Clec12a temperează inflamația în timp ce restricționează expansiunea unui comensal colitogen

REZUMAT

Reglarea microbiotei este esențială pentru sănătatea intestinală, dar mecanismele folosite de imunitatea înnăscută rămân neclare. Aici arătăm că șoarecii cu deficit de receptorul de lectină de tip C, Clec12a a dezvoltat colită severă, care era dependentă de microbiotă. Studiile de transplant de microbiotă fecală (FMT) la șoareci fără germeni au dezvăluit microbiota colitogenă formată în cadrul șoarecilor Clec12a-/- care au fost marcate de expansiunea organismului gram-pozitiv, rozătoarele Faecalibaculum. Tratamentul cu F. rodentium a fost suficient pentru a agrava colita la șoarecii de tip sălbatic. Macrofagele din intestin exprimă cele mai înalte niveluri de Clec12a. Analiza citokinelor și secvențierea în macrofagele Clec12a-/- au evidențiat o inflamație crescută, dar o reducere marcată a genelor asociate cu fagocitoza. Într-adevăr, macrofagele Clec12a-/- sunt afectate în capacitatea lor de a absorbi F. rodentium. Clec12a purificat a avut o legare mai mare la organisme Gram-pozitive, cum ar fi F. rodentium. Astfel, datele noastre identifică Clec12a ca un mecanism de supraveghere imună înnăscută pentru a controla extinderea comensalilor potențial dăunători fără inflamație evidentă.

cistanche beneficii pentru bărbați-întărește sistemul imunitar

INTRODUCERE

Compoziția și funcția microbiotei pot avea un impact profund asupra sănătății și bolilor mamiferelor (Fassarella et al., 2021). Acest lucru a fost bine documentat pentru boala inflamatorie intestinală (IBD), unde majoritatea modelelor de șoareci de IBD sunt sensibile la modificările compoziției microbiotei (Gkouskou și colab., 2014). Înțelegerea factorilor care influențează și instruiesc stabilitatea microbiotei va fi importantă pe măsură ce se dezvoltă terapii bazate pe microbiotă (Sharma et al., 2020; Sorbara și Pamer, 2022). Microbiota este influențată de mai mulți parametri, inclusiv dieta, medicamentele și sistemul imunitar. În ultimii ani, s-a demonstrat că componentele imune adaptive, în special IgA, influențează compoziția microbiotei (Nakajima și colab., 2018; Okai și colab., 2016; Yang și Palm, 2020). Cu toate acestea, se știe mai puține despre modul în care receptorii imuni înnăscuți specifici influențează compoziția microbiotei homeostatice.

Polimorfismele genetice ale genelor care reglează recunoașterea microbiană și imunitatea mucoasei sunt alele de risc semnificative pentru IBD, inclusiv proteina autofagie ATG16L1 (Cadwell și colab., 2008; Liu și colab., 2015; Rioux și colab., 2007; Wellcome Trust Case Control, 2007). ). Într-un studiu recent care a explorat modificările expresiei genei mieloide la indivizi cu polimorfismul ATG16L1T300A, receptorul inhibitor de lectină de tip C (CLR), Clec12a, a fost identificat a fi suprimat semnificativ în aceste celule (Begun și colab., 2015). Același studiu a demonstrat că Clec12a funcționează în apărarea infecției patogene prin asociere cu calea autofagiei. Aceste date sugerează că reglarea în jos a Clec12a la persoanele cu IBD ar putea influența severitatea și/sau dezvoltarea bolii. În ciuda acestor dovezi, se știe puțin despre mecanismele de reglare imună exercitate de Clec12a în timpul colitei.

Lectinele de tip C sunt un grup divers de molecule solubile sau legate de membrană capabile să lege atât lipidele, proteinele, cât și carbohidrații derivate din gazdă sau microbiene (Brown și colab., 2018). Mincle (Clec4e) și Dectin-1 (Clec7a) sunt două CLR care influențează membrii specifici ai microbiotei pentru a menține homeostazia intestinală (Iliev și colab., 2012; Martinez-Lopez și colab., 2019). Cu toate acestea, cu peste 1,000 lectine de tip C diferite, mai rămân multe de descoperit în cadrul acestei familii de proteine. Clec12a aparține familiei de receptori natural killer și este una dintre cele două lectine de tip C care conțin un motiv inhibitor imun-tirozină (ITIM) capabil să restrângă căile de semnalizare inflamatorie (Brown și colab., 2018; Marshall și colab., 2004) . Clec12a recunoaște acidul uric, care este un semnal de deteriorare celulară (Neumann et al., 2014). Clec12a este cel mai puternic exprimat în celulele imune înnăscute, iar în neutrofile acționează pentru a reduce activarea și a reduce producția de citokine inflamatorii la recunoașterea acidului uric (Neumann et al., 2014). În schimb, Clec12a promovează inflamația permițând transmigrarea fagocitelor mononucleare (MNP) peste bariera hemato-encefalică în timpul unui model autoimun de scleroză multiplă și potențarea semnalizării interferonului de tip I ca răspuns la infecția virală (Li et al., 2019; Sagar et al. ., 2017). Clec12a este, de asemenea, capabil să recunoască produsul plasmodial, hemozoina, care s-a dovedit că crește celulele T CD8+ din creier după infecția cu Plasmodium (Raulf și colab., 2019). Astfel, Clec12a reprezintă un CLR promiscuu cu o varietate de roluri în imunitate și capacități unice de semnalizare, dar rolul său în intestin rămâne necunoscut.

cistanche tubulosa-imbunatateste sistemul imunitar

Am demonstrat anterior că ciupercile intestinale specifice exacerbează colita prin inducerea metabolitului purinic, acidul uric (Chiaro et al., 2017). Mai mult, metabolismul purinelor a fost recent asociat cu boli intestinale umane (Zhu et al., 2019). Aceste date sugerează în mod colectiv că detectarea acidului uric poate fi relevantă pentru IBD. Pe baza acestui fapt, ne-am propus să explorăm funcția Clec12a în intestin. Am descoperit că animalele cu deficit de Clec12a sunt foarte susceptibile la colită, care depinde de compoziția microbiotei formată în absența Clec12a. FMT a microbiotei Clec12a-/- la animalele fără germeni WT a fost suficientă pentru a exacerba colita, iar formarea microbiotei colitogene la animalele Clec12a-/- este independentă de imunitatea adaptativă. Pentru a identifica microbii relevanți care ar putea exacerba colita, animalele Clec12a-/- au fost tratate cu diverse antibiotice, iar cele care vizează bacteriile gram-pozitive au ameliorat boala. Secvențierea ADNr 16S a identificat Faecalibaculum rodentium ca fiind semnificativ mai abundent la animalele Clec12a-/-, iar gavajul oral al F. rodentium a fost suficient pentru a exacerba patologia bolii la animalele WT. Profilul imun al animalelor Clec12a-/- a relevat o reducere marcată a celulelor mieloide homeostatice din colon. Secvențierea ARN a macrofagelor tratate cu F. rozătoare a arătat că Clec12a promovează fagocitoza. Deoarece s-a demonstrat că Clec12a leagă mai mulți liganzi, am întrebat dacă Clec12a s-ar lega de diferiți membri ai microbiotei. Folosind o proteină de fuziune Clec12a-Fc, identificăm că Clec12a se leagă cel mai mult de membrii gram-pozitivi ai microbiotei. Colectiv, aceste date sugerează un model prin care Clec12a controlează membrii colitogene ai microbiotei prin legarea directă și fagocitoză, prevenind în același timp răspunsurile inflamatorii. În scenariile în care expresia Clec12a este redusă, patobioții gram-pozitivi se pot extinde și promova inflamația. Astfel, studiile noastre identifică Clec12a ca un supresor inflamator important pentru a asigura homeostazia și menținerea unei microbiote sănătoase.

REZULTATE

Animalele Clec12a-/- sunt foarte susceptibile la colită independent de sistemul imunitar adaptativ

Expresia redusă a Clec12a a fost raportată la persoanele cu IBD și am demonstrat că blocarea producției unuia dintre liganzii pentru Clec12a, acidul uric, poate ameliora colita (Begun și colab., 2015; Chiaro și colab., 2017; Liu și colab. ., 2015). Cu toate acestea, Clec12a nu a fost încă studiat pe modele animale de colită. În acest scop, șoarecii WT și Clec12a-/- C57BL/6 au fost provocați cu colită acută DSS. Animalele Clec12a-/- au pierdut semnificativ mai multă greutate, au prezentat colon mai scurte și au avut o creștere semnificativă a markerului inflamator LCN2 în fecale în comparație cu animalele WT, indicând o agravare a inflamației și a bolii (Figura 1A-C). Sprijinind acest lucru, analiza histologică a evidențiat leziuni epiteliale crescute, pierderea criptei și afluxul de celule imune la animalele Clec12a-/- comparativ cu WT (Figura 1D, E). În concordanță cu rezultatele din modelul de colită DSS, transferul celulelor CD4+ CD45RBhi în TCRb-/-; Șoarecii Clec12a-/- dublu knockout au condus la o creștere mai mică în greutate în timp și la un colon mai scurt în comparație cu celulele T transferate în șoarecii TCRb-/- (Figura 1F, G). Colectiv, aceste rezultate demonstrează că pierderea Clec12a duce la agravarea bolii intestinale.

Clec12a este exprimat în mare parte în celulele imune înnăscute, cu o expresie foarte scăzută raportată în celulele T CD8+. Prin urmare, pentru a determina dacă imunitatea adaptivă este implicată în boala agravată observată la animalele Clec12a-/-, animalele Clec12a-/- au fost încrucișate cu animale Rag-/- pentru a elimina atât celulele T, cât și celulele B. Din nou, animalele Clec12a-/- au dezvoltat o boală agravată în comparație cu animalele WT, deoarece au pierdut mai mult în greutate și au avut colon mai scurti decât martorii WT (Figura 1H, I). În mod similar, Clec12a-/-; Rag-/- a dezvoltat o boală intestinală agravată în comparație cu martorii Rag-/- și a pierdut la fel de mult în greutate și a avut colonii mai scurti decât WT și Rag-/- ca Clec12a-/- (Figura 1H, I). Am raportat anterior că tratamentul oral cu S. cerevisiae crește nivelul de acid uric pentru a agrava colita. Cu toate acestea, nu au fost observate diferențe în nivelurile de acid uric din ser sau fecale la animalele WT față de Clec12a-/-, ceea ce sugerează că boala îmbunătățită observată la Clec12A-/- nu este rezultatul creșterii acidului uric (Fig. S1). Astfel, dezvoltarea agravată a colitei observată la animalele Clec12a-/- este independentă de sistemul imunitar adaptativ.

cistanche tubulosa-imbunatateste sistemul imunitar

Faceți clic aici pentru a vedea produsele Cistanche Enhance Immunity

【Cereți mai multe】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Colita agravată la animalele Clec12a-/- depinde de microbiotă

Se știe că colita este determinată, parțial, de modificări ale compoziției microbiotei (Kubinak et al., 2015; Ray și Dittel, 2015). Pentru a determina dacă animalele Clec12a-/- găzduiesc o microbiotă care promovează agravarea colitei, au fost efectuate FMT de la șoareci WT sau Clec12a-/- la animale WT fără germeni. La patru săptămâni după transplant, jumătate dintre animale au fost găzduite împreună, în timp ce cealaltă jumătate au rămas adăpostite separat. Colita acută DSS a fost apoi indusă în fiecare grup (Figura 2A). Animalele care au primit un Clec12a-/- FMT și animalele adăpostite în comun au pierdut semnificativ mai mult în greutate (Figura 2B) și au avut colonii semnificativ mai scurti (Figura 2C) decât animalele care au primit un FMT de la șoarecii WT. În plus, analiza histologică a evidențiat leziuni epiteliale mai mari și influx inflamator după transplantul cu o microbiotă Clec12a-/- (Figura 2D, E). Comunitățile microbiene stabilite au fost distincte între grupuri, așa cum s-a determinat prin secvențierea genei ARNr 16S folosind Bray-Curtis (PERMANOVA, p=0.0001), neponderate (PERMANOVA, p=0}.0062) și ponderate- Distanțele Unifrac (PERMANOVA, p=0.0001). Disimilaritatea microbiotei în cadrul grupului a fost cea mai mare la animalele adăpostite în comun prin aceleași valori care indică achiziția microbilor de la fiecare genotip FMT (Figura 2 FH). Aceste date indică faptul că colita agravată la animalele Clec12a-/- este determinată de microbi specifici îmbogățiți în absența Clec12a; iar acești microbi au devenit conducătorii dominanti ai unui fenotip colitogen, chiar și în prezența unei microbiote WT stabilite.

