Imaginirea și cuantificarea clară a rinichilor în 3D
Feb 27, 2022
De zeci de ani, măsurătorile derinichimicroanatomia folosind 2-secțiuni dimensionale ne-a oferit cunoștințe detaliate despre rinichi morfologie în condiţii fiziologice şi patologice. Cu toate acestea, dezvoltarea rapidă a metodelor de curățare a țesuturilor în ultimii ani, în combinație cu dezvoltarea de noi modalități de imagistică 3-dimensională, au oferit noi perspective asuprarinichistructura si functia. Acest articol de recenzie descrie o serie de perspective noi asuprarinichidezvoltarea și boala obținute recent folosind aceste noi abordări metodologice. De exemplu, în curs de dezvoltarerinichiaceste abordări au oferit noi înțelegeri ale morfogenezei ramificației ureterului, proliferării și angajamentului celulelor progenitoare de nefron, interacțiunile dintre celulele vârfului ureterului și celulele progenitoare de nefron și stabilirea segmentării nefronului. În întregul șoarece adultrinichi, curățarea țesuturilor combinată cu microscopia cu folie luminoasă poate imaginea și cuantifica numărul total de glomeruli, o descoperire majoră în domeniu. Abordări similare au oferit noi perspective asupra structurii vasculaturii și inervației renale, remodelarea tubulointerstițială, pierderea și hipertrofia podocitelor, formarea chistului, evoluția semilunelor celulare și structura barierei de filtrare glomerulară. Multe mai multe progrese în înțelegerearinichibiologie și patologia pot fi de așteptat pe măsură ce tehnici suplimentare de curățare și imagistică sunt dezvoltate și adoptate de mai mulți investigatori.
Cuvinte cheie:Imagini 3D; glomerul; dezvoltarea rinichilor; nefropatologie; curățarea țesuturilor; tubuli; renal
CISTANCHE VA ÎMBUNĂTĂȚI FUNCȚIA RINICHII/RENALE
Numărul total de nefroni la fiecare om normalrinichivariază de la aproximativ 200,000 la mai mult de 2 milioane, 1 având o medie de aproximativ 1 milion. Acești nefroni, precum și celelalte componente alerinichiinclusiv canalele colectoare, vasele de sânge, interstiția și fibrele nervoase sunt aranjate cu o precizie microanatomică rafinată. 2 Acest model precis stă la baza normaluluifunctia rinichilorși sănătatea, care poate fi grav perturbată atunci când arhitectura țesuturilor este alterată din cauza hipertrofiei sau contracției glomerulare sau tubulare, pierderea nefronului, anomalii congenitale, rarefacția vaselor și fibroza interstițială. O serie de abordări imagistice au contribuit la înțelegerea noastră cuprinzătoare arinichimicroanatomia în timpul dezvoltării și la adultul sănătos și bolnavrinichi. În cea mai mare parte, această înțelegere a venit din analiza secțiunilor 2-dimensionale (2D), indiferent dacă sunt secțiuni fizice microscopice electronice sau ușoare sau secțiuni optice confocale. Cuantificarea acestei microanatomie a depins în cea mai mare parte de analizele stereologice ale secțiunilor care au furnizat estimări ale numărului, lungimii, suprafețelor și volumelor glomeruli, tubuli, vase, interstiții și componentele lor celulare. 3,4 Până de curând, vizualizarea 3D arinichimicrostructura s-a limitat în mare parte la microscopia confocală, care permite secționarea optică și reconstrucția 3D până la o adâncime de 50 până la 80 m m. Din păcate, proprietățile de refracție ale componentelor proteinelor și lipidelor dintr-un țesut împrăștie lumina și reduc dramatic calitatea imaginii pe măsură ce adâncimea crește. În ultimii ani, au fost dezvoltate o serie de metode de curățare pentru a îndepărta conținutul de lipide și pigment al unui țesut și pentru a se potrivi cu proprietățile de refracție ale țesutului și ale mediului de montare pentru a face țesutul transparent. 5 Metodele de curățare variază în complexitate, de la incubarea țesutului în diferite soluții pe o perioadă de ore până la proceduri extinse care implică echipamente electrochimice personalizate. Îndreptăm cititorii către recenziile recente 5,6 pentru o prezentare detaliată a metodelor actuale și lucrările citate aici pentru metode specifice și cazuri de utilizare.
