Combinarea infuziei adoptive de celule NK cu o peptidă care eliberează dopamină reduce celulele senescente la șoarecii în vârstă

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

INTRODUCERE

Îmbătrânirea este unul dintre factorii majori de risc pentru multe boli [1], iar dezvoltarea unor metode de intervenție în îmbătrânire va reduce semnificativ riscul apariției unei serii de boli legate de vârstă precum bolile cardiovasculare și cerebrovasculare [2, 3], cancerul. [4] și boala Alzheimer [5]. Celulele senescente (SNC) se acumulează treptat în țesuturi în timpul procesului de îmbătrânire și sunt considerate cauza principală a bolilor legate de vârstă [6-8]. S-a demonstrat că îndepărtarea SNC-urilor în modelele de șoarece previne sau întârzie disfuncția tisulară și extinde durata de viață sănătoasă [9, 10]. În schimb, transplantarea unor cantități mici de SNC cauzează disfuncție fiziologică la șoarecii tineri [1]. Aceste studii au deschis porțile pentru dezvoltarea unor metode care vizează eliminarea SNC pentru a ameliora bolile cronice legate de vârstă.

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

Direcționarea clearance-ului SNC, denumită „senolitice” a fost prima chimioterapie testată cu succes într-un model preclinic in vivo și există în prezent mai mulți agenți senolitici [12]. Multe dintre aceste medicamente vizează căile anti-apoptotice reglate în sus din SNC pentru a elimina selectiv anumite tipuri de SNC și au demonstrat potențialul de a prelungi durata de viață și de a îmbunătăți funcțiile corpului [13, 14].Extract de Cistanche Anti RadiațiiÎn ciuda inversării cu succes a patologiei legate de vârstă în modelele animale, pot exista unele obstacole în calea utilizării medicamentelor senolitice la oameni din cauza eterogenității SNC-urilor și a riscului ridicat de toxicitate [15]. Prin urmare, ar trebui explorată o metodă alternativă care poate elimina în siguranță o gamă largă de SNC la oameni.

SNP-urile pot fi recunoscute și îndepărtate de sistemul imunitar [16]. Studiile anterioare au arătat că SNC-urile activează celulele ucigașe naturale (NK) prin reglarea în sus a principalului ligand de activare a proteinei A și B legate de lanțul de clasa I de histocompatibilitate [17]. Cu toate acestea, odată cu creșterea în vârstă, eficiența sistemului imunitar scade, ceea ce poate duce la evadarea imună a SNC-urilor [18]. Metode de depășire a evadării imune cauzate de scăderea funcției imune au fost explorate în terapia cancerului [19]. S-au făcut progrese recente în transferul adoptiv de celule NK pentru a elimina tumorile, ceea ce a demonstrat o oarecare eficacitate [20]; astfel, a fost rezonabil să presupunem că infuzia adoptivă de celule NK ar putea produce citotoxicitate în SNC.

Sistemul nervos și imunitar sunt cele mai importante două sisteme adaptative ale organismului. Mai multe studii au arătat că dopamina (DA) ca regulator imunitar este cheia comunicării neuroimune [21]. DA își îndeplinește funcțiile biologice prin interacțiunea și activarea receptorilor dopaminergici (DR), care sunt împărțiți în 2 subgrupe, D1-like (D1 și D5) și D2-like (D2, D3, și D4). În ceea ce privește diferitele lor funcții, angajarea D1-like DR stimulează producția de cAMP, în timp ce angajarea D2-like DR inhibă producția de cAMP [22]. Studiile anterioare au arătat că D1-stimularea DR crește citotoxicitatea celulelor NK atât in vitro [23], cât și in vivo [24]. Cu toate acestea, nivelurile de DA scad pe măsură ce vârsta umană crește [25]. Astfel, am emis ipoteza că medicamentele dopaminergice ar putea spori citotoxicitatea infuziei adoptive de celule NK.

