Clonarea, identificarea funcțională și analiza expresiei Chalcone Synthase din Cistanche Tubulosa Ⅱ

3 Rezultate și analiză

3.1 Clonarea genei CtCHS

Patru secvențe adnotate ca „calcon sintază” au fost eliminate folosind datele transcriptomului florilor de Cistanches tubulosa. Prin comparația Blast a NCBI, s-a constatat că o singură secvență avea întreaga lungime a genei CHS și avea un FPKM mai mare de 10. Primeri specifici au fost proiectați pe baza acestei secvențe și un fragment de aproximativ 1200 bp a fost obținut prin amplificare PCR folosind ADNc al florii de Cistanches tubulosa ca șablon (Figura 1). Produsul PCR a fost recuperat pe gel și conectat la vectorul pCE2TA/Blunt-Zero. Rezultatele de secvențiere au fost în concordanță cu analiza transcriptomului. Gena a fost numită CtCHS. Lungimea secvenței este de 1173 bp și codifică 390 de aminoacizi.

Serviciul de asistență al Wecistanche-Cel mai mare exportator de cistanche din China:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Cumpărați pentru mai multe detalii despre specificații:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

3.2 Analiza bioinformatică a CtCHS

3.2.1 Proprietățile fizice și chimice ale CtCHS și analiza domeniului transmembranar

Software-ul online ProtParam a fost folosit pentru a analiza proprietățile fizice și chimice ale proteinei codificate de gena CtCHS. CtCHS codifică 390 aminoacizi, formula moleculară este C1908H3041N511O562S22, masa moleculară relativă este 42 836.54, punctul izoelectric teoretic este 5,85 și este instabil. Coeficientul II este 43,24, care este o proteină instabilă, iar hidrofilitatea medie generală (GRAVY) este -0,052, care este o proteină hidrofilă. Instrumentul online Prot Scale a fost folosit în continuare pentru a analiza hidrofilitatea/hidrofobicitatea proteinei. Rezultatele analizei au arătat că valoarea maximă a hidrofilității/hidrofobicității proteinei CtCHS a fost 2,422 (342) și valoarea minimă a fost -2,489 (119). Lanțul peptidic de aminoacizi codificat de gena CtCHS are mai multe resturi de aminoacizi hidrofile decât resturi de aminoacizi hidrofobe, deci este o proteină hidrofilă. Software-ul online TMHMM a fost folosit pentru a prezice structura transmembranară a proteinei. Proteina CtCHS nu are domeniu transmembranar.

Fig. 1 Amplificarea prin PCR a genei CtCHS

3.2.2 Predicția structurii secundare și a structurii terțiare a proteinei CtCHS

Instrumentul online SOPMA a fost folosit pentru a prezice structura secundară a proteinei. Rezultatele sunt prezentate în Figura 2-A. 44,87% elice, 31,03% spire aleatoare, 15,64% lanțuri extinse și 8,46% foițe constituie structura secundară a proteinei CtCHS. structura de nivel. Software-ul de analiză online SWISS-MODEL a fost folosit pentru a prezice structura terțiară a proteinei, iar structura cristalină a orezului CHS1 a fost folosită ca șablon pentru a prezice structura tridimensională a proteinei CtCHS. Rezultatele sunt prezentate în figura 2-B. Consistența dintre Cistanche tubulosa CtCHS și orez CHS1 este de 83,55%.

3.2.3 Compararea secvențelor și analiza și aplicarea arborelui filogenetic

Software-ul DNAMAN realizează compararea omologiei între CtCHS și secvențele de aminoacizi CHS ale altor specii. Rezultatele sunt prezentate în figura 3-C. Secvența de aminoacizi CtCHS este în concordanță cu Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) și Antirrhinum majus L. (P06515. 1), Mazus pumilus (NL Burman) Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1) și Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). Secvențele de aminoacizi ale CHS sunt foarte asemănătoare, similaritatea fiind de 90,93%, 90,68%, 90,18%, 89,42%, 89,42% și 81,61%.

EXTRACT DE CISTANCHE ORGANIC NATURAL CU 30% ECHINACOSIDE SI 12% ACTEOSIDE

În plus, alinierea secvenței multiple a arătat, de asemenea, că CtCHS are reziduuri catalitice conservate Cys164, His303 și Asn336. Pentru a înțelege în continuare poziția evolutivă a Cistanche tubulosa CtCHS în familia CHS de plante, software-ul MEGA-X a fost folosit pentru a construi un arbore filogenetic între proteinele CtCHS și CHS ale altor plante. Rezultatele sunt prezentate în Figura 3-DE lewisii AHJ80976.1) ElCHS este strâns legat.