Structurile subcelulare și populațiile întregi de celule pot fi rezolvate în organe întregi curățate sau secțiuni groase. Imaginile cu precizie ale caracteristicilor din țesutul curățat necesită microscoape specializate și procesare a imaginilor pentru a captura și reconstrui date volumetrice din probe care pot varia de la sute de microni la centimetri. Microscoapele confocale cu scanare punctiformă și cu disc rotativ au fost utilizate în mod eficient pentru a vizualiza caracteristicile din interiorul ștersrinichițesut, dar suferă de o rezoluție redusă în axa Z și o reducere progresivă a intensității fluorescenței la adâncime datorită unei singure axe de iluminare și imagini. Tehnicile de microscopie cu foi luminoase sunt deosebit de potrivite pentru imagistica țesuturilor curățate, deoarece permit achiziționarea rapidă a volumelor mari 3D și pot include iluminarea și imagistica în mai multe unghiuri. Tomografia cu proiecție optică este o altă abordare care încorporează imagistica multiunghiulară și reconstrucția digitală pentru a produce date în care axele X, Y și Z ale fiecărui voxel au aceeași rezoluție. Indiferent de abordarea specifică, curățarea țesuturilor și imagistica întregii monturi oferă o nouă oportunitate de a explora micromediile celulare neexplorate și structura țesuturilor de ordin superior. În această recenzie, evidențiem câteva perspective noi desprerinichidezvoltare, adultrinichistructura și patologia care au rezultat din curățarea țesuturilor, urmată de analiză cantitativă 3D.
Noi perspective asupra dezvoltării rinichilorDecenii de profilare a expresiei genelor și studii knockout au condus la o înțelegere detaliată a tipurilor de celule, a rețelelor de reglare a genelor și a căilor de semnalizare care controlează mamiferele.rinichidezvoltare. Aceste cunoștințe au informat diagnosticul bolii congenitale și au permis producerearinichitipuri de celule din celule stem pluripotente. 7 Cu toate acestea, dimensiunea, opacitatea și complexitatea dezvoltăriirinichia prezentat o barieră semnificativă în măsurarea precisă a morfogenezei acestui organ și a distribuției 3D a celulelor și proteinelor din interiorul acestuia. Aplicarea curățării țesuturilor și a imagisticii multiscale înrinichia permis vizualizarea și analiza cantitativă a morfogenezei ramificației ureterelor, a populațiilor de celule progenitoare și a dotării nefronilor în organele intacte (Figura 1). 8 Aceste abordări susțin o nouă capacitate de fenotipizare de precizie și căi deschise pentru a analiza factorii determinanți celulari și moleculari airinichidezvoltare și boli congenitale.
Imagistica și analiza morfogenezei ramificate în 3D.Stabilirea arborelui ureteral este o caracteristică definitorie arinichidezvoltare și a fost studiat pe larg folosind genetica șoarecelui și aplatizatrinichiculturi de explant. Cu toate acestea, înțelegerea modului în care genele individuale contribuie la creșterea, forma și modelarea acestei structuri ramificate a conductelor epiteliale in vivo a necesitat capacitatea de a imagina și analiza această rețea complexă într-o gamă largă de dimensiuni de eșantion. Short și colab. 8 au abordat aceste probleme utilizând imunofluorescența întregii monturi, curățarea pe bază de solvenți (benzoat de benzii de alcool benzilic) și imagisticarea organelor întregi cu tomografie cu proiecție optică. Folosind această abordare pentru a captura instantanee 3D de la începutul până la mijlocrinichidezvoltare, echipa a dezvoltat un software de analiză personalizat pentru a obține detalii fără precedent despre arborele ureter, inclusiv numărul vârfurilor, unghiurile și lungimea ramurilor, volumele ramurilor și numărul de generații de ramificații din arborii ureterului intacți (Figura 1c și d). 8 Folosit inițial pentru a caracteriza și identifica aspecte noi ale ramificării renale 9,10, eforturile în curs urmăresc să definească principiile și regulatorii cheie care guvernează modelarea ramurilor in vivo. 1