Cistanche poate anti-imbatranire

Aici, propunem utilizarea nonapeptidei Aceină, care a interacționat cu o enzimă de conversie a angiotensinei (ACE I) pentru a induce secreția DA [26], în combinație cu terapia sistemică cu celule NK pentru a elimina SNC. Rezultatele in vitro au arătat că celulele NK au îndepărtat SNC-urile, independent de inductorii de senescență și de tipurile de celule.cistanche herbaÎntr-un model de șoarece îmbătrânit, terapia cu celule NK în combinație cu Acein a redus semnificativ numărul de celule pozitive -galactozidază (SA- -gal) asociate senescenței din mai multe țesuturi, a scăzut expresia genelor asociate senescenței în organele majore. și fenotipurile secretoare asociate senescenței (SSPs). Rezultatele acestui studiu oferă perspective asupra posibilei restabiliri a supravegherii imune a SNC cronice folosind terapia cu celule NK în combinație cu Ace.

REZULTATE

Infuzia adoptivă de celule NK reduce celulele CD3 plus T senescente din sângele periferic

Douăzeci și șase de voluntari care au primit perfuzie cu celule NK au fost recrutați pentru studiu. Caracteristicile și proprietățile celulelor NK ale voluntarilor sunt prezentate în Tabelul 1. Intervalul de timp pentru rememorarea sângelui după transfuzia de celule NK a fost de aproximativ 37(25-57)zile. Proporția (Fig.1A) și numărul absolut (Fig.1B) de celule NK din sângele periferic au fost invers legate de vârsta voluntarilor. În mod surprinzător, puritatea produsului cu celule NK reinfuzat în fiecare individ a fost, de asemenea, invers corelată cu vârsta voluntarilor (Fig.1C).cresterea penisului cistancheAcest lucru se poate datora scăderii treptate a numărului de celule NK odată cu creșterea în vârstă. Pentru a reflecta efectul anti-îmbătrânire al administrării celulelor NK, mai mulți markeri senescenți în celulele CD3 plus T din sângele periferic, care reflectă în mare măsură fenotipul corporal legat de vârstă [27], au fost detectați înainte și după infuzia de celule NK. În comparație cu markerii de senescență și factorul SASP ai celulelor CD3 plus T din sângele periferic înainte și după perfuzia de celule NK autologe, proporția celulelor T SA- -gal-pozitive a scăzut semnificativ după perfuzie (Fig.1D). Nivelurile de ARNm ale P16, P21 și inhibitorul activator al plasminogenului 1 (Pai1) au fost semnificativ scăzute, în timp ce modificările nivelurilor de ARNm ale proteinei chemoatractante monocite-1 (MCP{-1) și IL-6 nu au fost semnificative (Fig. 1E). Nu a existat nicio diferență semnificativă în indici biochimici (Tabelul suplimentar 1) din sângele periferic.

Celulele NK umane reduc markerii de senescență a țesutului adipos și secreția de citokine proinflamatorii

Țesutul adipos a fost colectat de la trei indivizi obezi, deoarece obezitatea tinde să provoace o acumulare de SNC [28]. În plus, țesutul adipos a fost cultivat într-un mediu condiționat din SNC pentru a induce în continuare senescența țesutului adipos. Țesutul adipos cultivat într-un mediu condiționat din non-SNC a fost considerat drept martor. Expresia perforinei (Fig. 2A) și CD69 (Fig. 2B) în celulele NK au fost semnificativ reglate după co-incubarea cu țesut adipos senescent, comparativ cu co-incubarea cu țesutul adipos de control. Expresia markerilor senescenți p16 și p21 în

țesutul adipos senescent a fost semnificativ scăzut după tratamentul cu celule NK (Fig.2C, Fig.1A, B suplimentară). De asemenea, am constatat că componenta cheie a SASP în mediul condiționat după co-incubarea cu celule NK din grupul senescent a fost semnificativ scăzută (Fig. 2D). Aceste rezultate au sugerat că celulele NK ar putea elimina SNC-urile din țesutul adipos și ar putea reduce fenotipul SASP.

Celulele NK de șoarece pot fi activate împotriva SNC-urilor și pot exercita citotoxicitate