Compoziția microbiotei formată la animalele Clec12a-/- este independentă de imunitatea adaptivă

Sistemul imunitar este important pentru dictarea compoziției microbiotei. Experimentul FMT a indicat că Clec12a-/- duce la o modificare a compoziției microbiotei care promovează dezvoltarea agravată a colitei. Am vrut mai întâi să determinăm dacă deficiența Clec12a-/- din compartimentul imunitar a fost capabilă să remodeleze microbiota intestinală. În acest scop, măduva osoasă de la șoareci WT sau Clec12a-/- a fost transferată în șoareci primitori WT SPF iradiați letal pentru a standardiza microbiota urmată de o perioadă de reconstituire imună de 8-săptămână (Figura 3A). În acest timp, sistemele imunitare transplantate au timp să se dezvolte în interiorul primitorului, modelând diferențial compoziția microbiotei. Pentru a determina dacă modificările procolitogene ale microbiotei au rezultat din această sculptură imună, am efectuat FMT utilizând fecalele de la șoareci WT sau Clec12a-/- himeric și am indus colita DSS (Figura 3A). Deși nu au existat modificări semnificative în pierderea în greutate (Figura 3B), colonii de la animalele care au primit un FMT de la șoarecii himeric Clec12a-/- au fost semnificativ mai scurti în comparație cu animalele care au primit FMT de la șoarecii WT (Figura 3C), indicând o agravare a bolii. Mai mult, atunci când primitorii WT și Clec12a-/- FMT au fost găzduiți în comun, colonii au fost semnificativ mai scurti în comparație cu animalele care au primit un WT FMT (Figura 3C). Astfel, deficiența Clec12a-/- în compartimentul hematopoietic duce la formarea unei microbiote colitogene dominante.

Pentru a susține în continuare faptul că sistemul imunitar adaptiv este dispensabil pentru formarea microbiotei colitogene la animalele Clec12a-/-, am efectuat un FMT folosind fecale de la Rag-/- sau Rag-/-; Clec12a-/- - așa cum este descris anterior. Animale care au primit o cârpă-/-; Clec12a-/- FMT a pierdut mai mult în greutate și a avut colon semnificativ mai scurt decât animalele care au primit un FMT de la animale Rag-/-, în plus, animalele adăpostite în comun au dezvoltat și boala agravată (Figura 3D, E). Aceste date demonstrează că deficiența Clec12a în sistemul imunitar înnăscut este suficientă pentru a duce la formarea unei microbiote capabile să agraveze colita.

Clec12a suprimă expansiunea Faecalibaculum rodentium

Am folosit o serie de antibiotice diferite pentru a identifica organismele relevante care conduc bolile la animalele Clec12a-/-. În primul rând, tratamentul cu un cocktail puternic de antibiotice cu spectru larg, care includ eritromicină, ampicilină, neomicină și gentamicina, a redus semnificativ severitatea bolii atât la animalele Clec12a-/- cât și la animalele WT, sugerând că populația bacteriană a microbiotei era relevantă pentru boală ( Figura 4A; Figura S2). În continuare, am restrâns și mai mult care populații bacteriene au fost cele mai relevante pentru boală prin utilizarea diferitelor antibiotice care vizează taxoni unici de bacterii. Mai exact, am selectat gentamicina, o aminoglicozidă care vizează bacteriile gram-negative și cefalotina, o cefalosporină care vizează în principal bacteriile gram-pozitive. Aceste medicamente au fost administrate animalelor Clec12a-/- în timpul colitei DSS. În timp ce tratamentul cu gentamicină nu a făcut nicio diferență în severitatea bolii, animalele care au primit cefalotină și-au menținut greutatea și au avut colon semnificativ mai lung decât animalele tratate simulat (Figura 4B, C), indicând că organismele gram-pozitive care locuiesc în microbiota Clec12a-/- joacă. un rol important în exacerbarea patologiei bolii.

Apoi am efectuat secvențierea genei ARNr 16S a fecalelor SPF WT și Clec12a-/- pentru a profila modificările compoziționale ale microbiotei. Animalele WT și Clec12a-/- s-au grupat semnificativ diferit atât prin valorile ponderate cu abundență filogenetică, cât și filogenetice, Bray-Curtis și, respectiv, ponderat-UniFrac (Figura S3A-C). Metricurile diversității alfa nu au evidențiat diferențe semnificative de bogăție (trăsături observate), indicând că Clec12a-/- nu adăpostește mai multe specii (Figura 4D). Cu toate acestea, indicii de uniformitate și diversitate Shannon au fost măriți în absența Clec12a, indicând faptul că distribuția proporțională a bacteriilor la șoarecii Clec12a-/- a fost modificată (Figura 4E, F) și susținând în continuare faptul că Clec12a este important pentru reglarea structurii microbiotei în intestin.

Analiza compoziției microbiomilor (ANCOM) a relevat faptul că, printre ASV (variantele secvenței ampliconilor) diferențial abundente, un ASV clasificat în genul Faecalibaculum (familia Erysipelotrichaceae), a fost extins semnificativ în fecalele Clec12a-/- comparativ cu WT (Figura 4G, H). BLAST folosind secvența reprezentativă ASV din analiza noastră a indicat o identitate de 100% cu secvențele din bacteria Faecalibaculum rodentium. Aceste date oferă dovezi că bacteriile gram-pozitive din animalul Clec12a-/- sunt responsabile pentru fenotipul colitogen și implică în mod specific organismul gram-pozitiv, F. rodentium, în boala agravată.

Pe baza acestui fapt, am testat ipoteza că F. rodentium ar putea exacerba colita. Am tratat în prealabil animalele WT SPF cu 1 x 108 CFU de F. rodentium fie viu, fie fix prin gavaj oral și am continuat tratamentul în fiecare zi în timpul modelului acut de DSS pentru a asigura niveluri ridicate de colonizare a F. rodentium. Animalele care au primit atât F. rodentium viu, cât și fix au pierdut mai mult în greutate și au avut colon semnificativ mai scurt decât animalele tratate cu vehicul (Figura 4I, J), indicând faptul că nivelurile crescute de F. rodentium pot agrava boala.

Clec12a restricționează răspunsul inflamator al macrofagelor în timp ce crește fagocitoza

Pentru a defini expresia celulară Clec12a în absența bolii, am profilat celulele imune înnăscute și adaptive în lamina propria (LP) folosind citometrie în flux multicolor. În concordanță cu rapoartele anterioare, Clec12a este predominant limitată la descendența mieloidă cu o expresie mică sau deloc pe limfocite (Figura 5A) (Han și colab., 2004; Pyz și colab., 2008; Sobanov și colab., 2001). Neutrofilele intestinale, macrofagele și celulele dendritice au prezentat niveluri similare de expresie Clec12a (Fig. S4A), în timp ce macrofagele au avut cel mai mare procent de celule din țesutul intestinal care exprimă Clec12a (Figura 5A). Având în vedere rolul dublu al macrofagelor de a promova inflamația prin activarea clasică, dar și de a iniția mecanisme reparatorii ca răspuns la deteriorarea țesuturilor, am întrebat cum ar putea influența Clec12a această dihotomie în timpul colitei. În timp ce macrofagele sunt destul de diverse, ele pot fi împărțite în general în macrofage M1 inflamatorii și M2 reparatoare prin expresia CD38 și, respectiv, EGR2. Arătăm că animalele Clec12a-/- au crescut macrofagele M1 și au scăzut macrofagele M2 în LP colonic în timpul colitei (Figura 5 B, C, Fig. S4B). Aceste date indică faptul că Clec12a reglează răspunsurile macrofagelor din intestin.

Pentru a înțelege mai bine modul în care Clec12a influențează biologia macrofagelor ca răspuns la liganzii microbieni, macrofagele derivate din măduva osoasă (BMDM) izolate de la animalele WT sau Clec12a-/- au fost tratate cu o varietate de liganzi microbieni comuni, inclusiv LPS, Pam3CysK și Flagellin. Analiza citokinelor a fost efectuată pe toate aceste probe. Multe dintre citokinele testate nu au fost induse în aceste condiții, cu toate acestea, MCP-1, IL{-27, IFN-b, TNF-a și IL-6 au fost detectate în mod constant în aceste culturi ( Figura 5D). Clec12a-/- BMDM-urile au avut o expresie semnificativ mai mare a acestor citokine ca răspuns la mulți dintre liganzii microbieni și cele mai mari răspunsuri diferențiale au fost observate ca răspuns la agonistul TLR2 Pam3CysK. Aceste date sunt în concordanță cu rolul cunoscut al Clec12a în temperarea răspunsurilor inflamatorii în timpul inflamației sterile (Neumann et al., 2014).

cistanche plant-creșterea sistemului imunitar

ARN-seq a fost efectuat pe BMDM de la WT sau Clec12a-/- tratate cu F. rodentium pentru a determina modul în care Clec12a reglează răspunsurile acestor celule la acest organism bacterian specific. Am evaluat răspunsul diferențial prin compararea Clec12a-/- BMDM expuse la F. rodentium peste controalele vehiculului cu cel al BMDM-urilor WT. Analiza de îmbogățire a genelor exprimate diferențial a arătat că macrofagele cu deficit de Clec12a au avut o creștere semnificativă a genelor implicate în controlul ciclului celular atunci când au fost provocate cu F. rodentium (Figura S5A). Ciclul celular este intrinsec legat de fagocitoză și au existat, de asemenea, scăderi semnificative ale genelor asociate cu fagocitoza și răspunsul inflamator (Figura 5E) (Luo și colab., 2005). În concordanță cu un studiu recent asupra Clec12a și Salmonella, aceste date sugerează că fagocitoza este defectuoasă în absența Clec12a ca răspuns la F. rodentium rezident în intestinul normal (Begun și colab., 2015). Pentru a testa acest lucru, macrofagele peritoneale au fost colectate de la animale WT și Clec12a-/- și co-cultivate cu F. rodentium marcat cu Sybr®-verde. Macrofagele Clec12a-/- au avut semnificativ mai puțini microbi pe celulă (Figura 5F, G; Figura S5B), indicând faptul că deficiența Clec12a duce la absorbția mai puține organisme și este în concordanță cu fagocitoza redusă în setul de date ARN-seq. Colectiv, aceste date arată că Clec12a joacă rolul dublu de atenuare a răspunsurilor inflamatorii evidente la liganzii microbieni comuni, în timp ce promovează absorbția bacteriilor macrofage.