3.3 Exprimarea și purificarea procariotei CtCHS

Plasmida pET-28a-CtCHS a fost transformată în tulpina de expresie de E. coli BL21 (DE3), iar expresia proteinei a fost indusă de IPTG la temperatură scăzută. Proteina a fost purificată utilizând o coloană de cromatografie de afinitate cu ioni de nichel, iar proteina purificată a fost detectată prin SDSPAGE 10%. Rezultatele sunt prezentate în Figura 3. Banda de proteină CtCHS a apărut aproape de 40,000, ceea ce este în concordanță cu masa moleculară relativă a proteinei CtCHS de 42.800.

3.4 Analiza activității enzimei CtCHS

Pentru a identifica funcția CtCHS, proteina CtCHS purificată a fost incubată cu malonil-CoA, 4-cumaroil-CoA și produsele au fost detectate utilizând HPLC și MS. În condiții naturale, naringenina-calcona este instabilă în soluție și este ușor ciclizată în naringenină. Prin urmare, naringenin-chalcone și naringenin au fost selectate ca martori standard.

Rezultatele testului HPLC sunt prezentate în Figura 4-A și B. Timpul de retenție al produsului de reacție enzimatică este similar cu cel al standardului de naringenină. Ambele au absorbție maximă la 289 nm în spectrul de absorbție UV, care este diferit de timpul de retenție al naringeninei-calcone. Spectrele de timp și de absorbție UV au fost diferite, dar ca control negativ, produsul după incubarea proteinei CtCHS inactivate la temperatură înaltă cu substratul nu a conținut naringenină, calconă și naringenină. Detectarea ulterioară prin spectrometrie de masă, spectrul de masă de prim nivel (Figura 4-C, D) a arătat că produsul de reacție enzimatică are [MH]-vârf m/z271.060 97, în timp ce naringenina are [MH] ]-vârf m/z 271.060 91.

Comparând spectrele MS2 (Figura 5-E, F), produsul reacției enzimatice CtCHS și naringenina au ambele vârfuri caracteristice ale fragmentelor la m/z 107, 151 și 177, ceea ce este în concordanță cu raportul din literatură [19], indicând faptul că CtCHS are complex chalcone. Activitate enzimatică, poate cataliza reacția malonil-CoA și 4-cumaroil-CoA în naringenin-calconă.

3.5 Analiza localizării subcelulare

Pentru a studia rolul proteinei CtCHS în celule, plasmida pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS a fost construită și transformată în protoplaste Arabidopsis thaliana pentru a observa localizarea sa subcelulară. Rezultatele sunt prezentate în Figura 5. Ca martor, proteina pCAMBIA1300-35S-GFP a fost distribuită în nucleu și citoplasmă, în timp ce proteina de fuziune pCAMBIA{1300-35S-GFP-CtCHS a fost distribuită în principal în citoplasma, indicând faptul că proteina CtCHS poate funcționa în citoplasma celulelor vegetale. Funcţie.

3.6 Analiza modelului de expresie CtCHS

qRT-PCR a fost utilizat pentru a detecta expresia relativă a CtCHS în florile de Cistanche deserticola cu trei culori: alb, violet și roșu. Rezultatele sunt prezentate în Figura 6. Expresia CtCHS în florile violet și roșii a fost semnificativ mai mare decât cea în florile albe. cantitate. Comparativ cu florile albe, nivelul de expresie al CtCHS în florile violet este de 8,44 ori mai mare, iar nivelul de expresie al CtCHS în florile roșii este de 3,21 ori mai mare. Aceste rezultate indică faptul că modificările nivelurilor de expresie CtCHS pot fi legate de diferența de culoare a florii de Cistanche deserticola. Cu cât nivelul de expresie este mai mare, cu atât culoarea florii este mai închisă. , cu cât nivelul de expresie este mai scăzut, cu atât culoarea florii este mai deschisă.