Am indus mai întâi senescența celulelor progenitoare adipoase de șoarece prin iradiere sau Adriamicină așa cum s-a descris anterior [29]. Pentru a determina dacă celulele NK au fost activate în mod specific de către SNC, celulele de control neiradiate sau SNC-urile iradiate au fost co-incubate cu celule NK timp de 24 de ore. Citometria în flux a arătat că nivelurile de expresie ale CD69 (Fig. 3A) și IFN-y (Fig. 3B) în celulele NK au fost semnificativ reglate în sus în celulele țintă SNC în comparație cu celulele țintă de control. Între timp, după co-incubarea cu celule NK, nivelul apoptotic al SNC-urilor a fost semnificativ mai mare decât cel al celulelor de control (Fig. 3C). Apoi, am detectat expresia liganzilor de activare și inhibiție a celulelor NK în SNC. Rezultatele qPCR au arătat că nivelul de expresie al liganzilor de activare în celulele NK a fost semnificativ reglat în creștere în comparație cu celulele de control, iar nivelul de expresie al unor liganzi inhibitori, cum ar fi microglobulina beta 2 (2m), a fost reglat în jos în comparație cu celulele de control (Fig. .3D). Am examinat, de asemenea, capacitatea celulelor NK de a elimina SNC-urile in vivo.beneficii salsa cistancheCelulele de control marcate cu DiR și SNC-urile marcate cu DiR au fost transplantate în cavitatea abdominală a șoarecilor, iar celulele NK au fost administrate prin vena cozii. Rezultatele imagistice in vivo au arătat că intensitatea fluorescenței la șoarecii transplantați cu SNC după tratamentul cu celule NK a fost semnificativ mai slabă decât cea la șoarecii transplantați cu celule de control (Fig. 3E). Acest lucru a indicat că capacitatea celulelor NK de a ucide SNC-urile a fost semnificativ mai mare decât cea a SNC-urilor in vivo. Apoi, am determinat dacă citotoxicitatea celulelor NK împotriva SNC-urilor a fost dependentă de doză și specifică celulei. În același timp, am folosit și senescența indusă de doxorubicină pentru a determina dacă citotoxicitatea celulelor NK față de SNC a fost limitată la inducerea radiațiilor. Rezultatele au arătat că celulele NK au avut activitate citotoxică semnificativă împotriva SNC-urilor într-o manieră dependentă de doză, dar citotoxicitate mică împotriva celulelor de control. Diferite metode de stimulare a senescenței nu au avut niciun efect asupra capacității celulelor NK de a ucide SNC-urile (Fig.3F). Aceste rezultate au sugerat că celulele NK ar putea fi activate în mod specific de SNC-uri și ar putea produce citotoxicitate semnificativă împotriva SNC-urilor in vitro și in vivo.

DA îmbunătățește citotoxicitatea celulelor NK de șoarece împotriva SNC-urilor prin receptori de tip D1-

Având în vedere funcția importantă de comunicare neuroimună a DA [30], am evaluat dacă DA ar putea crește citotoxicitatea celulelor NK de șoarece împotriva SNC-urilor. Celulele NK au fost co-incubate cu SNC induse de radiații și au fost adăugate diferite concentrații de DA în mediu. Rezultatele au arătat că DA ar putea crește citotoxicitatea celulelor NK împotriva SNC-urilor (Fig. 4A, B). Pentru a caracteriza calea de semnalizare prin care DA a îmbunătățit efectul de distrugere al celulelor NK asupra SNC-urilor, au fost evaluate modificările în expresia DR, conținutul de cAMP și fosforilarea proteinei de legare a elementului de răspuns (CREB) cAMP în celulele NK. În celulele NK co-incubate cu SNC împreună cu DA, conținutul de cAMP (Fig. 4C) și nivelul de fosforilare al CREB (Fig. 4D, Fig. 2A suplimentară) au fost semnificativ crescute, în comparație cu celulele NK și co-incubarea SNC. fara DA. Pentru a clarifica de ce DA îmbunătățește activitatea de ucidere a celulelor NK împotriva SNC-urilor, am comparat modificările DR pe celulele NK după ce celulele NK au fost co-incubate cu SNC-uri sau celulele de control. Rezultatele au arătat că nivelul de expresie a DR D1 și D5 a fost reglat semnificativ după ce celulele NK au fost co-incubate cu SNC în comparație cu celulele de control (Fig. 4E). Apoi, antagoniști ai receptorilor DA și D1-like sau D2-like

antagoniștii receptorilor au fost adăugați împreună în sistemul de co-incubare al celulelor NK și al SNC-urilor. În comparație cu adăugarea de DA în monoterapie, nivelul de apoptoză al SNC-urilor a scăzut la adăugarea de DA plus SCH-23300(antagonist al receptorului D1-) (Fig. 4F, G). Între timp, conținutul de cAMP (Fig. 4H) și nivelul de fosforilare al CREB (Fig. 4l, Fig. 2B suplimentară) în celulele NK au fost reglate în jos. Prin contrast, adăugarea de DA plus haloperidol (antagonist al receptorului D2) nu a schimbat semnificativ nivelul de apoptoză al SNC-urilor, conținutul de cAMP și fosforilarea CREB în celulele NK, în comparație cu adăugarea de DA în monoterapie. Aceste rezultate au demonstrat că DA a îmbunătățit activitatea de distrugere a celulelor NK de șoarece împotriva SNC-urilor prin D1-ca Dr.