Clec12a se leagă preferenţial de comensale gram-pozitive

Deoarece fagocitoza este inițiată de legarea microbilor urmată de internalizare și ucidere, am emis ipoteza că Clec12a a fost capabil să se lege de membri specifici ai microbiotei, cum ar fi F. rodentium. Pentru a aborda această posibilitate, a fost creată o proteină de fuziune care conține domeniul de legare extracelular al Clec12a murin și porțiunea Fc a IgG1 umană (Clec12a-Fc) (Figura 6A) (Maglinao și colab., 2014; Neumann și colab., 2014; Raulf). et al., 2019). Proteina a fost purificată și verificată pentru legarea la un panou de diverse bacterii gram-pozitive și gram-negative despre care se știe că sunt prezente în intestinul homeostatic, inclusiv F. rodentium, Roseburia spp., Bifidobacteria animalis, Akkermansia muciniphila, Bacteriodes uniformis, iar comensalul fungic Candida albicans, prin citometrie în flux. Salmonella enterica a fost, de asemenea, inclusă, deoarece studiile anterioare au indicat că Clec12a s-ar putea asocia cu intrarea S. enterica în celulă (Begun și colab., 2015). Clec12a s-a legat în diferite grade cu mai multe bacterii distincte filogenetic, inclusiv F. rodentium, dar nu și ciupercile, C. albicans (Figura 6B). Clec12a s-a legat cel mai mult de organismele gram-pozitive F. rodentium și un membru al familiei Lachnospiraceae Roseburia sp. și a interacționat cel mai puțin cu B. animalis, B. uniformis și S. enterica (Figura 6B), indicând că Clec12a poate se leagă de membri specifici ai microbiotei cu o preferință pentru organisme gram-pozitive. Luate împreună, datele noastre identifică Clec12a ca un mecanism folosit de sistemul imunitar pentru a supraveghea comunitatea microbiană intestinală și a tăia microbiota prin legarea directă și fagocitoză, prevenind în același timp răspunsurile inflamatorii evidente la microbii gram-pozitivi abundenți, care este esențial pentru menținerea sănătății intestinale.

DISCUŢIE

Homeostazia în intestin necesită mecanisme pentru a restricționa microbii comensali fără a iniția inflamația dăunătoare (Macpherson și colab., 2000). IgA, în ultimii ani, a apărut ca una dintre modalitățile critice prin care imunitatea intestinală poate exercita controlul asupra microbiotei (Pabst și Slack, 2020). Într-adevăr, IgA este capabilă să se lege direct de microbi și/sau de produsele acestora și să le elimine din intestin fără inducerea unei inflamații proto-tipice. Alte molecule imunitare care posedă aceste proprietăți duale nu au fost studiate până în prezent. Lectinele de tip C cuprind o clasă diversă de proteine ​​care pot recunoaște o varietate de molecule de proteine, carbohidrați și lipide din produse microbiene și gazdă (Brown și colab., 2018; Drouin și colab., 2020). Cu toate acestea, puține au fost studiate în contextul imunității intestinale și al microbiotei (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019). Astfel, din cunoștințele noastre, aceasta este prima demonstrație că deficiența de Clec12a modifică compoziția microbiotei care determină severitatea bolii.

beneficii cistanche-întărește sistemul imunitar

Clec12a a fost studiat în mare măsură în contextul recunoașterii uratului monosodic (MSU) sau acidului uric, care este adesea un indiciu al morții celulare (Kono și colab., 2010; Neumann și colab., 2014). Acidul uric este capabil să activeze răspunsurile inflamatorii prin inflamazomul NLRP3, astfel încât, pentru a preveni distrugerea țesuturilor în timpul morții celulare, această inflamație trebuie controlată (Martinon și colab., 2006). Sa demonstrat că Clec12a echilibrează acest răspuns inflamator prin reglarea în jos a semnalizării Syk (Marshall și colab., 2004). În concordanță cu aceasta, ștergerea Clec12a într-un model de inflamație sterilă și un model autoinflamator de artrită determină o activare îmbunătățită a neutrofilelor și o agravare a bolii, făcând din Clec12a o frână inflamatorie importantă (Redelinghuys et al., 2016). Cu toate acestea, mai recent, sa demonstrat că Clec12a îmbunătățește semnalizarea interferonului de tip I ca răspuns la infecția virală și mediază absorbția Salmonella prin calea autofagiei antibacteriene (Begun și colab., 2015; Li și colab., 2019). Acest lucru demonstrează că Clec12a nu funcționează exclusiv pentru a restricționa inflamația, ci mai degrabă, poate juca o varietate de roluri în funcție de context. Intestinul este diferit prin faptul că există un număr mare de celule imunitare chiar și în absența bolii. Acest lucru se datorează prezenței microbiotei, care joacă un rol important în instruirea dezvoltării imune și prevenirea colonizării organismelor patogene. Microbiota posedă aceleași modele de suprafață detectate de TLR care recunosc, de asemenea, agenții patogeni și, prin urmare, sistemul imunitar intestinal trebuie să aibă mecanisme de reglementare stricte pentru a limita inflamația acestor organisme străine (Blander et al., 2017).

Am devenit inițial interesați de Clec12a deoarece am identificat că o ciupercă intestinală, Saccharomyces cerevisiae, induce acidul uric să agraveze colita (Chiaro și colab., 2017). Mai mult, alte studii au identificat că microbiota poate influența bolile intestinale prin inducerea metabolismului purinelor, al cărui produs final la mamifere este acidul uric (Zhu et al., 2019). Aceste date sugerează că mecanismele de detectare a acidului uric, cum ar fi Clec12a, pot influența homeostazia intestinală. Cu toate acestea, nu am observat modificări ale nivelurilor de acid uric din ser sau fecale, ceea ce indică faptul că severitatea îmbunătățită a bolii la un animal Clec12a-/- nu a fost determinată de creșterea acidului uric. Cu toate acestea, severitatea crescută a colitei în Clec12a-/- este determinată de compoziția microbiotei. Astfel, pe baza datelor noastre, expresia redusă a Clec12a-/- ar putea influența compoziția microbiotei la pacienții cu IBD (Jason L. Kubinak, 2015; Rehman și colab., 2011; Vijay Kumar și colab., 2010). Interesant, am descoperit că antibioticele care vizează organisme gram-pozitive au fost capabile să amelioreze severitatea colitei la animalele Clec12a-/-. Acest lucru este în contrast cu mai multe rapoarte care au identificat Enterobacteriaceae gram-negative extinse în timpul inflamației intestinale, prin urmare, acesta este unul dintre puținele studii care au identificat o expansiune a organismelor gram-pozitive care sunt asociate cu dezvoltarea colitei. Deși, probabil nu este singurul organism care influențează severitatea colitei în acest model, o expansiune dramatică a F. rodentium a fost observată la animalele Clec12a-/-. F. rodentium este un membru gram-pozitiv, oxidază și catalază negativ al firmicutes (Bacillota) phyla (Chang și colab., 2015). Introducerea zilnică a F. rodentium chiar și la șoarecii WT crește colita, susținând faptul că nivelurile extinse de F. rodentium în intestin sunt dăunătoare și probabil conduc la severitatea colitei în Clec12a-/-. Un raport recent a demonstrat că F. rodentium poate crește turnover-ul epitelial și poate suprima expresia enzimelor din epitelii care reglează în jos răspunsurile inflamatorii și, astfel, este în concordanță cu boala agravată pe care o vedem atunci când F. rodentium este extins în intestin (Cao și colab., 2022). Deoarece oamenii sunt colonizați cu un organism similar cu F. rodentium (Zagato și colab., 2020), studiile ulterioare ar trebui să elucideze influența acestor bacterii asemănătoare F. rodentium asupra aspectelor fiziologiei umane legate de colită.

Sprijinind un rol pentru Clec12a printre celulele imune înnăscute, am observat că microbiota colitogenă este încă formată la animalele Clec12a-/- cărora le lipsește un sistem imunitar adaptativ. Cel mai mare procent de celule din intestin care exprimă Clec12a au fost macrofage, ceea ce ne-a determinat să ne concentrăm asupra funcției Clec12a în aceste celule. Studiile anterioare au demonstrat că Clec12a este un mediator important al producției de interferon de tip I ca răspuns la infecția virală (Li et al., 2019). Cu toate acestea, modul în care Clec12a influențează răspunsurile la un spectru larg de liganzi bacterieni nu a fost evaluat; acest lucru este foarte relevant în intestin unde există o abundență de liganzi TLR. Aici, arătăm că Clec12a servește la temperarea reacțiilor macrofagelor din intestin și funcționează probabil pentru a asigura homeostazia ca răspuns la microbiotă. ARN-seq de macrofage incubate cu F. rodentium a evidențiat faptul că deficiența Clec12a duce la defecte ale ciclului celular și fagocitozei ca răspuns la aceste bacterii comensale. Un studiu recent a arătat că macrofagele Clec12a-/- au redus autofagia ca răspuns la Salmonella (Begun și colab., 2015). Datele noastre complimentează și extind aceste constatări pentru a include faptul că Clec12a funcționează și pentru a controla organismele comensale neinvazive. F. rodentium s-a arătat de către alții că influențează biologia epitelială, ceea ce sugerează că F. rodentium se află în imediata apropiere a gazdei și, prin urmare, trebuie să fie strâns controlat de sistemul imunitar. Datele noastre susțin că Clec12a controlează F. rodentium prin reglarea fagocitozei. Fagocitoza este inițiată de legarea fizică a unui ligand sau a unui microbi, iar lectinele de tip C se pot asocia cu liganzi multipli, ceea ce ne-a determinat să testăm dacă Clec12a se poate asocia direct cu bacteriile rezidente în intestin. Interesant, Clec12a s-a legat cel mai mult de organismele gram-pozitive F. rodentium și Roseburia și mult mai puțin de organismele gram-negative A. muciniphila și B. uniformis și deloc de C. albicans. Aceste date arată că Clec12a are o tendință de a lega membri specifici ai microbiotei. Acest lucru ne permite să construim un model prin care angajarea Clec12a și fagocitoza ulterioară pot controla anumiți membri ai microbiotei și pot preveni efectele potențial dăunătoare ale expansiunii lor. Acest lucru evidențiază funcția duală a Clec12a care poate limita inflamația împotriva liganzilor microbieni, recunoscând și controlând, de asemenea, membrii specifici ai microbiotei. Astfel, Clec12a reprezintă un mod unic pe care sistemul imunitar înnăscut îl folosește pentru a asigura homeostazia în tractul gastrointestinal.

FIGURI LEGENDARE

Figura 1. Clec12a limitează boala intestinală independent de sistemul imunitar adaptativ

(A) Pentru a evalua severitatea colitei, șoarecii fără agent patogen specific (SPF) WT sau Clec12a-/- C57BL/6 au fost tratați cu 2,5% sulfat de sodiu dextran (DSS) ad libitum timp de 7 zile în apă de băut. Pierderea procentuală în greutate a fost evaluată zilnic. Media +/- SEM, datele sunt reunite din trei experimente independente folosind ANOVA bidirecțională și testul de comparație multiplă Śídák.

(B) Lungimea colonului (cm) a animalelor indicate a fost măsurată la sacrificiu. Un grafic de dispersie este media +/- SEM, datele sunt reunite din trei experimente independente folosind un test t nepereche. Fiecare punct reprezintă un mouse

(C) Lipocalină fecal-2 (ng/mL) a animalelor indicate a fost măsurată ca citire a inflamației. Graficul cu bare este media +/- SEM, datele sunt reunite din două experimente independente folosind un test t nepereche. Fiecare punct reprezintă un mouse

(D) Secțiuni de colon colorate cu H&E reprezentative de la animalele indicate după colita indusă de DSS.

(E) Scorurile histologice pentru animalele indicate au fost generate din secțiunile de colon în

(D). Graficul cu bare este media +/- SEM, comparată folosind un test t nepereche. Fiecare punct reprezintă un mouse.

(F) Modelul de transfer al celulelor T al colitei a fost realizat pentru a evalua colita cronică. Greutatea animalelor TCRb-/- și Clec12a-/-;TCRb-/- a fost măsurată săptămânal. Graficul ilustrează procentul de pierdere în greutate a animalelor indicate pe parcursul experimentului. Media +/- SEM, în comparație cu 2-mod ANOVA.

(G) Lungimea coloniei animalelor indicate de la (I) a fost măsurată la sacrificiu. Graficul cu bare este media +/- SEM, comparată folosind un test t nepereche. Fiecare punct reprezintă un mouse.

(H) WT, Clec12a-/-, Rag-/- sau Rag-/-; Șoarecii Clec12a-/- C57BL/6 SPF au fost evaluați pentru colită acută. Animalele indicate au primit 2,5% DSS ad libitum timp de 7 zile. Pierderea procentuală în greutate a fost evaluată zilnic. Media +/- SEM, datele sunt reprezentative pentru două experimente independente. ANOVA bidirecțional și testul de comparație multiplă al lui Śídák.