****P＜0.000 1Fig. 6 Nivelul de expresie relativ al CtCHS în flori cu culori diferite

4. Discutie

CHS este aenzimă cheie în calea de biosinteză a flavonoidelorși este legat de the reglarea culorii florilorla multe plante. De exemplu, culoarea florii deDianthus chinensisL.[20] și Petunia × hybrida Hort. exVilm.[22] sunt toate afectate de CHS. Control.Cistanches tubulosaare în principal trei culori de flori: alb, roșu și violet, dar mecanismul său de reglare a culorii florilor nu a fost încă raportat. În acest studiu, o genă CtCHS a fost donată folosind RT-PCR prinanaliza datelor transcriptomului florilor de Cistanches tubulosa, si este

Analiza bioinformaticăa fost efectuată, iar rezultatele au arătat că CtCHS are o asemănare mare și o relație genetică strânsă cu secvența de aminoacizi a ElCHS a Physalis nigra (AHJ80976.1). CHS este o poliketid sintază de tip III (PKSIII), iar studiile au descoperit că CHS are o triada catalitică conservată Cys-His-Asn [23]. În acest studiu, analiza de aliniere a secvenței de aminoacizi a arătat că CtCHS are reziduuri catalitice conservate Cys164, His303 și Asn336, ceea ce indică faptul că CtCHS poate avea o funcție tipică de chalcon sintetază.

capabil. Analiza activității enzimatice a fost efectuată folosind expresia procariotă a proteinei CtCHS în Escherichia coli și detectată prin HPLC și MS. S-a descoperit că proteina CtCHS poate cataliza 4-cumaroil-CoA și malonil-CoA pentru a produce naringenin-calconă.

CHS este implicat în sinteza flavonoidelor în multe plante, dar locația sa subcelulară este diferită la diferite specii. De exemplu, Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. EaCHS[26] sunt toate localizate în citoplasmă, în timp ce Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS

[27], vinetele Solanum melongena L. SmCHS [28] este localizată în citoplasmă și nucleu, iar la struguri Vitis vinifera L. VvCHS este localizată în citoplasmă, nucleu și peretele celular [29]. În acest studiu, plasmida pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS a fost folosită pentru a transforma protoplastele de Arabidopsis thaliana și s-a observat că proteina CtCHS a fost localizată în principal în citoplasmă și poate cataliza producția de naringenin-calconă în citoplasmă pentru favorizează acumularea de flavonoide.

Calea fenilpropanoidului se ramifică de la 4-cumaroil-CoA în calea de sinteză a flavonoizilor și calea de biosinteză a lignanilor. CHS catalizează 4-cumaroil-CoA și malonil-CoA pentru a genera naringenină și calconă pentru a iniția flavonoidele. Calea biosintetică a compușilor asemănătoare compușilor este prima enzimă cheie în această cale [30]. Prin urmare, CHS foarte exprimat este benefic pentru plante pentru a acumula niveluri mai mari de flavonoide și pentru a produce flori mai închise la culoare. De exemplu, nivelul de expresie al CHS la soiurile cu flori violete de Hosta plantaginea (Lam.) Aschers este mai mare decât cel al soiurilor cu flori albe. Hosta HpCHS este transformată în tutun pentru a se obține În comparație cu tutunul de tip sălbatic, plantele cu supraexpresie au petale mai închise la culoare și un conținut total mai mare de antociani [31].

În acest studiu, nivelul de expresie al genei CtCHS este legat de culoarea florilor de Cistanches tubulosa. Este foarte exprimat în flori violet mai închise și flori roșii și are un număr scăzut de flori albe de culoare deschisă. Diferența de expresie a CtCHS se poate datora diferenței dintre florile Cistanches tubulosa. Unul dintre motivele pentru a avea costume și culori diferite. În rezumat, acest studiu a clonat o genă CtCHS din florile de Cistanche deserticola și a efectuat analize bioinformatice asupra acesteia. Proteina recombinantă CtCHS a fost obținută prin exprimare exogenă în Escherichia coli. Analiza activității enzimatice a demonstrat că proteina CtCHS poate cataliza 4-coenzima cumaroil. A și malonil-coenzima A generează naringenina-calconă. S-a descoperit că gena CtCHS este foarte exprimată în flori violet și roșii și scăzut în flori albe. Aceste rezultate indică faptul că gena CtCHS poate regla producția de diferite culori de flori în Cistanche deserticola, ceea ce este benefic pentru cercetările ulterioare asupra mecanismului de reglare a culorii florii Cistanche tubulosa și oferă o referință pentru cercetările ulterioare privind rolul CtCHS în reglarea culoarea florii în Cistanche deserticola.