Ace combinat cu celule NK de șoarece îmbunătățește semnificativ clearance-ul SNC-urilor in vivo

Un studiu anterior a arătat că dopamina scade odată cu vârsta la om [22]. Am măsurat mai întâi nivelul periferic de dopamină la șoareci tineri și bătrâni. Rezultatele au indicat că nivelurile de dopamină în plasmă ale șoarecilor bătrâni au fost mai mici decât cele ale șoarecilor tineri (Fig. 5A). Apoi, eliberarea periferică de dopamină după injectarea intraperitoneală de aceină a fost explorată la șoareci bătrâni. Am descoperit că nivelurile plasmatice de dopamină au crescut semnificativ după o injecție de 10 mg/kg Aceină (Fig.5B, Fig.3 suplimentară). Având în vedere acest lucru, am efectuat celule NK de șoarece combinate cu aceină pentru a trata șoarecii în vârstă. Am detectat starea celulelor NK în sângele periferic al șoarecilor după tratament și am constatat că numărul de celule NK din sângele periferic de perfuzie cu celule NK singure sau celule NK combinate cu Acein a fost semnificativ mai mare decât cel al grupului tratat cu Ace și Grupul PBS, în timp ce numărul de celule NK nu a fost semnificativ diferit între grupul tratat cu celule NK și celulele NK combinate cu grupul tratat cu Acein (Fig. 5C, D).cistanche tubulosa dozaj redditDetectarea ulterioară a nivelului de activare al celulelor NK a arătat că nivelul de expresie al CD69 în celulele NK din sângele periferic din grupul tratat combinat a fost semnificativ suprareglat în comparație cu grupul tratat cu celule NK (Fig.5E). Apoi, am evaluat SNC-urile din țesut. Am descoperit că infuzia de celule NK singură a redus expresia unor markeri senescenți în comparație cu grupul PBS și grupul tratat cu Aceină, în timp ce perfuzia de celule NK combinată cu Aceină a redus semnificativ celulele SA- -gal pozitive (Fig. 5F). ), precum și nivelurile de expresie ale P16 și P21 (Fig. 5G, Fig. suplimentară 4A, B) în țesutul adipos, în comparație cu tratamentul celulelor NK în monoterapie. Numărul de celule Ki67BrdU din țesutul adipos a fost, de asemenea, crescut semnificativ (Fig. 5H), demonstrând în continuare că conținutul de SNC în țesutul adipos a fost mai mic în grupul tratat combinat. Colorarea SA- -gal a secțiunilor de ficat, plămân, rinichi și grăsime a arătat, de asemenea, cel mai scăzut nivel de SNC în grupul tratat combinat (Fig. 5A-D suplimentară). Aceste rezultate au arătat că celulele NK combinate cu terapia cu Aceină au îmbunătățit nivelul de activare al celulelor NK la șoareci și au provocat eliminarea semnificativă a SNC-urilor in vivo.

Ace combinat cu celule NK reduce fenotipurile legate de vârstă la șoarecii în vârstă

