilor ADN [38]. Astfel, un număr tot mai mare de urologi prescriu antioxidanți orali pentru infertilitate din cauza problemelor legate de OS [39]. Acești antioxidanți includ în principal carnitine, vitamine, zinc, melatonină și compuși naturali [23, 40]. În prezent, odată cu dezvoltarea tehnologiei de extracție a medicamentelor, un număr tot mai mare de extracte de TCM sunt, de asemenea, luate în considerare pentru a atenua infertilitatea masculină, deoarece acești antioxidanți pot reduce efectele distructive ale OS [41]. Yüce A. și colab. a raportat în 2013 că scorțișoara are efecte benefice asupra echilibrului oxidativ și antioxidant în testicule și calitatea spermei [42]. Zhang L și colab. a arătat că curcumina îmbunătățește semnificativ motilitatea spermatozoizilor la pacienți și scade H2O2 [43]. În plus, s-a demonstrat că o varietate de alte extracte de plante, cum ar fi afine, crocus sativus, semințe de rodie și ceai verde, protejează sistemul reproducător prin mecanisme antioxidante [27, 44-47]. Cistanches Herba este un MTC important care posedă un profil de siguranță favorabil și funcții medicinale largi pentru tratamentul infertilității, printre alte afecțiuni [13]. Studiile farmacologice moderne au arătat că Cistanches Herba posedă diverse activități, cum ar fi activități antioxidante, antiinflamatorii, hepatoprotectoare și anti-neurodegenerative [13, 48]. Prin urmare, extractele, fracțiile sau compușii din Cistanches Herba pot avea potențiale caracteristici antioxidante pentru tratamentul infertilității.

Substanțele active din plante care îmbunătățesc fertilitatea includ diverse grupe chimice, cum ar fi PhG, saponine, compuși volatili oxigenați și alcaloizi [41]. Studiile de activitate farmacologică ale PhG au demonstrat că PhG prezintă o gamă largă de bioactivități, cum ar fi antioxidarea, neuroprotecția antiradiații și îmbunătățirea funcției sexuale [49, 50]. Printre aceste activități, antioxidarea atrage treptat atenția. S-a raportat că unele componente sau fracții unice de PhG inhibă apoptoza celulelor germinale indusă de diferite substanțe chimice, iar capacitățile lor de antioxidare in vitro au fost, de asemenea, demonstrate in vivo în mai multe modele animale [51, 52]. Aceste rezultate indică faptul că PhG ar putea fi un candidat atractiv pentrutratamentul infertilității masculine. Cis este un PhG activ care poate fi izolat din Cistanches Herba. În studiul de față, am explorat efectele Cis asupra celulelor tratate cu hipoxie sau a unui model de șobolan și am investigat mecanismele moleculare care stau la baza. Cis a prezentat activități de protecție asupra scăderii viabilității induse de hipoxie și creșteri ale apoptozei în celulele GC-1 și, de asemenea, a arătat un efect protector asupra daunelor induse de hipoxie în sistemul reproducător al șobolanilor in vivo. S-a observat o scădere semnificativă a activităților GR, GPx și SOD sub hipoxie în comparație cu grupurile normoxice, în timp ce activitățile specifice ale GR, GPx și SOD au crescut semnificativ în testiculele sau celulele GC-1 tratate cu Cis. Cis părea să protejeze testiculele și celulele GC-1 în condiții hipoxice prin îmbunătățirea activităților enzimelor antioxidante.

Antioxidanții enzimatici funcționează în principal prin captarea anionilor superoxid, prevenind astfel peroxidarea lipidelor și deteriorarea ADN-ului pentru a preveni infertilitatea. Mecanismele antioxidante enzimatice joacă un rol crucial în prevenirea daunelor oxidative [23]. Mecanismul enzimatic împotriva OS cuprinde captatori de radicali liberi și enzime dependente de glutation, inclusiv GR, GPx și SOD [12]. Se știe bine că enzimele antioxidante sunt esențiale pentru sistemul reproducător masculin. În studiul actual, efectul activităților reduse ale enzimelor antioxidante în hipoxia hipobară a fost însoțit de creșterea ROS și LPO în grupul model, ceea ce este în concordanță cu rapoartele anterioare [12]. Cu toate acestea, administrarea Cis a condus la o recuperare a activităților enzimelor antioxidante în celulele GC-1 și testiculele șobolanilor, făcând posibilă generarea de strategii pentru administrarea Cistanches Herba pentru a preveni deteriorarea indusă de hipoxie hipobară, așa cum sa sugerat anterior. Deși rezultatele prezente au arătat că tratamentul cu Cis a scăzut parțial daunele celulelor germinale induse de hipoxie la șobolani, sunt necesare investigații suplimentare pentru a dezvălui imaginea completă a efectelor sale de protecție a reproducerii. De exemplu, mecanismul specific al Cis afectează activitatea enzimelor antioxidante. În plus, se pune întrebarea dacă alte mecanisme ar putea fi, de asemenea, pertinente, deoarece Cis s-a recuperat doar parțial din afectarea reproductivă cauzată de hipoxie. În cele din urmă, trebuie luat în considerare dacă Cis are un efect direct de promovare a creșterii asupra celulelor germinale.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU MENTINEREA ACTIVITĂȚII SPERMEI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Concluzii

În general, concluziile acestui studiu subliniază potențialul Cis ca antioxidant pentru tratamentul daunelor reproductive masculine induse de hipoxie. Cis poate proteja împotriva daunelor reproductive masculine induse de hipoxie prin restabilirea activității enzimelor antioxidante, reducerea OS indusă de ROS, creșterea simultană a viabilității celulare și scăderea apoptozei. Este important că subtipurile Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C și Cis-H) studiate în acest studiu au arătat toate un anumit efect protector asupra sistemului reproducător, iar Cis-B a arătat cel mai semnificativ efect. Prin urmare, speculăm că Cis ar putea fi un bun candidat antioxidant pentrutratamentul afectarii reproducerii masculine induse de hipoxie, deși mecanismul de bază precis necesită investigații suplimentare.