Legarea dinamicii progenitoarelor de morfogeneza organelor cu imagistica multiscale.Interacțiunile moleculare dintre celulele vârfului ureteric și celulele progenitoare de nefron joacă un rol major în stabilirea complementului de nefroni care faciliteazăfunctia rinichilorin viata adulta. Progenitorii nefronilor neinduși produc factori care promoveazărinichicreșterea prin ramificarea ureterului, în timp ce indicii restricționați spațial în vârful ureterului, atât mențin starea de progenitor al nefronului, cât și induc un subset al acestor progenitori să se diferențieze într-un nefron timpuriu. Aceste interacțiuni conduc la un ciclu de ramificare și inducere a nefronilor care încetează în jurul nașterii, atunci când progenitorii nefronilor rămași se diferențiază. Înainte de metodele de curățare a țesuturilor, înțelegerea noastră a dinamiciirinichimorfogeneza și abundența relativă a populațiilor de celule progenitoare de-a lungul timpului a fost sever limitată. Acest lucru s-a schimbat odată cu dezvoltarea abordărilor imagistice pe mai multe scară care utilizează protocoale extinse de imunofluorescență, curățarea țesuturilor și abordări imagistice pentru a cuantificarinichidezvoltarea la nivel celular (confocal) și a întregului organ (tomografie cu proiecție optică, foaie de lumină). 9,10 A devenit evident că ratele derinichicreșterea variază dramatic cu ratele inițial rapide de ramificare și proliferare care scad în faze care se corelează cu reduceri ale numărului de celule progenitoare din nișa nefrogenă. 10 Imagistica confocală tridimensională a fătului uman întregrinichi(săptămâna 11) sau mostre de larinichicortexul (săptămânile 11-23) afirmă că această scădere a dimensiunii nișei este conservată între specii. 12 O analiză comparativă ulterioară a nișei nefrogenice umane și șoarece în țesutul curățat a condus la un nou model de recrutare bazat pe timp al formării nefronului, în care celulele progenitoare sunt adăugate progresiv la un nefron timpuriu și adoptă o identitate de segment în funcție de ordinea în care ajung. . 13 Într-un alt studiu axat pe angajamentul progenitorului de nefron, a fost utilizată o metodă de curățare a țesuturilor pe bază de hidrogel (Imagistica rigidă/Imunocolorare/Hydrogel compatibil cu hibridizare in situ, Tissue-hYdrogel [CLARITY] 14) cu schimb de lipide clare pasive. capacitatea de a reține fluorescența unui reporter tdTomato endogen. Analiza etichetării tdTomato în țesutul curățat a arătat că celulele din nefronul care se comite timpuriu pot reveni la o stare progenitoare, în care rezultatele anterioare sugerau că angajamentul a fost unidirecțional. 15 Astfel, curățarea țesuturilor ne-a îmbunătățit înțelegerea proceselor dinamice de dezvoltare la scară și specii.
Fenotiparea de precizie. Progresele în curățarea țesuturilor și analiza cantitativă au permis o nouă capacitate de fenotipizare de precizie. Modificări robuste din punct de vedere statistic în ramificarea și numărul de nefron au fost identificate la modelele de șoarece cu fenotipuri subtile, cum ar fi Ret þ/? și Six2 þ/? șoareci (Figura 2), care au fost anterior clasificați drept „normali”. 10,16 Imagini confocale de înaltă rezoluție ale Wnt11?/?rinichia identificat un nou fenotip celular în care progenitorii nefronilor par dezorganizați din cauza incapacității de a forma atașamente celulare stabile cu vârful ureteral și de a se diferenția prematur. 17 Aceste metode au fost, de asemenea, utilizate pentru a cuantifica modul în care influențează noii regulatori ai stării celulelor progenitoare de nefron, cum ar fi ADN-metiltransferaza 1, microARN-urile Lin28 și Let7 și TSC1.rinichidezvoltare și numărul de nefron. 18–20 Fenotiparea de precizie este probabil să devină un instrument important în efortul nostru de a înțelege efectul aditiv al factorilor genetici și de mediu care contribuie la numărul scăzut de nefroni și predispoziția la cronicizare.boală de rinichi.
Modelarea matematică arinichimorfogeneza. Datele care sunt produse din dezvoltarea compensatărinichialimentează un val de modelare matematică bazată pe imagini care încearcă să discearnă modul în care forma macroscopică și funcția unui țesut provin din interacțiunile moleculare dintre populațiile de celule progenitoare. 11,21-23 Aplicarea ulterioară a imaginii întregului organ în țesutul curățat va fi esențială pentru a înțelege factorii moleculari și celulari ai modelării țesuturilor 3D și poate deține cheia pentru îmbunătățirea structurii și acurateței modelelor de celule stem alerinichi.