Pentru a confirma în continuare fenotipurile legate de vârstă la șoareci, au fost colectate țesuturi hepatice, plămâni, rinichi, grăsimi și ochi pentru a detecta o varietate de markeri senescenți, inclusiv factorii P16, P21 și SASP. Aceste mostre au fost alese deoarece aceste țesuturi sunt mai susceptibile de a suferi senescență odată cu vârsta [31]. În fiecare țesut, numai după perfuzia de celule NK, nivelurile de ARNm ale factorilor P16, P21 și SASP au fost semnificativ mai scăzute decât cele din grupul de control, în timp ce nivelurile markerilor de senescență din ficat, grăsime și țesuturi eve din țesuturile tratate combinate. grupul a fost mai scăzut în comparație cu grupul tratat numai cu infuzie de celule NK (Fig. 6A). În mod similar, am detectat, de asemenea, principalul factor SASP în serul șoarecilor, iar rezultatele au fost în concordanță cu rezultatele din țesuturi (Fig.6B). În plus, am examinat, de asemenea, nivelurile de NAD din ficat și țesutul adipos, care sunt legate de îmbătrânire [32]. Am constatat că infuzia de celule NK singură sau în terapie combinată a crescut semnificativ conținutul de NAD în ficat și țesutul adipos, nivelul de îmbunătățire fiind semnificativ mai mare în grupul de terapie combinată (Fig. 6C). Unii indici biochimici serici, inclusiv ALT, AST, CREA, UA, CHOL și BUN sunt asociați cu nivelurile de îmbătrânire [33]. Am descoperit că numai UA a fost redusă semnificativ în serul șoarecilor din grupul tratat cu combinație, în timp ce ceilalți indici biochimici cheie nu au

MATERIAL ȘI METODE Infuzie de celule NK umane

Infuzia cu celule NK autologe a fost efectuată de Spitalul de Cancer din Shanghai Mengchao (Shanghai, China), iar toate protocoalele au fost aprobate de comitetul lor de etică (Nr.05,2020, Comitetul de Etică Medicală al Spitalului de Cancer Mengchao din Shanghai). Toți voluntarii au furnizat consimțământul informat semnat pentru a obține sânge periferic. Pe scurt, s-au extras 50 ml de sânge periferic de la fiecare individ, după care celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC) au fost izolate și transferate într-un balon T75 cu ExCellerate" Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems, SUA) care conține 1 × Cloudz CD2/NKp46 , IL uman recombinant-2(27ng/mL), L-12 uman recombinant (10 ng/ml), IL-18 uman recombinant (10 ng/ml şi L{{ uman recombinant 13}}(10 ng/mL) (R&D Systems, SUA) timp de 48 de ore și apoi înlocuit cu mediu activat (270 ng/ml IL umană recombinată-2, IL umană recombinată 20 ng/ml-12 , 20 ng/ml IL uman recombinant-18 și 20 ng/ml IL uman recombinant{-21) pentru cultură ulterioară. Densitatea celulelor a fost menținută la 1 x 10 grade celule/ml. În ziua 28 de cultură , un număr mic de celule NK autologe au fost colectate pentru controlul calității și reinjectate intravenos împreună cu celule NK autologe la o densitate de 4,15×10 grade (3.76-5.87×10) celule, cu un timp de perfuzie de 30 min. Procesul experimental s-a desfășurat în acord nce cu Buna Practică Clinică. Intervalul de timp pentru a doua recoltare de sânge a fost de aproximativ 37 (25-57) de zile.

Izolarea celulelor T din sângele periferic uman și a celulelor NK Sânge proaspăt a fost obținut de la voluntari sănătoși, după ce s-a dat consimțământul informat, iar protocolul a fost aprobat de consiliul de evaluare instituțional al Universității Farmaceutice din China (Număr de permis: SYXK2016-0011). Lymphoprep (STEMCELL Technologies, Canada) a fost folosit pentru a izola PBMC-uri umane. Celulele CD3 plus T umane au fost obținute din PBMC utilizând margele magnetice de sortare a celulelor T CD3 umane (Miltenyi Biotec, Germania) în conformitate cu protocolul producătorului. Celulele NK au fost izolate din sângele periferic folosind RosetteSep" Human NK Cell Enrichment Cocktail (STEMCELL Technologies) conform protocolului producătorului