(I) Lungimea colonului (cm) a animalelor indicate a fost măsurată la sacrificiu. Graficul cu bare este media +/- SEM, datele sunt reprezentative pentru două experimente independente care utilizează teste t nepereche. Fiecare punct reprezintă un mouse * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Figura 2. Microbiota formată la animalele Clec12a-/- conferă colită agravată

A) Transplanturile de microbiotă fecală (FMT) au fost efectuate prin transferul de supernatanți fecale de la animale WT sau Clec12a la șoareci WT fără germeni. Microbiotele au fost lăsate să se omogenizeze timp de patru săptămâni, după care jumătate dintre șoarecii WTFMT și jumătate dintre șoarecii Clec12a-/-FMT au fost adăpostiți împreună și au lăsat încă patru săptămâni să se amestece. Toate grupurile au primit apoi 2,5% DSS ad libitum în apa lor de băut și au fost sacrificate în ziua 7.

B) Pierderea procentuală în greutate a animalelor indicate a fost evaluată zilnic. Graficul ilustrează media +/- SEM, datele sunt reunite din două experimente independente folosind ANOVA bidirecțională și testul de comparație multiplă al lui Śídák.

C) Lungimea colonului (cm) de la animalele indicate a fost măsurată la sacrificiu. Un grafic de împrăștiere este media +/- SEM, comparată folosind ANOVA unidirecțională obișnuită cu testul de comparații multiple Dunnett. Fiecare punct reprezintă un mouse.

D) Secțiuni de colon colorate cu H&E reprezentative ale animalelor indicate după colită indusă de FMT și DSS.

E) Scorurile histologice au fost generate din secțiunile de colon în (D). Graficul cu bare este media +/- SEM, comparată folosind un test t nepereche. Fiecare punct reprezintă un mouse.

F) Distanțele Unifrac ponderate de la secvențierea genei ARNr 16S a WTFMT, Clec12a-/- FMT sau animale adăpostite în comun. Diagrame cu casete și mustăți care arată toate punctele (comparație de distanță în perechi) și comparate folosind un test Kruskal-Wallis.

G) Distanțele Unifrac neponderate de la secvențierea genei ARNr 16S a WTFMT, Clec12a-/- FMT sau animale găzduite în comun. Diagrame cu casete și mustăți care arată toate punctele (comparație de distanță în perechi) și comparate folosind un test Kruskal-Wallis.

H) Bray-Curtis se distanță de secvențierea genei ARNr 16S a WTFMT, Clec12a-/- FMT sau animalele co-adăpostite. Diagrame cu casete și mustăți care arată toate punctele (comparație de distanță în perechi) și comparate folosind un test Kruskal-Wallis.

Figura 3: Compoziția microbiotei formată la animalele Clec12a-/- este independentă de imunitatea adaptivă

A) Diagrama schematică care arată reconstituirea măduvei osoase cu FMT ulterioară. Șoarecii C57Bl/6 WT au fost iradiați letal și reconstituiți fie cu WT, fie cu Clec12a-/- măduvă osoasă. După 8 săptămâni, fecalele au fost luate de la acești șoareci și transferate în șoareci fără germeni WT, așa cum este explicat în (A). Animalele himerice reconstituite inițial au primit apoi 2,5% DSS ad libitum în apa lor de băut.

B) Pierderea procentuală în greutate a șoarecilor FMT de la (F) a fost evaluată zilnic. Medie +/- SEM, folosind ANOVA bidirecțională și testul de comparație multiplă Tukey.

C) Lungimea colonului (cm) de la animalele indicate a fost măsurată la sacrificiu. Un grafic de dispersie este media +/- SEM, test t nepereche. Fiecare punct reprezintă un mouse

D) FMT pentru a evalua rolul sistemului imunitar adaptativ asupra modelării microbiene și severității colitei au fost efectuate prin transferul de supernatanți fecale din Rag-/- sau Rag-/-; Clec12a-/- animale SPF în șoareci fără germeni WT așa cum este descris în (A). Șoarecii au fost tratați cu 2,5% DSS timp de 7 zile. Pierderea procentuală în greutate a fost evaluată zilnic. Graficul este media +/- SEM, folosind ANOVA bidirecțională și testul de comparație multiplă Tukey.

E) Lungimea colonului (cm) de la animalele indicate în (F) a fost măsurată la sacrificiu. Media +/-, SEM comparată folosind ANOVA unidirecțională obișnuită și testul de comparație multiplă Dunnet. Fiecare punct reprezintă un mouse. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Figura 4. Clec12a limitează expansiunea rozătoarelor Faecalibaculum, un microbi care agravează colita

A) Șoarecilor WT sau Clec12a-/- C57BL/6 SPF li s-a administrat un cocktail de antibiotice (A) (neomicina, gentamicina, ampicilină, eritromicină), cefalotină sau gentamicina (B, C) la o concentrație de 0. 5g/L timp de paisprezece zile. După șapte zile, animalele au primit 2,5% DSS în apa lor de băut până la sacrificiu. Lungimea colonului (cm) de la animalele indicate a fost măsurată la sacrificiu. Un grafic de dispersie este media +/- SEM, test t nepereche. Fiecare punct reprezintă un mouse.

B) Pierderea procentuală în greutate a animalelor indicate a fost evaluată zilnic. Graficul este media +/- SEM, folosind ANOVA bidirecțională și testul de comparație multiplă Tukey

C) Lungimea colonului (cm) a animalelor indicate, măsurată la sacrificiu. Un grafic de dispersie este media +/- SEM, test t nepereche. Fiecare punct reprezintă un mouse.

D) Caracteristici observate din fecalele WT sau Clec12a-/-, diversitatea alfa de secvențiere 16S ARNr. Media +/- SEM, comparată folosind testul Mann-Whitney.

E) Pielou Evenness din fecale WT sau Clec12a-/-, diversitatea alfa de secvențiere ARNr 16S. Media +/- SEM, comparată folosind testul Mann-Whitney.

F) Media entropiei Shannon +/- SEM, comparată folosind testul Mann-Whitney.

G) Analiza ANCOM din fecale WT și Clec12a-/-. Numele taxonomice sunt cele mai bune clasificări ale ASV-urilor folosind Baza de date de taxonomie genomului (GTDB).

H) Abundența relativă a ASV-urilor Faecalibaculum rodentium. Comparat folosind Mann Whitney * p < {{0}}.05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

I) Șoarecii C57Bl/6 WT SPF au fost pre-tratați cu 1x108 CFU de F. rodentium prin gavaj oral timp de trei zile. Animalele au primit apoi 2,5% DSS în apa lor de băut timp de 7 zile, în timp ce au continuat să primească zilnic F. rodentium. Pierderea procentuală în greutate a fost evaluată zilnic. Medie +/- SEM, Datele sunt reunite din patru experimente separate folosind ANOVA bidirecțională și testul de comparație multiplă Tukey.

J) Lungimea colonului (cm) a animalelor indicate a fost măsurată la sacrificiu. Graficul cu bare este media +/- SEM. Datele sunt reunite din patru experimente separate, comparate folosind ANOVA obișnuit unidirecțional cu testul de corecție multiplă Dunnet. Fiecare punct reprezintă un mouse. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Figura 5. Clec12a limitează inflamația și promovează fagocitoza la macrofage.

A) Imunofenotiparea a fost efectuată prin citometrie în flux pe celule izolate din lamina propria colonică (cLP) pe animale WT și Clec12a-/-. Harta termică arată frecvența exprimării Clec12a pe celulele imune înnăscute și adaptive

B) Graficul cu bare arată frecvența celulelor CD38+ pre-gate (macrofage M1) din cLP ale animalelor indicate. Media +/- SEM, comparată folosind testul t nepereche. Fiecare punct reprezintă un mouse.

C) Graficul cu bare arată frecvența celulelor pre-gate, EGR2+ (macrofage M2) din cLP al animalelor indicate. Media +/- SEM, comparată folosind testul t nepereche. Fiecare punct reprezintă un mouse.

D) BMDM-urile au fost recoltate din oasele lungi WT și Clec12a-/- și cultivate în prezența M-CSF (20ng/mL) timp de 7 zile. În ziua 8, BMDM au fost pulsate cu LPS (100ng/mL), MDP (10mg/mL), Pam3cysk (1mg/mL) sau Flagelină (1mg/mL) timp de 24 de ore. Mediul a fost colectat și testat pentru producerea de citokine. Harta termică arată schimbarea Log2 ori a citokinelor indicate de la Clec12a-/- peste WT.

E) BMDM-urile de la șoareci WT și Clec12a-/- au fost izolate și cultivate ca în (A) și apoi co-cultivate cu F. rodentium la un MOI de 10 timp de 24 de ore. După ce BMDM-urile au fost spălate, ARN-ul a fost colectat și pregătit pentru secvențierea ARN-ului. Top 10 categorii simplificate de termeni GO (proces biologic) îmbogățite printre Clec12a-/- downregulated

F) Macrofagele peritoneale au fost izolate de la șoareci WT și Clec12a-/- și apoi cocultivate cu F. rodentium colorat cu verde Sybr pentru a evalua fagocitoza. Stânga: macrofage WT. Dreapta: Clec12a-/- macrofage. Sunt reprezentate imagini reprezentative din câmp luminos (coloane din stânga), fluorescență (coloane din mijloc) și îmbinate (coloane din dreapta). Vârfurile de săgeți galbene denotă exemple de celule de F. rozătoare înghițite de macrofage. bară de scară=20 µm. Imaginile sunt reprezentative pentru două experimente separate.

G) Graficul cu bare arată organisme per celulă, așa cum se vede în (F). 250 de celule WT și 269 de celule Clec12a-/- au fost numărate pentru a cuantifica cantitatea de F. rodentium per celulă.

Figura 6: Clec12a se leagă direct de membri specifici ai microbiotei.

A) Diagrama schematică care ilustrează proteina de fuziune Clec12a-IgG1-Fc umană sau vectorul gol (numai porțiunea Fc) B) Histograme ale analizei citometrice în flux reprezentând legarea diferențială a Clec12a-Fc la diferite bacterii sau C. albicans.

LEGENDE SUPLIMENTARE DE FIGURI

Figura suplimentară 1. Absența Clec12a nu perturbă nivelul de acid uric.

A) Acidul uric seric (pM) al animalelor indicate a fost măsurat pentru a evalua metabolismul purinei între șoarecii WT și Clec12a-/- C57Bl/6. Diagrama de dispersie este media +/- SEM, datele sunt reunite din trei experimente independente folosind un test t nepereche. Fiecare punct reprezintă un mouse.

B) Acidul uric fecal (pM) la animalele indicate a fost măsurat pentru a evalua excreția intestinală de acid uric între șoarecii WT și Clec12a-/- C57Bl/6. Diagrama de dispersie este media +/- SEM, datele sunt reunite din trei experimente independente folosind un test t nepereche. Fiecare punct reprezintă un mouse.

Figura suplimentară 2. Microbiotele WT și Clec12a-/- conduc boli diferențiale

Pierderea procentuală în greutate a animalelor WT și Clec12a-/- tratate cu un cocktail de antibiotice constând din neomicină, gentamicină, ampicilină și eritromicină.

Figura suplimentară 3. Compoziția microbiotei este influențată de Clec12a.

A) Diagrame PCoA ale primelor 3 axe bazate pe distanțe Bray-Curtis care arată relațiile generale cu microbiota și diagramele cu casete și mustăți corespunzătoare care cuantifică diferențele în cadrul fiecărui grup și sunt comparate cu testul Mann-Whitney.

B) Diagrame PCoA bazate pe distanțele Unifrac ponderate și diagramele cu casete și mustații corespunzătoare care cuantifică diferențele în interiorul grupului, comparativ utilizând testul Mann-Whitney nepereche.

C) Tabel care arată rezultatele testului PERMANOVA pentru WT vs. Clec12a-/- microbiota fecală cu Bray-Curtis și distanțe Unifrac ponderate.