Morfologia și patologia 3D a rinichiului adultMorfologia complicată a adultuluirinichilimitează utilizarea instrumentelor morfologice 2D, deoarece acestea pot transmite percepții incomplete sau înșelătoare ale structurii 3D. Aici, discutăm câteva dintre progresele metodologice importante din ultimii ani care permit acum analiza 3D robustă a structurilor la adult.rinichi, variind de la intacterinichipână la componentele barierei de filtrare glomerulară (Figura 3). 2
CISTANCHE VA AMUNĂȚI INSUFICIENȚA RENALĂ/RENALĂ
Numărul și dimensiunea nefronului.Omulrinichiarată un nivel ridicat de variabilitate intra și intersubiecți în numărul și volumul nefronilor, care a fost descris în studiile de autopsie de la subiecți fără evidentă.boli de rinichi1,30,31 și a fost legată de tulburări de dezvoltare. Timp de zeci de ani, instrumentul standard de aur pentru cuantificarea numărului de nefron în probele experimentale și umane a fost metoda disectorului/fracționării, o metodă stereologică bazată pe proiectare. 3,4 Deși această abordare este exactă și precisă, este, de asemenea, practică, consumatoare de timp și necesită o pregătire semnificativă. Din acest motiv, s-au propus abordări alternative pentru a concepe metode eficiente care pot oferi obiective de înaltă calitate32: de exemplu, combinații de metode optice de curățare, inclusiv hidrofobe (cunoscute anterior ca pe bază de solvenți), hidrofile sau pe bază de hidrogel, cu microscopie cu lumină (de exemplu, confocală, multifoton sau foaie de lumină).
Din cunoștințele noastre, primul raport care a combinat curățarea optică și microscopia cu foile luminoase pentru analiza numărului și dimensiunii nefronilor a fost publicat de Klingberg și colab. 24 într-o lucrare de referință care a prezentat mai multe progrese importante. În primul rând, acest raport a introdus cinamatul de etil, un solvent nepericulos care ar putea înlocui substanțele chimice toxice, cum ar fi alcoolul benzilic-benzoatul de benzii, care până atunci era folosit în mod regulat în protocoalele de curățare hidrofobe. În al doilea rând, anchetatorii au efectuat numărarea nefronilor la șoarecele intactrinichi in un model agresiv și progresiv de mediată imunboală de rinichi, identificând pierderea nefronului în cursul bolii. În plus, au fost introduși pași semnificativi către automatizarea computerizată a algoritmilor de segmentare a imaginii, oferind o cale către îmbunătățiri semnificative ale eficienței. Recent, Østergaard et al. 25 au prezentat o metodă similară de curățare hidrofobă combinată cu microscopia cu foile luminoase și segmentarea automată a imaginii care oferă atât numărul total de nefron, cât și volumul glomerular unic într-un model de șoarece de nefropatie diabetică. În plus, acest studiu a arătat o etichetare funcțională elegantă a tubilor proximali prin injectarea de albumină in vivo pentru a vizualiza joncțiunea glomerulartubulară și un protocol simplu pentru histopatologie corelativă în aceleași probe curățate optic. Acest raport arată flexibilitatea acestor protocoale, care devin conducte cu mai multe straturi pentru profilarea completă a țesuturilor.
Vasculatura renală și inervația.Urmărirea ramificației vasculare sau a fibrelor nervoase la adultrinichieste aproape imposibilă în histologia convențională 2D, deoarece dimensiunea organului și complexitatea distribuției structurale necesită secționare în serie extinsă și expertă. Recent, Huang et al. 33 au raportat un colorant cationic fluorescent în infraroșu apropiat (MHI148-PEI) pentru a marca în mod specific vasele de sânge, care poate fi combinat cu un protocol de curățare modificat și accelerat bazat pe cinamat de etil pentru a scurta timpul de procesare a țesuturilor. Această abordare deschide noi căi pentru cercetarea vasculară înrinichi,mai ales atunci când sunt necesare imagini de înaltă rezoluție în 3D. În mod similar, Hasegawa și colab. 26 au folosit Cocktailuri Clear Unobstructed Brain/Body Imaging and Computational analysis (CUBIC) împreună cu un sistem de microscopie luminoasă personalizat pentru a identifica distribuția inervației simpatice în rinichiul intact al șoarecelui. Nervii simpatici erau distribuiți în principal în jurul arterelor. După 10 zile de ischemie sau leziune de reperfuzie, densitatea inervației simpatice a fost semnificativ scăzută, corelând cu niveluri reduse de norepinefrină înțesut renal. Aceste modificări au persistat parțial la 28 de zile după leziunea inițială, sugerând că pot fi găsite modificări simpatice continue în timpul progresiei bolii cronice.boală de rinichi.