Separarea și extinderea celulelor NK de șoarece in vitro

Celulele NK splenice de șoarece au fost izolate folosind kit-ul de izolare a celulelor NK (Miltenyi Biotec) conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, s-au obținut spline de șoarece, celulele de splină au fost filtrate folosind un filtru de celule de 70 μm și limfocitele de splină au fost obținute prin centrifugare cu gradient de densitate folosind un kit de separare a limfocitelor de splină de șoarece (Solarbio, China). Limfocitele splenice au fost colectate pentru a obține celule NK de înaltă puritate folosind margele magnetice pentru a separa celulele NK de șoarece. Celulele NK splenice izolate au fost cultivate într-un mediu de întreținere RPMI-1640 suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS), 1% L-glutamină, 1% penicilină/streptomicina, 1% mediu esențial minim (MEM) non- aminoacid esențial, acid piruvat de sodiu 1% și mercaptoetanol 50 uM (toate de la Life Technologies, SUA). În plus, s-au adăugat la 200 UI/mL interleukina 2 recombinantă (RL-2) (PeproTech, SUA) și 10 ng/mL I-15(ml{-15) (PeproTech) de șoarece mediu. Apoi au fost colectate celule NK de 10 grade și limfocite splenice iradiate de 10 grade și 5 ml mediu de amplificare (mediu de întreținere suplimentat cu 1000 UI/mL rlL-2, 10ng/mL ml{-15 și 30ng/mL anti -A fost anticorpul NKp46 (PA5-46986, Invitrogen, SUA)).

Fig. 3 SNC-urile activează celulele NK și au fost ucise de celulele NK. Citometria în flux pentru a detecta expresia (A) CD69 și (B) IFN-y a fost efectuată după o co-incubare de 24 de ore cu celule NK de șoarece și preadipocite sau preadipocite induse de iradiere. n =3. Datele sunt prezentate ca medie±SD. Diferențele au fost evaluate prin testul t neparametric nepereche cu două cozi. **P<0.01.c snc="" apoptosis="" was="" detected="" after="" a="" 24-h="" co-incubation="" with="" dir-labeled="" nk="" cells="" by="" flow="" cytometry.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="" test.=""><0.01.d activating="" ligands="" and="" inhibitory="" ligands="" of="" nk="" cells="" on="" preadipocytes,="" doxorubicin-induced="" preadipocytes,="" or="" irradiation-induced="" preadipocytes="" were="" measured="" by="" pcr.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means="" ±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" one-way="" anova="">< 0.05(irradiation="" vs=""><0.05(doxorubicin vs="" con).e="" 1×="" 10°dir-labeled="" control="" preadipocytes="" or="" irradiation-induced="" senescent="" preadipocytes="" were="" implanted="" into="" the="" abdominal="" cavity.="" representative="" images="" showing="" fluorescence="" activity="" in="" mice="" seven="" days="" after="" 5×="" 10°nk="" cell="" treatment.="" quantification="" of="" fluorescence="" activity.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova=""><><0.0001.f quantification="" of="" cytotoxicity="" of="" non-senescent="" and="" senescent="" counterparts="" induced="" by="" irradiation="" or="" adriamycin="" incubated="" with="" increasing="" nk="" cells="" for="" 24="" h.="" n="3.Data" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="">< 0.01,=""><><0.0001. two="" parallel="" samples="" were="" set="" in="" each="" experiment="" and="" three="" independent="" experiments="" were="" performed="" for="" each="" result.="" added="" to="" a="" t25="" flask.="" every="" three="" days,="" 1000="" iu/ml="" rll-2="" was="" added="" and="" a="" fresh="" amplification="" medium="" was="" added="" on="" the="" 9th="" day="" to="" maintain="" the="" cell="" density="" at="" 1×10°cells/ml.="" nk="" cells="" were="" collected="" on="" the="" 20th="" day,="" and="" nk="" cells="" were="" amplified="" 50-fold.="" then="" the="" purity="" of="" the="" nk="" cells="" was="" determined="" by="" flow="">

Extracția preadipocitelor și a celulelor satelite musculare

Preadipocitele au fost extrase așa cum s-a descris anterior [11]. Pe scurt, grăsimea umană sau de șoarece a fost îndepărtată în condiții sterile și tăiată în bucăți de 1-2 mm, spălată de două ori cu PBS și digerată cu colagenază ll (Solarbio) la 37 de grade timp de 1 oră. Apoi celulele au fost filtrate cu un filtru de celule de 100 μm, centrifugate la 300 g timp de 5 minute și colectate. Celulele aderente au fost cultivate în a-MEM suplimentat cu 20% FBS timp de 12 ore și digerate cu tripsină pentru a colecta celulele aderente. Celulele satelite musculare au fost izolate așa cum s-a descris anterior [34]. Mușchiul cvadriceps a fost tăiat în bucăți de 1-2 mm și s-au adăugat 5 ml de colagenază ll pentru digestie la 37 grade C timp de 12 minute. Amestecul a fost amestecat cu o pipetă și s-a adăugat un mediu complet de 5 ml după digestie suplimentară timp de 12 min. Celulele au fost filtrate folosind un filtru de celule de 70 μm și centrifugate la 300 g timp de 5 minute. Apoi celulele au fost