Figura suplimentară 4: Clec12a în macrofage restricționează inflamația.

A) Diagramele pentru vioară descriu intensitatea fluorescentă medie geometrică (MFI) a celulelor imune prezentate în (A). Medie +/- SEM, test Kruskal-Wallis cu corecția lui Dunn pentru comparații multiple. Literele denotă grupuri care sunt semnificativ diferite.

B) Diagrame reprezentative de citometrie în flux ale macrofagelor M1 și M2 din cLP ale șoarecilor WT sau Clec12a-/- după colita DSS. Celulele sunt pre-gate pe live, CD45+, Ly6C-, CD11b+, MHCII+ și CD64+. Din figura 5A

Figura suplimentară 5. Clec12a stabilizează controlul ciclului celular și reglează fagocitoza la macrofage.

A) Top 10 categorii simplificate de termeni GO (proces biologic) îmbogățite printre genele reglate în sus Clec12a-/- comparativ cu WT ca răspuns la F. rodentium. BMDM-urile de la șoareci WT și Clec12a-/- co-cultivați cu F. rodentium au fost izolate și analizate ca în Figura 7A.

B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >Au fost numărate 200 de macrofage. Graficul cu bare arată numărul mediu de F. rodentium din 4 godeuri individuale pentru a arăta consistența numărării și efectul între godeuri. Media +/- SEM comparată folosind testul t nepereche.

MULȚUMIRI

Dorim să-i mulțumim lui Gordon Brown pentru că a oferit animalele Clec12a-/- pentru acest proiect. Această lucrare a fost susținută de Fundația Helen Hay Whitney (KSO), Grantul de formare T32 NRSA pentru patogeneza microbiană a Universității din Utah (KSO), un premiu CCFA pentru cercetare senior (JLR), NIDDK R01DK124336, NIDDK R01124317 și NCCAM R01AT011423 (JLRd), Edward Mallin Jr. Foundation (JLR), NSF CAREER Award (IOS-1253278) (JLR), Packard Fellowship in Science and Engineering (JLR), Burroughs Welcome Investigator in Patogenesis Award (JLR), American Asthma Foundation (JLR), Margolis Foundation (JLR), o grant pentru MS Society Center (JLR) și WM Keck Foundation (JLR) NIH New Innovator Award DP2GM111099-01 (RMO), NHLBI R00HL102228-05 ( RMO), un grant de cercetare al Societății Americane de Cancer (RMO), un premiu Kimmel Scholar (RMO), R01AG047956 (RMO) și NIAID R01AI141202 (ASI). Această lucrare a fost susținută de Institutul de citometrie în flux de la Universitatea din Utah, în plus față de Institutul Național al Cancerului, prin Award Number 5P30CA042014-24. Sprijinul și resursele de la Centrul de calcul de înaltă performanță de la Universitatea din Utah sunt recunoscuți cu recunoștință.

CONTRIBUȚII AUTORULUI

TRC a ajutat la conceperea studiului, a efectuat majoritatea experimentelor de șoarece și imunologie, a reunit datele în cifre și a ajutat la scrierea manuscrisului. RB a organizat experimente fără germeni și a menținut toate animalele fără germeni. ESV a ajutat la experimentele de imunologie cu lamina propria intestinală. KSO a ajutat cu recoltele de șoareci și a oferit informații și direcție. KMB a ajutat cu recoltele de șoareci și citometria în flux. MCN a ajutat cu recoltele de șoareci. WV a oferit ajutor la construirea construcției pentru proteina de fuziune și purificare. TJ a oferit ajutor cu testele de fagocitoză. JH a analizat lamele de microscopie de fagocitoză. MH a oferit ajutor la purificarea și utilizarea proteinei de fuziune. KAK furnizează izolate bacteriene. ROC a oferit expertiză și perspectivă în imunologie. WZS a ajutat la conceperea studiului, a efectuat analize bioinformatice, a ajutat la pregătirea figurii și la statistici și a ajutat la scrierea manuscrisului. JLR a ajutat la conceperea și la conducerea studiului, a supravegheat designul experimental și rezultatele, a organizat colaboratorii și reactivii, a strâns finanțare pentru studiu și a ajutat la scrierea manuscrisului.

METODE

Tulpini de șoarece

Toate liniile de mouse utilizate aici au fost pe un fundal C57BL/6. Șoarecii Clec12a-/- au fost furnizați cu amabilitate de Gordon Brown (Centrul de Micologie Medicală a Consiliului de Cercetare Medicală, Universitatea din Exeter) și au fost genotip conform protocolului descris anterior (Redelinghuys, et al. 2016). Rag2-/- și TCRb-/- (Jackson Laboratories, 002118) au fost obținute de la Jackson Laboratories și menținute în colonia noastră de șoareci timp de câteva generații. Pentru toate experimentele de colită in vivo au fost utilizați șoareci cu vârsta de 8 până la 12-săptămâni. S-au folosit atât șoareci masculi, cât și femele. Șoarecii au fost menținuți în condiții specifice fără agenți patogeni.

Tulpini bacteriene și fungice

Următoarele organisme au fost achiziționate de la DSMZ-German Collection of Microorganism and Cell Cultures GmbH: Faecalibaculum rodentium (DSM# 103405); Akkermansia mucinophilia DSMZ (DSM# 26127); Bifidobacterium animalis DSMZ (DSM# 26074). Bacteroides uniformis a fost achiziționat de la American Type Culture Collection (ATCC® 8492™). O Roseburia sp (desemnarea tulpinii JLR.KK002) a fost izolată pe agar Schaedler de la șoareci C57BL/6 care adăpostesc o microbiotă îmbogățită cu formatori de spori. Îmbogățirea cu spori a fost efectuată așa cum a fost descris anterior și șoarecii au fost menținuți pentru mai multe generații cu această microbiotă în instalația noastră de gnotobiotică înainte ca JLR.KK002 să fie izolat din fecale (Browne și colab., 2016). Am amplificat prin PCR și Sanger a secvențiat gena ARNr 16S și apoi a clasificat-o cu serviciul SILVA ACT și baza de date SILVA (Pruesse et al., 2012). S-a folosit tulpina Salmonella typhimurimum ST2. S-a folosit tulpina de Candida albicans sc5314. Tulpinile bacteriene utilizate în comunitatea sintetică PhyLo11b sunt descrise mai jos.

Colita experimentală indusă de DSS

Colita a fost indusă prin adăugarea a 2,5% sau 3% (g/v) 36,000-50,000MW Dextran sulfat de sodiu (DSS) (MP Biomedicals) în apa de băut timp de 7 zile. Severitatea colitei a fost monitorizată zilnic prin modificări ale greutății corporale, consistenței scaunului și sângelui fecal. Pentru experimentul de salvare a monocitelor toți șoarecii au primit 2,5% DSS timp de 5 zile, după care s-a administrat apă obișnuită; monitorizarea greutății a continuat până în ziua 10 când animalele au fost recoltate. Au fost impuse limite de severitate mai mari de 20% pierdere în greutate ca prag de severitate. La obiectivele experimentale, MLN-urile și colonul au fost îndepărtate. Colonul a fost măsurat de la cecum la rect pentru a determina lungimea. Țesuturile au fost apoi prelucrate pentru histologie, extracția ARN sau analiza citometrică în flux.

Histologia și scorul colonului

Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).

ELISA pentru lipocalină-2 (LCN-2).

Protocolul a fost realizat conform protocolului producătorului (Fischer Scientific DY1857-05). Pe scurt, fecalele au fost colectate, cântărite și piureate în HBSS 1X la o concentrație de 100 mg/mL. Probele au fost apoi rotite la 50 xg timp de 5 minute pentru a îndepărta resturile mari. Supernatantul a fost apoi îndepărtat și plasat într-un tub nou și rotit la 8000 xg timp de 5 minute pentru a peletiza bacteriile. Acest supernatant a fost apoi diluat în funcție de boala animalelor, dar a variat în general între 1:100- 500 (sănătos) – 1:500-1000 (tratat cu DSS). Măsurarea acidului uric Concentrația acidului uric a fost efectuată conform instrucțiunilor producătorului (kit de analiză a activității uric/uricazei Invitrogen™ Amplex™Red, cat # A22181). Pe scurt, sângele a fost colectat de la șoareci WT sau Clec12a-/- prin puncție cardiacă în tuburi separatoare de ser superioare aurii. Tuburile au fost lăsate să se coaguleze timp de 30 de minute și apoi au fost rotite la 1300 xg timp de 10 minute. Serul a fost îndepărtat și plasat în tuburi Eppendorf de 1,5 ml, congelat rapid și păstrat la -80 grade Celsius până la testare. Acidul uric fecal a fost realizat prin obținerea de pelete fecale proaspete de la șoareci WT și Clec12-/-. Peletele au fost cântărite și înregistrate și apoi s-au făcut piure în 1 ml de tampon de reacție 1x. După piure fizică, tuburile au fost rotite la 50 xg timp de 5 minute pentru a îndepărta resturile mari. Suspensia fecală rămasă a fost testată pentru acid uric.

Colita experimentală cu transfer de celule T

Splinele WT au fost izolate și piureate în RPMI care conține 10% ser fetal bovin, penicilină și streptomicina. Celulele au fost rotite la 367 xg pentru a izola celulele. Peleta rezultată a fost apoi suspendată în tampon de liză RBC timp de 5 minute, la întuneric, la temperatura camerei. Celulele albe rezultate au fost apoi trecute printr-o coloană Miltenyi CD4+ MACS pentru a izola celulele T CD{4+. Celulele T au fost apoi colorate cu CD4 și CDRB și sortate pe un FACS Aria Fusion (BD Biosciences). Celulele CD4+ CDRBhi au fost colectate și administrate la TCRb-/- sau TCRb-/-; Şoareci Clec12a-/- intraperitoneal (IP). Fiecare șoarece a primit 5 x 105 celule. Severitatea și dezvoltarea colitei au fost monitorizate săptămânal prin evaluarea pierderii în greutate. La punctul final experimental, MLN-urile și colonii au fost îndepărtați și colonii au fost măsurați de la cecum la rect pentru a evalua severitatea bolii.

Izolarea leucocitelor din lamina propria colonică

Colonii murini cu ceca atașat au fost recoltați și plasați în 1X PBS în plăci de 6-godeuri pe gheață. Orice grăsime rămasă vizibil și țesut conjunctiv a fost îndepărtat și cecumul a fost tăiat din colon. Colonii au fost deschiși, iar mucusul și fecalele au fost îndepărtate cu grijă din colon înainte de a fi plasate înapoi în 6-placa pentru godeuri. Odată ce toate colonurile au fost răspândite și răzuite, fiecare colon a fost tăiat cubulețe pe un capac de vase Petri folosind o lamă de ras și plasat într-un tub separat de 50 ml. S-a adăugat 1 0 mL de soluție de disociere preîncălzită (1X HBSS fără Ca+ și Mg+, 1,5 mM DTT, 10 mM HEPES și 30 mM EDTA) și tuburile au fost agitate pentru scurt timp. Colonii au fost incubați timp de aproximativ 25 de minute. la 37 de grade cu agitare la 150 rpm până când soluțiile au fost tulburi de la separarea IEC. Probele au fost agitate de 3 ori și agitate timp de 15 secunde, apoi turnate peste un filtru de 100 mM pe un filtru conic de 50 ml pentru a îndepărta celulele neimune, cum ar fi IEC, iar filtrele au fost clătite scurt cu 2 ml de PBS 1X rece cu gheață. Țesutul rămas a fost colectat pe filtru cu pense și mutat într-un nou conic de 50 ml. 15 ml de soluție de digestie preîncălzită (1X HBSS cu Ca+ și Mg, 5% FBS, 50 U/ml Dispase II [Millipore-Sigma, cat # 4942078001], 0,5 mg/ml DNAse I [Worthington Biochemical, cat # LS002139] și s-a adăugat 0,5 mg/mL Colagenaza D [Millipore-Sigma, cat # 11088866001]), probele au fost agitate scurt în vortex și, ulterior, au fost incubate timp de 45 de minute. la 37 de grade cu agitare la 150 rpm, sau până când soluția a devenit tulbure. Probele au fost apoi agitate de 3 ori și agitate timp de 15 secunde. Pentru a colecta celulele cLP imune rămase, țesutul digerat a fost apoi turnat peste un filtru de 40 mM pe un tub conic de 50 mL care conține 10 mL 1X PBS. Probele sunt apoi clătite și filtrate cu 2 ml de 1X PBS răcit cu gheață și centrifugate la 800 xg timp de 10 minute la 4 grade. Apoi, supernatantul a fost îndepărtat și aruncat cu vid. Celulele au fost apoi resuspendate în 500 ml de RPMI complet și au fost numărate cu colorare de excludere cu albastru tripan.