Remodelarea tubulointerstițială.Sistemul tubular renal este deosebit de dificil de analizat în 3D. Morfologia complicată și complexă ridică provocări multiple pentru metodele convenționale bazate pe secționarea în serie și microscopia cu lumină standard. Cu toate acestea, curățarea optică permite analiza tubulilor intacți și a micromediului înconjurător. Saritas și colab. 34 au efectuat o combinație de curățare optică pe bază de hidrogel și hidrofobă, urmată de microscopie luminoasă avansată și analiză 3D semiautomată pentru a caracteriza remodelarea tubulară distală din cauza lipsei de potasiu alimentar. Anchetatorii au cuantificat hiperplazia tubulară și au detectat o creștere a celulelor proliferante în tubulointerstitium. Acest studiu a folosit versatilitatea atât a curățării optice, cât și
Figura 3| Morfometrie tridimensională (3D) în rinichiul adult. (a) Numărarea nefronilor în rinichi întregi folosind etichetarea CD31 a celulelor endoteliale. Panoul arată o reconstrucție 3D (stânga), o secțiune optică într-o vedere bidimensională (2D) (din mijloc) și zone speciale care prezintă glomeruli unici într-o comparație între microscopia cu foiță luminoasă (LSFM) și confocal și 2- microscopie fotonică (2P). Adaptat cu permisiunea Societății Americane de Nefrologie, din Jurnalul Societății Americane de Nefrologie, Evaluarea completă automată a numărului glomerular total și a dimensiunii smocurilor capilare în rinichii nefritici folosind microscopie Lightsheet, Klingberg A, Hasenberg A, Ludwig-Portugall I și colab. ., volumul 28, numărul 2, 2017; permisiunea transmisă prin Copyright Clearance Center, Inc. 24 (b) Dimensiunea glomerulilor cu înregistrare spațială—codificarea prin culori reprezintă dimensiunea glomerulară, unde roșu este cel mai mare obiect și roz cel mai mic. Adaptat cu permisiunea Societății Americane de Nefrologie, din Kidney360, Automated Image Analyses of Glomerular Hypertrophy in a Mouse Model of Diabetic Nephropathy, Østergaard MV, Sembach FE, Skytte JL, et al., volumul 6, numărul 6 , 2020; permisiunea transmisă prin Copyright Clearance Center, Inc. 25 (c) Urmărirea vasculaturii și inervației, prezentând o reconstrucție 3D a unui rinichi intact cu imunomarcarea nervilor simpatici (verde), a sistemului vascular (magenta) și îmbinați (stânga). Adaptat din Kidney International, volumul 96, numărul 1, Hasegawa S, Susaki EA, Tanaka T și colab., Analiza tridimensională cuprinzătoare (CUBIC-kidney) vizualizează nervii simpatici renali anormali după leziuni de ischemie/reperfuzie, paginile 129-138, Copyright ª 2019, cu permisiunea Societății Internaționale de Nefrologie. 26 (d) Morfometria podocitelor în glomeruli individuali folosind imunomarcarea pentru markerul specific podocitelor p57 (verde) și markerul ADN 4 0, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Panourile arată (stânga) o reconstrucție 3D și (dreapta) suprafețele randate. Adaptat cu permisiunea Societății Americane de Nefrologie, din Journal of the American Society of Nephrology, Validation of a Three-Dimensional Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli, Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al., volumul 27, numărul 10, 2016; permisiunea transmisă prin Copyright Clearance Center, Inc. 27 (e) Dinamica celulară folosind trasarea descendenței, arătând podocite (extrema stângă), celule epiteliale parietale (PEC) care formează semilune celulare în 3D (mijlo-stânga), o vedere 2D a invadării PEC-urilor partea glomerulară cu leziune vasculară (mijloc-dreapta) și o vizualizare 2D a orificiului tubular (extrema dreapta). Adaptat din Kidney International, volumul 96, numărul 2, Puelles VG, Fleck D, Ortz L și colab., Analiza 3D nouă folosind curățarea țesuturilor optice documentează evoluția glomerulonefritei murine rapid progresive, paginile 505–516, Copyright ª 2019, Internațional Society of Nephrology, sub licența CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 28 (f) Vizualizarea diafragmei cu fante la măriri crescânde de la stânga la dreapta. Adaptat după Kidney International, volumul 99, numărul 4, Unnersjö-Jess D, Butt L, Höhne M și colab., A fast and simple clearing and swelling protocol for 3D in-situ imaging of the kidney across scales, pages 1010–1020 , Copyright ª 2021, Societatea Internațională de Nefrologie, sub licența CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 29 Pentru a optimiza vizualizarea acestei imagini, vă rugăm să vedeți versiunea online a acestui articol lawww.kidney-international.org.
microscopia ușoară pentru a efectua analize tubulare în rinichi intacți utilizând încorporarea hidrogelului și microscopia cu folie luminoasă, precum și cuantificarea unicelulare în felii de rinichi folosind curățarea hidrofobă și microscopia confocală, deoarece fiecare combinație era mai potrivită pentru întrebarea specifică de cercetare. Combinații de clarificare optică și microscopie cu lumină avansată au fost folosite de Tahaei și colab. 35 care au caracterizat dimorfismul sexual în lungimea tubului contort distal, ceea ce poate determina capacitatea acestuia de a se adapta la stresul fiziologic, și Schuh și colab. 36 care au dezvăluit diferențe axiale în absorbția ligandului tubular proximal și în funcția endolizozomală, subliniind faptul că segmentul S1 este foarte specializat pentru a reabsorbi proteinele prin endocitoză mediată de receptor. Într-un studiu recent, Blanc et al. 2 a analizat un model de formare a chistului, arătând că chisturile s-au dezvoltat doar în segmente specifice de nefron, care le-au determinat forma și s-au situat în vecinătatea tubilor normali nedilatați. În general, avem acum mai multe exemple de aplicare directă a curățării optice pentru analiza sistematică a compartimentului tubulointerstițial.
Pierderea podocitelor și hipertrofia.Glomerulus oferă un exemplu unic pentru analiza unităților funcționale intacte dintr-un organ. În special, studiul epuizării podocitelor a beneficiat direct de aceste progrese tehnologice, deoarece metodologiile bazate pe design standard de aur necesită investiții semnificative de timp și resurse. 37 Primul instrument pentru analiza morfometrică a podocitelor 3D a glomerulilor intacți de șoarece a combinat imunomarcarearinichifelii folosind un protocol modificat de imunofluorescență indirectă, curățare optică hidrofobă și microscopie confocală, care a facilitat cuantificarea numărului total de podocite în glomeruli individuali întregi de volum cunoscut. Credem că această abordare este ideală pentru studiul proceselor care afectează un anumit subset de structuri (de exemplu, pierderea podocitelor care duce la glomeruloscleroza focală și segmentară). 27 Aceeași tehnică a fost aplicată ulterior pentru a caracteriza rolul hipertrofiei podocitelor ca răspuns compensator în urma pierderii podocitelor, un mecanism care este mediat de ținta mamiferelor a căii de semnalizare a rapamicinei. 38 În timp ce aceste 2 studii s-au concentrat pe analiza podocitelor glomerulare, această conductă bazată pe imunomarcarea convențională poate fi utilizată pentru a caracteriza modificările morfologice ale oricărui tip de celule la rezoluție spațială mare.