Citometrie în flux

Leucocitele izolate din cLP au fost colorate pentru viabilitate folosind colorant zombie 510 (AmCyan) timp de 10 minute la RT în întuneric. Probele au fost apoi blocate cu receptorul Fc cu CD-16/32 timp de 20 de minute la 4 grade în întuneric. După centrifugare la 367 xg timp de 5 minute, celulele decantate au fost colorate timp de 30 de minute la întuneric la 4 grade. Toți anticorpii au fost utilizați la o diluție de 1:250, dacă nu este menționat altfel. Panoul de mileloid a fost format din CD45-BV421, CD11b-PerCpCy5.5, MHCII-BV605, CD64-BV711, CX3CR{1-BV785, Ly6C-FITC, CD{38-PE- Cy7, Ly6G-CF-594, Clec12a-PE (1:500), EGR2-APC (intracelular, 1:50). Celulele T s-au distins prin: Zombie colorant 510 (AmCyan), CD45-BV421, CD3e-BV711, CD{4-FITC, Foxp{3-APC (intracelular 1:50), IL{{ 50}}PE (intracelular 1:50), IFN-g (BV605) (intracelular 1:50), RORgt-PE610 (intracelular 1:50), IL-17A-BV785 (intracelular 1:50). După colorare, celulele au fost spălate de 2 ori timp de 5 minute fiecare cu tampon de coloană (1X HBSS fără Ca2+, Mg2+ și HEPES, EDTA, FBS). Celulele au fost fixate O/N cu 2% PFA dacă nu a fost necesară o colorare intracelulară și apoi au fost spălate în tampon de coloană de 2X înainte de a rula pe citometrul de flux. Dacă a fost necesară colorarea intracelulară, au fost urmate kitul FoxP3 / Transcription Factor Staining Buffer (Tonbo Biosciences) și protocolul. Toate probele au fost apoi resuspendate în 300 ul de tampon de coloană și au fost rulate pe un BD LSR Fortessa după compensarea cu UltraComp eBeads (ThermoFisher Scientific) și utilizarea controalelor cu un singur color.

Bacteriile colorante cu IgA

Bacteriile au fost izolate din pelete fecale prin piure în HBSS cu Ca2+ și Mg{2+, la o concentrație de 100 mg fecale per ml HBSS. Fecalele piure au fost apoi centrifugate la 50 xg timp de 5 minute pentru a îndepărta resturile mari. Supernatantul a fost îndepărtat și plasat într-un tub nou. Acesta a fost apoi centrifugat la 8000 xg timp de 5 minute pentru a peleta bacteriile. Supernatantul a fost îndepărtat și peletele au fost spălate în HBSS cu Ca2+ și Mg2+. În cele din urmă, peletele au fost resuspendate în HBSS la o concentrație de 100 mg/mL, iar 10 uL din aceasta au fost plasate într-o placă de 96-godeuri și blocate cu HBSS cu Ca2+ și Mg2+ care conține 10% FBS timp de 20 de minute la temperatura camerei. 100 uL de anti-IgA (PE) au fost apoi adăugate direct la probă și incubate timp de 30 min la 4°C în întuneric. Celulele au fost apoi spălate în soluție HBSS+FBS de 2x și în cele din urmă resuspendate în HBSS+1x Sybr®-green și lăsate să incubeze timp de 20 de minute la întuneric la RT. Probele au fost apoi citite direct pe citometrul de flux.

Izolarea măduvei osoase

Măduva osoasă a fost izolată așa cum a fost descris anterior. Pe scurt, oasele lungi de la animalele de tip C57Bl/6 Wild sau Clec12a-/- au fost extrase și curățate cu un prosop de hârtie prin frecare ușoară. Oasele curate au fost ținute pe gheață în timp ce animalele au fost procesate. Capetele oaselor au fost ușor tăiate pentru a expune măduva. Osul a fost introdus (capătul expus cu fața în jos) într-un tub Eppendorf de 0,5 ml care a fost străpuns cu un ac de 18 g. Acest tub Eppendorf de 0,5 ml a fost apoi plasat într-un tub Eppendorf de 1,5 ml și rotit la 13,000 x g timp de 1 minut. Filat prin măduva osoasă a fost apoi lizat RBC, folosind tampon de liză RBC (Biolegend) conform recomandărilor producătorului. După liza RBC, celulele au fost resuspendate în Mediu Eagle modificat complet Dulbecco (DMEM) care conține: 10% FBS, 1 mg/ml Pen/Strep, HEPES 10 mM, 1 x aminoacid neesențial, piruvat de sodiu 1 mM. Celulele au fost apoi centrifugate la 367 xg timp de cinci minute pentru a peletiza celulele. Celulele izolate au fost apoi utilizate pentru a dezvolta BMDM-uri sau pentru a izola în continuare monocite.

Macrofage derivate din măduva osoasă

Leucocitele au fost izolate din izolarea măduvei osoase, suspendate în DMEM complet și numărate prin colorarea de excludere cu albastru tripan pe un hemocitometru. Celulele au fost placate pe vase de 10 cm tratate cu cultură de țesut la o concentrație de 5-8 x 106 celule/placă în 10 mL de mediu complet + M-CSF (20ng/mL). Mediile proaspete, inclusiv M-CSF, au fost adăugate la mediile existente în zilele 4 și 7. BMDM-uri complet diferențiate au fost utilizate pentru utilizare experimentală între zilele 7-9.

Izolarea monocitelor

Măduva osoasă a fost recoltată de la animale WT și Clec12a-/- așa cum s-a descris anterior. Monocitele au fost izolate cu kit-ul de izolare a monocitelor (BM), un șoarece (Miltenyi Biotec) și o coloană LS MACS conform instrucțiunilor producătorului.

F. rozătoare BMDM co-cultură și ARNseq

Culturile de F. rodentium au fost cuantificate prin OD 600nm (folosind 1 OD 600nm=1 x 10^8 celule/mL), spălate de 2x în PBS steril și co-cultivate cu 1 x 106 celule/mL BMDM complet diferențiate la un MOI de 10 în plăci de cultură de țesut 6-godeuri. După 24 de ore de cocultură, mediul a fost colectat și depozitat la -20 C până la utilizare ulterioară. BMDM-urile au fost spălate cu PBS rece, steril, de 2x. Qiazol (Qiagen cat # 79306) reactiv de stabilizare ARN, a fost apoi adăugat direct în fiecare godeu. Godeurile au fost răzuite cu o racletă celulară colectată în 1,5 tuburi Eppendorf și congelate la -20 grade până la extracția ARN. Extracția ARN a fost efectuată folosind un kit de miniprep Direct-zol ARN (Zymo Research cat # R2070) conform instrucțiunilor producătorului, iar bibliotecile de secvențiere au fost pregătite de către instalația centrală de genomică de înaltă performanță a Huntsman Cancer Institute. ARN total a fost mai întâi hibridizat cu kit-ul de epuizare a ARNr NEBNext v2 (NEB, cat # E7400) pentru a diminua ARNr-ul din probe. Bibliotecile de secvențiere ARN catenară au fost preparate utilizând kitul de pregătire pentru bibliotecă de ARN direcțională NEBNext Ultra II pentru Illumina (NEB, cat # E7760L). Bibliotecile purificate au fost calificate pe o Agilent Technologies 4150 TapeStation folosind un test ScreenTape D1000 (Agilent, cat# 5067-5582 și 5067-5583). Molaritatea moleculelor modificate cu adaptor a fost definită prin PCR cantitativă utilizând kitul Kapa Biosystems Kapa Library Quant (Roche, cat#07960140001). Bibliotecile individuale au fost normalizate la 5 nM în pregătirea pentru analiza secvenței Illumina și secvențiate pe un NovaSeq 6000 cu o rulare de secvențiere 150-ciclului de sfârșit pereche.

Analiza citokinelor

BMDM au fost izolate și crescute așa cum s-a descris anterior. BMDM-urile complet diferențiate au fost placate la 1 x 105 celule/godeu în plăci de cultură de țesut 12-godeuri. BMDM-urile au fost stimulate cu 100ng/mL LPS; 1 ug/mL Pam3Cysk; sau 1 ug/mL flagelină. Celulele au fost stimulate timp de 24 de ore, mediul a fost colectat și salvat la -20 C pentru analiză. Citokinele au fost analizate cu LEGENDplex™ Mouse Inflammation Panel (13-plex) (Biolegend, cat# 740150). Datele au fost analizate folosind software-ul de analiză a datelor LEGENDplex™.

secvențierea genei ARNr 16s

Granulele fecale sau conținutul ileal au fost colectate de la șoareci individuali și congelate imediat la grade {{0}} în tuburi cu capac filetat de 2 ml care conțineau 250 mg de margele de granat de 0,15 mm (MoBio, cat # {{5 }}). ADN-ul a fost extras utilizând kitul Power Fecal DNA Isolation Kit (MoBio sau QIAGEN), conform instrucțiunilor din kit și a inclus 2 cicluri de 1 minut de batere a mărgelelor la 4 grade pe un Mini-Bead-Beater 16 (BioSpec Products). Regiunile V3 și V4 ale genei ARNr 16S au fost amplificate cu o singură rundă de PCR utilizând primeri care conțineau (descrise de la 3’ la 5’) secvența de țintire a genei ARNr 16S din regiunea V3/4, urmată de un 2-pad nucleotid de secvențele primerului Illumina, o secvență de index de nucleotide 8- și secvența adaptor Illumina rămasă. Secvențele de direcționare V3/4 16S au fost preluate de la Takahashi (Takahashi și colab., 2014), iar indicii au fost preluați de la Kozich (Kozich și colab., 2013). Secvențele complete de oligonucleotide utilizate au fost (indici notați cu X): Prok16SV34_Pentru: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTTGCCTACGGGNBGCASCAG; Prok16SV34_Rev: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCTGCGACTACNVGGGTATCTAATCC. Condițiile de ciclizare PCR au fost următoarele: denaturare inițială la 98 de grade timp de 2 minute; 26 de cicluri de 20 sec denaturare 98 grade, 20 sec recoacere 51,5 grade, 20 sec extensie 72 grade; și o singură extensie finală de 72 de grade timp de 2 minute. Fiecare PCR (efectuată în trei exemplare pentru fiecare probă) a fost efectuată într-un volum de 25 ul utilizând Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB, cat # M0492L), 5 pmol din fiecare primer și 50 ng ADN matriță. După amplificare, PCR-urile triplicate din fiecare probă au fost reunite, 5 ul au fost rulate pe un gel de agaroză pentru a confirma amplificarea, iar volumul rămas a fost curățat folosind perle de curățare Axygen AxyPrep MAG PCR (Corning, cat # MAG-PCR-CL{53). }}) diluat la 62,5% în apă pentru a îndepărta eficient orice dimer de primer care ar fi secvențial preferabil. Granule diluate au fost adăugate la 1,8X volumul reacțiilor PCR, curățate conform instrucțiunilor producătorului și ampliconii curățați au fost eluați cu 25 ul 10 mM Tris-CI, pH 8,0. Ampliconii au fost apoi cuantificați cu un test dsDNA pico green (ThermoFisher, cat #P11495) pe un cititor de microplăci, iar apoi bibliotecile de secvențiere individuale curățate și indexate au fost multiplexate uniform (prin ng ADN) și secvențiate pe un instrument Illumina MiSeq în pereche. Modul 300 de cicluri la unitatea de resurse partajată de genomică de mare randament al Huntsman Cancer Institute.

Procesarea bioinformatică a datelor secvențe

Citirile brute ale genei ARNr 16S au fost demultiplexate permițând 0 nepotriviri în indici, apoi procesate și analizate în cadrul QIIME2 (Bolyen și colab., 2019) așa cum am descris anterior (Stephens și colab., 2021). Pe scurt, secvențele demultiplexate și filtrate de calitate au fost mai întâi tăiate din secvențele primer și linker cu plugin-ul Cutadapt, apoi au fost eliminate cu DADA2 (Callahan și colab., 2016; Martin, 2011). Taxonomiile au fost apoi atribuite ASV-urilor cu metoda classifysklearn în plugin-ul de clasificator de caracteristici, față de setul de referință GTDB (release89) tăiat în regiunea V3/4 amplificată și antrenat cu metoda fit-classifier-naive-bayes (Bokulich și colab. , 2018; Parks et al., 2018; Pedregosa et al., 2011). Măsurile de diversitate, distanțele și semnificația statistică a grupărilor de diversitate beta după permanova au fost calculate în QIIME2 (Anderson, 2001).

Pentru ARN-seq-urile BMDM, citirile brute au fost de primă calitate și tăiate cu adaptor folosind trim din belșug, apoi numărările de transcriere au fost cuantificate folosind Somon față de transcriptomul din ansamblul GRCm38 (mm10) (Patro și colab., 2{{ 16}}17). Cuantificările nivelului de transcriere au fost citite în R folosind pachetul de timp și rezumate la numărarea nivelului genei înainte de analiza exprimării diferențiale cu DESeq2 folosind formula de proiectare „~ Genotip + Tratament + Genotip: Tratament” (Love și colab., 2014; Love și colab., 2020). Răspunsurile diferențiale la F. rodentium au reprezentat diferența dintre răspunsul fiecărui genotip la tratamentul cu F. rodentium în viață față de celulele tratate cu vehicul de control. Genele exprimate diferențial semnificativ au fost definite ca acelea cu o valoare p ajustată < 0,05 și log2 fold-change > |0,58| (1,5 ori-schimbare). Au fost apoi utilizate liste de gene reglate în mod semnificativ în jos și în sus pentru a testa îmbogățirea în termeni de ontologie a genelor (GO) folosind pachetul clusterProfiler, inclusiv funcția de simplificare pentru a reduce redundanța termenului GO și pentru a identifica procesele biologice cheie (S, 2020; Wu et al. ., 2021).

F. rozătoare DSS provocare

F. rodentium a fost crescut așa cum s-a descris anterior și a fost cuantificat la 1 x 109 CFU/mL în PBS steril. F. rodentium a fost fixat prin spălare mai întâi de 2x în PBS steril și apoi resuspendare în 1 ml 10% Fomalin-PBS timp de 10 minute. Celulele au fost apoi spălate de încă două ori în 10 ml PBS steril pentru a se pregăti pentru gavaj oral. Nefixate au fost spălate ca celulele fixe și ținute pe gheață până la gavaj. Șoarecii WT C57BL/6 SPF au fost calibrați oral cu 100 uL de soluție care conținea fie PBS singur (vehicul), F. rodentium (viu), fie F. rodentium (fix) din zilele -3 până la 10. Animalelor li s-a administrat 3,0% DSS în zilele 0-7; apa proaspătă DSS a fost înlocuită o dată la două zile. Au fost impuse limite de severitate mai mari de 20% pierdere în greutate ca prag de severitate. La obiectivele experimentale, MLN-urile și colonul au fost îndepărtate. Colonul a fost măsurat de la cecum la rect pentru a determina lungimea. Țesuturile au fost apoi prelucrate pentru histologie, extracția ARN sau analiza citometrică în flux.

Testul de fagocitoză

Macrofagele peritoneale au fost izolate prin injectarea a 5 ml de PBS steril în cavitatea peritoneală. PBS a fost agitat ușor în timp ce se afla în cavitate la fiecare câteva secunde. După 2 minute, PBS a fost extras folosind un ac de calibrul 28 și distribuit în DMEM complet rece. Celulele au fost rotite la 367 xg și spălate în mediu complet. Celulele au fost apoi numărate cu un hemocitometru și placate în plăci de cultură de țesut 12-godeuri la o concentrație de 2,5 x 105 celule/ml. Celulele au fost lăsate să adere peste noapte. A doua zi, godeurile au fost amestecate ușor prin vârtej și mediul a fost aspirat. Celulele aderente au fost apoi spălate de două ori cu 500 uL de PBS rece, steril. DMEM complet preîncălzit care conține F. rodentium la un MOI de 10 a fost apoi adăugat la aderent (macrofage). Plăcile au fost apoi rotite ușor la 200 xg, la temperatura camerei timp de trei minute și apoi incubate în condiții standard de cultură celulară (37 C, 5% CO2) timp de 90 de minute. F. rodentium a fost preparat așa cum este descris pentru co-cultura de BMDM-uri numai pentru secvențierea ARN, după spălare, celulele au fost resuspendate într-un verde Sybr® 1x (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3), la RT timp de 20 de minute. Celulele bacteriene au fost apoi granulate la 4000 rpm timp de 5 minute resuspendate cu DMEM complet și preîncălzite pentru macrofagele peritoneale. După 90 de minute de cocultură, mediul a fost aspirat și celulele au fost spălate de două ori cu PBS, steril, rece. Celulele aderente care conţin F. rodentium colorat cu verde Sybr® au fost fixate cu 2% paraformaldehidă (PFA) timp de 10 minute. PFA a fost aspirat și PBS steril a fost plasat pe celule. Celulele au fost apoi fotografiate pentru fagocitoza F. rodentium

Analiza imaginii macrofage

Imagini de câmp luminos și fluorescență ale culturilor de macrofage tratate cu F. rozătoare au fost luate folosind un sistem de imagistică EVOS m7000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Au fost luate trei până la cinci imagini randomizate separate pentru fiecare cultură, care au fost efectuate în trei exemplare.

Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).

Construcția proteinei de fuziune CLEC12A-Fc and purificatipe

ADNc-urile care codifică domeniile extracelulare ale Clec12a de șoarece au fost amplificate prin PCR din celulele albe din sânge izolate din măduva osoasă C57Bl/6 WT SPF și confirmate prin secvențiere. ADNc-urile au fost fuzionate la capătul C-terminal al IgG1-Fc umană în vectorul de expresie pFuse-hIgG1- Fc2 (InvivoGen). Construcțiile care conțineau Clec12a sau vectorul gol au fost transfectate în celule Lx293 cultivate cu DMEM +10% FBS și Pen/strep (1 mg/mL). Proteinele de fuziune secretate au fost recoltate din medii 24-48 după transfecție. Mediul a fost rotit la 367 xg timp de 5 minute pentru a îndepărta resturile/celulele moarte, iar supernatantul a fost înghețat la -20 C până la utilizare. Proteinele de fuziune Clec12a-Fc sau numai Fc au fost izolate cu Kitul Pierce™ Classic Magnetic IP/Co-IP (Thermo Fisher Scientific, Număr de catalog: 88804), cuantificat cu Kitul de testare a proteinelor Pierce™ BCA (Numărul de catalog Thermo Fisher Scientific: 23227) și confirmat prin western blot folosind anticorp antiClec12a (Novus Biologicals NBP2-27346SS).

Testul de legare a Clec12a-Fc

Construcțiile purificate au fost diluate la 0,4 mg/mL în HBSS cu Ca2+ și Mg2+. Bacteriile au fost crescute în mediile și condițiile aerobe respective și normalizate prin OD 600nm. Bacteriile au fost spălate cu HBSS cu Ca2+ și Mg2+ și blocate cu HBSS cu Ca2+ și Mg2+ +10% FBS timp de 20 de minute la RT. Toate procedurile de colorare au avut loc în condiții atmosferice. 1 x 107 celule bacteriene au fost plasate într-o placă de 96-godeuri cu fund rotund, rotite la 3,000 xg și decantate. 50 uL de construcții au fost plasați pe celule bacteriene, amestecați ușor și incubați la 4°C timp de 1 oră. Celulele bacteriene au fost spălate cu HBSS cu Ca2+ și Mg{2+ + 10% FBS, de 2x. 50 uL de Fc anti-uman de capră (PE) (ebioscience Catalog # 12-4998-82) au fost adăugate la celule și incubate la 4°C timp de 1 oră, la întuneric. Celulele au fost apoi spălate ca înainte și plasate în HBSS cu Ca2+ și Mg{2+ care conține 1x Sybr® verde (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3). Celulele au fost incubate la RT timp de 20 de minute în întuneric și citite imediat pe un citometru de flux BD LSR Fortessa.

Iradierea și reconstituirea măduvei osoase

Măduva osoasă a fost recoltată de la animale WT și Clec12a-/- așa cum s-a descris anterior. Șoarecii primitori primiți au fost iradiați letal cu 500 Rads în ziua -1, urmați de 400 Rads în ziua 0. La patru ore după ultima iradiere, șoarecii primitori au fost plasați sub anestezie cu izofluran și 100 uL de izolat. Celulele de măduvă osoasă suspendate în PBS steril (1 x 108 celule/mL) au fost livrate prin intermediul unui ac de calibrul 28,5 în spațiul retro-orbital. Am fost interesați de microbiotă, astfel încât animalele nu au fost plasate pe antibiotice, iar după 8 săptămâni au fost colectate granule fecale pentru transferul microbiotei în animalele GF.

REFERINȚE

Anderson, MJ (2001). O nouă metodă pentru analiza multivariată neparametrică a varianței. Austral Ecol. 26, 32-46. DOI 10.1111/j.1442-9993.2001.01070.pp.x.

Begun, J., Lassen, KG, Jijon, HB, Baxt, LA, Goel, G., Heath, RJ, Ng, A., Tam, JM, Kuo, SY, Villablanca, EJ și colab. (2015). Genomica integrată a variantei de risc pentru boala Crohn

identifică un rol pentru CLEC12A în autofagia antibacteriană. Celulă Rep. 11, 1905-1918. 10.1016/j.celrep.2015.05.045.

Blander, JM, Longman, RS, Iliev, ID, Sonnenberg, GF și Artis, D. (2017). Reglarea inflamației prin interacțiunile microbiotei cu gazda. Nat. Imunol. 18, 851-860. 10.1038/ni.3780.

Bokulich, NA, Kaehler, BD, Rideout, JR, Dillon, M., Bolyen, E., Knight, R., Huttley, GA și Caporaso, JG (2018). Optimizarea clasificării taxonomice a secvențelor de ampliconi de gene marker cu pluginul de clasificare a funcțiilor QIIME 2 ''sq2-. Microbiomul 6. ARTN 90 10.1186/s40168-018-0470-z.

Bolyen, E., Rideout, JR, Dillon, MR, Bokulich, N., Abnet, CC, Al-Ghalith, GA, Alexander, H., Alm, EJ, Arumugam, M., Asnicar, F. și colab. (2019). Știința datelor microbiomului reproductibilă, interactivă, scalabilă și extensibilă folosind QIIME 2. Nat. Biotehnologia. 37, 852-857. 10.1038/s41587-019-0209-9.

Brown, GD, Willment, JA și Whitehead, L. (2018). Lectine de tip C în imunitate și homeostazie. Nat. Rev. Immunol. 18, 374-389. 10.1038/s41577-018-0004-8.

Browne, HP, Forster, SC, Anonye, ​​BO, Kumar, N., Neville, BA, Stares, MD, Goulding, D. și Lawley, TD (2016). Cultivarea microbiotei umane „neculturabile” dezvăluie taxoni noi și sporulare extinsă. Natura 533, 543-+. 10.1038/nature17645.