Evoluția semilunelor celulare.Un alt instrument important care trebuia integrat cu succes în setul de instrumente pentru 3Drinichimorfometria este trasarea liniei genetice. Majoritatea metodelor optice de curățare tind să inducă un anumit grad de stingere a fluorescenței (care variază de la ușoară la severă). 6 Am prezentat recent un protocol care combină trasarea descendenței, curățarea optică și microscopia multifoton pentru analiza cuprinzătoare a pierderii podocitelor și a activării celulelor epiteliale parietale. 28 În acest studiu, pierderea podocitelor a fost identificată ca o caracteristică a nefritei semilună experimentale folosind etichetarea metabolică a podocitelor cu proteină verde fluorescentă îmbunătățită. Evoluția semilunelor celulare a fost vizualizată și cuantificată pe baza proliferării și migrării celulelor epiteliale parietale, care au fost, de asemenea, marcate de proteină fluorescentă verde îmbunătățită și urmărite pe parcursul unui model experimental de nefrită semilună. Analiza glomerulilor intacți a permis identificarea pierderii focale a podocitelor și a formării leziunilor, care au evoluat către ocluzii tubulare de către celulele epiteliale parietale, ducând la formarea glomerulilor tubulari. Acest studiu deschide calea pentru studii viitoare ale interacțiunilor imuno-epiteliale complexe în cadrul intacterinichi.
CISTANCHE VA ÎMBUNĂTĂȚI RINCHII/DIALIZA RENALĂ
Bariera de filtrare glomerulară.Un instrument de diagnostic important pentru evaluarea de rutină a bolilor glomerulare este analiza ultrastructurală a biopsiilor renale prin microscopie electronică. O alternativă la microscopia electronică poate fi găsită în domeniul microscopiei de expansiune, care prin definiție urmărește creșterea rezoluției optice prin creșterea dimensiunilor țesuturilor. De-a lungul anilor, Unnersjo-Jess et al. 39,40 au furnizat mai multe protocoale pentru vizualizarea structurilor la scară nanometrică înrinichi.Recent, acești investigatori au raportat o procedură rapidă și simplă de vizualizare 3D arinichimorfologie, combinând conceptele de curățare optică și expansiune a țesuturilor pentru a rezolva structuri la scară nanometrică folosind microscopia confocală convențională. 29 Acest protocol a fost aplicat pentru a vizualiza și cuantifica multiple caracteristici patologice la șoarece și omrinichibiopsii incluzând ștergerea procesului piciorului, modificări ale membranei bazale glomerulare, lungimea diafragmei fantei, depozite de IgG și caracteristici patologice clasice (de exemplu, glomerulo-scleroza, fibroza tubulointerstițială și atrofia tubulară). Pe scurt, această metodă permite vizualizarea și cuantificarea pe mai multe scară a patologiei renale folosind o metodă simplă și instrumente accesibile de analiză a imaginii. Scalabilitatea și implementarea acestei abordări în practica clinică va fi probabil determinată de necesitatea echipamentelor avansate de microscopie ușoară și de dezvoltarea instrumentelor automate de analiză a imaginii.
Concluzie
Spectrul actual de metode de curățare a țesuturilor include tehnici simple care pot fi implementate în majoritatea laboratoarelor pentru a îmbunătăți imaginile 3D pe microscoape disponibile în mod obișnuit. Pe măsură ce oportunitățile oferite de aceste noi abordări devin evidente, anticipăm o utilizare mai largă a sistemelor de microscopie specializate pentru a imagini în mod eficient țesutul curățat la rezoluție înaltă și dezvoltarea de fluxuri de lucru personalizate de cercetare și clinice pentru a aborda întrebări specifice. Domeniul neuroștiinței a servit ca un teren de testare pentru metode și aplicații de imagistică a țesuturilor. Analiza automată a imaginilor, abordări noi pentru studierea conectivității celulare și proiecte de atlas de expresie a genelor și proteinelor la nivelul întregului țesut au fost dezvoltate în acest context. Este probabil ca abordări similare să ofere noi perspective asupra anatomiei celulare și a interdependenței populațiilor de celule în curs de dezvoltare și adulți.rinichi.
Limitările practice ale acestor progrese includ costul hardware-ului pentru imagini și dificultăți în manipularea, stocarea și analiza seturilor mari de date. Alte limitări apar din lipsa de reproductibilitate a colorării cu țesuturi afectate variabil de condițiile de fixare și marcarea anticorpilor. Ca rezultat, este nevoie de noi analize 3D care să fie evaluate critic și comparate cu metodele stabilite. În ciuda progreselor impresionante în evaluarerinichidezvoltare și adultrinichistructura și boala evidențiate în această revizuire, credem că cel mai bun din curățarea țesuturilor și imagistica 3D este încă să vină și este probabil să fie o zonă de creștere interesantă pentrurinichicercetare pentru deceniile viitoare.