Cadwell, K., Liu, JY, Brown, SL, Miyoshi, H., Loh, J., Lennerz, JK, Kishi, C., Kc, W., Carrero, JA, Hunt, S. și colab. (2008). Un rol cheie pentru autofagie și gena autofagiei Atg16l1 în celulele Paneth intestinale de șoarece și umane. Natura 456, 259-263. 10.1038/nature07416.

Callahan, BJ, McMurdie, PJ, Rosen, MJ, Han, AW, Johnson, AJA și Holmes, SP (2016). DADA2: Inferență de probă de înaltă rezoluție din datele ampliconului Illumina. Nat. Metodele 13, 581-+. 10.1038/Nmeth.3869.

Cao, YG, Bae, S., Villarreal, J., Moy, M., Chun, E., Michaud, M., Lang, JK, Glickman, JN, Lobel, L. și Garrett, WS (2022). Faecalibaculum rodentium remodelează semnalizarea acidului retinoic pentru a guverna homeostazia epitelială intestinală dependentă de eozinofile. Celulă gazdă și microbi 30, 1295- 1310 e1298. 10.1016/j.chom.2022.07.015.

Chang, DH, Rhee, MS, Ahn, S., Bang, BH, Oh, JE, Lee, HK și Kim, BC (2015). Faecalibaculum rodentium gen. nov., sp. nov., izolat din fecalele unui șoarece de laborator. Antonie Van Leeuwenhoek 108, 1309-1318. 10.1007/s10482-015-0583-3.

Chiaro, TR, Soto, R., Stephens, WZ, Kubinak, JL, Petersen, C., Gogokhia, L., Bell, R., Delgado, JC, Cox, J., Voth, W. și colab. (2017). Un membru al micobiotei intestinale modulează metabolismul purinelor gazdei exacerband colita la șoareci. Sci. Transl. Med. 9, .

Drouin, M., Saenz, J. și Chiffoleau, E. (2020). Receptori asemănători lectinei de tip C: cap sau coadă în imunitatea la moartea celulelor. Față. Imunol. 11. ARTN 251 10.3389/fimmu.2020.00251.

Fassarella, M., Blaak, EE, Penders, J., Nauta, A., Smidt, H. și Zoetendal, EG (2021). Stabilitatea și rezistența microbiomului intestinal: elucidarea răspunsului la perturbări pentru a modula sănătatea intestinală. Gut 70, 595-605. 10.1136/gutjnl-2020-321747.

Gkouskou, KK, Deligianni, C., Tsatsanis, C. și Eliopoulos, AG (2014). Microbiota intestinală în modelele de șoarece ale bolii inflamatorii intestinale. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 4. ARTN 28 10.3389/fcimb.2014.00028.

Han, YM, Zhang, MH, Li, N., Chen, TY, Zhang, Y., Wan, T. și Cao, XT (2004). KLRL1, un nou receptor asemănător celulelor ucigașe, inhibă citotoxicitatea celulelor ucigașe naturale. Sânge 104, 2858-2866. DOI 10.1182/sânge-2004-03-0878.

Iliev, ID, Funari, VA, Taylor, KD, Nguyen, Q., Reyes, CN, Strom, SP, Brown, J., Becker, CA, Fleshner, PR, Dubinsky, M. și colab. (2012). Interacțiunile dintre ciupercile comensale și receptorul de lectină de tip C Dectin-1 influențează colita. Știința 336, 1314-1317. 10.1126/ştiinţă.1221789.

Jason L. Kubinak, WZS, Ray Soto, Charisse Petersen, Tyson Chiaro, Lasha Gogokhia, Rickesha Bel1, Nadim J. Ajami, Joseph F. Petrosino, Linda Morrison4, Wayne K. Potts, Peter E. Jensen, Ryan M. O' Connell și June L. Runda (2015). Variația MHC sculptează comunități microbiene individualizate care controlează susceptibilitatea la infecția enterică. Comunicarea Naturii. 0,1038/ncomms9642.

Kono, H., Chen, CJ, Ontiveros, F. și Rock, KL (2010). Acidul uric promovează un răspuns inflamator acut la moartea celulelor sterile la șoareci. J. Clin. Investi. 120, 1939-1949. 10.1172/Jci40124.

Kozich, JJ, Westcott, SL, Baxter, NT, Highlander, SK și Schloss, PD (2013). Dezvoltarea unei strategii de secvențiere cu index dublu și a unei conducte de curare pentru analiza datelor secvențelor de ampliconi pe platforma de secvențiere MiSeq Illumina. Microbiologie aplicată și de mediu 79, 5112-5120. 10.1128/Aem.01043-13.

Kubinak, JL, Petersen, C., Stephens, WZ, Soto, R., Bake, E., O'Connell, RM și Round, JL (2015). Semnalizarea MyD88 în celulele T direcționează controlul mediat de IgA al microbiotei pentru a promova sănătatea. Cell Host Microbe 17, 153-163. 10.1016/j.chom.2014.12.009.

Li, K., Neumann, K., Duhan, V., Namineni, S., Hansen, AL, Wartewig, T., Kurgyis, Z., Holm, CK, Heikenwalder, M., Lang, KS și Ruland, J. (2019). Receptorul cristalin al acidului uric Clec12A potențează răspunsurile la interferon de tip I. Proc Natl Acad Sci USA 116, 18544-18549. 10.1073/pnas.1821351116.

Liu, JZ, van Sommeren, S., Huang, H., Ng, SC, Alberts, R., Takahashi, A., Ripke, S., Lee, JC, Jostins, L., Shah, T. și colab. . (2015). Analizele asociației identifică 38 de loci de susceptibilitate pentru boala inflamatorie intestinală și evidențiază riscul genetic comun între populații. Nat. Genet. 47, 979-986. 10.1038/ng.3359.

Love, MI, Huber, W. și Anders, S. (2014). Estimarea moderată a schimbării pliului și a dispersiei pentru datele ARN-seq cu DESeq2. Genom Biol. 15. ARTN 550 10.1186/s13059-014-0550-8.

Love, MI, Soneson, C., Hickey, PF, Johnson, LK, Pierce, NT, Shepherd, L., Morgan, M. și Patro, R. (2020). Tximeta: Sume de control ale secvenței de referință pentru identificarea provenienței în ARN-seq. Plos Computational Biology 16. ARTN e1007664 10.1371/journal.pcbi.1007664.

Luo, Y., Tucker, SC și Casadevall, A. (2005). Activarea receptorilor Fc și a complementului stimulează progresia ciclului celular al celulelor macrofage de la G1 la SJ Immunol. 174, 7226- 7233. 10.4049/jimmunol.174.11.7226.

Macpherson, AJ, Gatto, D., Sainsbury, E., Harriman, GR, Hengartner, H. și Zinkernagel, RM (2000). Un mecanism primitiv independent de celulele T al răspunsurilor IgA ale mucoasei intestinale la bacteriile comensale. Știința 288, 2222-+. DOI 10.1126/science.288.5474.2222.

Maglinao, M., Eriksson, M., Schlegel, MK, Zimmermann, S., Johannssen, T., Gotze, S., Seeberger, PH și Lepenies, B. (2014). O platformă de screening pentru carbohidrații care leagă receptorul de lectină de tip C și potențialul lor de direcționare specifică celulei și modulare imună. Journal of Controlled Release 175, 36-42. 10.1016/j.jconrel.2013.12.011.

Marshall, ASJ, Willment, JA, Lin, HH, Williams, DL, Gordon, S. și Brown, GD (2004). Identificarea și caracterizarea unui nou receptor de tip lectină de tip c inhibitor mieloid uman (MICL) care este exprimat predominant pe granulocite și monocite. J. Biol. Chim. 279, 14792-14802. 10.1074/jbc.M313127200.

Martin, M. (2011). Cutadapt elimină secvențele adaptorului din citirile de secvențiere cu randament ridicat. EMBNet.journal 17. Martinez-Lopez, M., Iborra, S., Conde-Garrosa, R., Mastrangelo, A., Danne, C., Mann, ER, Reid, DM, Gaboriau-Routhiau, V., Chaparro , M., Lorenzo, MP, et al. (2019). Sentirea microbiotei prin axa Mincle-Syk în celulele dendritice reglează producția de interleukine-17 și -22 și promovează integritatea barierei intestinale. Imunitate 50, 446-461 e449. 10.1016/j.immuni.2018.12.020.

Martinon, F., Petrilli, V., Primar, A., Tardivel, A. și Tschopp, J. (2006). Cristalele de acid uric asociate gutei activează inflamazomul NALP3. Natura 440, 237-241. 10.1038/nature04516.

Nakajima, A., Vogelzang, A., Maruya, M., Miyajima, M., Murata, M., Son, A., Kuwahara, T., Tsuruyama, T., Yamada, S., Matsuura, M., et al. (2018). IgA reglează compoziția și funcția metabolică a microbiotei intestinale prin promovarea simbiozei dintre bacterii. J. Exp. Med. 215, 2019-2034. 10.1084/jem.20180427.

Neumann, K., Castineiras-Vilarino, M., Hockendorf, U., Hannesschlager, N., Lemeer, S., Kupka, D., Meyermann, S., Lech, M., Anders, HJ, Kuster, B. , şi colab. (2014). Clec12a este un receptor inhibitor pentru cristalele de acid uric care reglează inflamația ca răspuns la moartea celulelor. Imunitate 40, 389-399. 10.1016/j.immuni.2013.12.015.

Okai, S., Usui, F., Yokota, S., Hori, IY, Hasegawa, M., Nakamura, T., Kurosawa, M., Okada, S., Yamamoto, K., Nishiyama, E., etc. al. (2016). IgA monoclonală de mare afinitate reglează microbiota intestinală și previne colita la șoareci. Nat Microbiol 1, 16103. 10.1038/nmicrobiol.2016.103.

Pabst, O. și Slack, E. (2020). IgA și microbiota intestinală: importanța de a fi specific. Imunol mucoase. 13, 12-21. 10.1038/s41385-019-0227-4.

Parks, DH, Chuvochina, M., Waite, DW, Rinke, C., Skarshewski, A., Chaumeil, PA și Hugenholtz, P. (2018). O taxonomie bacteriană standardizată bazată pe filogenia genomului revizuiește în mod substanțial arborele vieții. Nat. Biotehnologia. 36, 996-+. 10.1038/nbt.4229.

Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA și Kingsford, C. (2017). Somonul oferă o cuantificare rapidă și conștientă de părtinire a expresiei transcrierii. Nat. Metodele 14, 417-+. 10.1038/nmeth.4197.

Pedregosa, F., Varoquaux, G., Gramfort, A., Michel, V., Thirion, B., Grisel, O., Blondel, M., Prettenhofer, P., Weiss, R., Dubourg, V., et al. (2011). Scikit-learn: Învățare automată în Python. J Mach Learn Res 12, 2825-2830.

Pyz, E., Huysamen, C., Marshall, AS, Gordon, S., Taylor, PR și Brown, GD (2008). Caracterizarea MICL murin (CLEC12A) și dovezi pentru un ligand endogen. EURO. J. Immunol. 38, 1157-1163. 10.1002/eji.200738057.

Raulf, MK, Johannssen, T., Matthiesen, S., Neumann, K., Hachenberg, S., Mayer-Lambertz, S., Steinbeis, F., Hegermann, J., Seeberger, PH, Baumgartner, W., et al. (2019). Receptorul de lectină de tip C CLEC12A recunoaște hemozoina plasmodială și contribuie la dezvoltarea malariei cerebrale. Cell Rep. 28, 30-38 e35. 10.1016/j.celrep.2019.06.015.

Ray, A. și Dittel, BN (2015). Legăturile dintre disbioza din microbiota intestinală din cauza imunodeficienței și penetrarea bolii a colitei. Imunologie 146, 359-368. 10.1111/imm.12511.

Redelinghuys, P., Whitehead, L., Augello, A., Drummond, RA, Levesque, JM, Vautier, S., Reid, DM, Kerscher, B., Taylor, JA, Nigrovic, PA și colab. (2016). MICL controlează inflamația în artrita reumatoidă. Ann. Rheum. Dis. 75, 1386-1391. 10.1136/annrheumdis-2014-206644.