cultivat cu 5 ml de mediu adăugat zilnic timp de 4 zile. Celulele aderente au fost îndepărtate cu o pipetă și centrifugate la 2000 x g timp de 5 minute. După digestia cu tripsină la 37 de grade timp de 5 minute, celulele au fost centrifugate la 2000 x g timp de 5 minute și colectate. Apoi s-au adăugat 5 ml de mediu F-10 Ham suplimentat cu 20% FBS și 4 ng/mL factor bazic de creștere a fibroblastelor (PeproTech).

Citotoxicitatea celulelor NK splenice de șoarece la SNC a fost detectată prin testul lactat dehidrogenazei

SNC-urile au fost induse de 0.2 μM Adriamycin (MedChemExpress, SUA) timp de 24 de ore sau prin cultură continuă timp de 20 de zile după radiație cu raze X de 10 Gy. Apoi 5000 de SNC au fost plasate într-o placă și au fost adăugate celule NK splenice (viabilitatea celulară: 93,5-97,1 la sută) la raporturi efector/țintă de 50:1,25:1,12,5:1, 6,25: 1,3,125:1 și 1,563:1. Supernatanții au fost colectați după co-cultivare la 37 grade C timp de 24 de ore și a fost folosit un kit de detectare a citotoxicității lactat dehidrogenazei (LDH) (Cayman Chemical, SUA). Citotoxicitatea a fost calculată prin următoarea formulă: citotoxicitate (procent)=(experiment de celule țintă-celulă țintă spontană-celulă efectivă spontană)/(celula țintă maximă-celula țintă spontană)× 100.

Imagini live

Soareci C57BL/6 în vârstă de 12 10-săptămâni au fost achiziționați de la Changzhou Cavens Laboratory Animal Co, Ltd. (Jiangsu, China). Apoi martor marcat cu 1 x 10 grade 1,1'-octadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianină (DiR) (Invitrogen)

preadipocitele sau preadipocitele senescente induse de radiații au fost resuspendate în 200 uL soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și injectate în cavitatea abdominală a șoarecilor cu un ac de 22 gauge. După trei zile, celule NK alogene de 5 x 10 grade (viabilitatea celulară: 93,6-96,2 la sută) în 100 uL PBS au fost injectate prin vena cozii. În a 10-a zi, șoarecii au fost anesteziați cu izofluran. Fluorescența a fost detectată utilizând sistemul de imagistică in vivo MS 100 Series (PerkinElmer, MA, SUA).

Citometrie în flux

Pentru a detecta apoptoza SNC-urilor co-incubate cu celule NK splenice marcate cu DiR (viabilitate celulară: 91,8-93,2 procente), SNC-urile de 1 × 10 grade au fost digerate cu precizie la 37 de grade timp de 10 minute și apoi colorate. cu o trusă de colorare pentru apoptoză cu Anexină V și iodură de propidiu (PI) (Multisciences Biotech Co, Ltd., China) conform protocolului producătorului. SNC-urile au fost blocate în poziția DiR-negativă. Pentru a testa activarea celulelor NK, celulele NK de șoarece au fost colectate și colorate cu mNK1.1-alloficocianină (APC) (S17016D) și cu grupul de diferențiere de șoarece 69-R-ficoeritrin-cianină7 (mCD{{{ 17}}PE-Cy7)(H1.2F3)(Biolegend, SUA) la 4 grade timp de 30 min. Apoi celulele au fost procesate cu CytodexCytoperm Plus Kit (BD Biosciences, SUA) și colorate cu interferon de șoarece gama-brilliant violet 421 (mlFNy-BV421) (XMG1.2) la 4 grade timp de 30 min. Colorarea cu Perforin-APC(S16009A) a celulelor NK umane a fost efectuată folosind același protocol ca cel utilizat pentru colorarea extracelulară (CD56-izotiocianat de fluoresceină [FITC](5.1H11), CD{69-PE(FN50) ) și colorarea intracelulară (perforin-APC) (Biolegend).

Pentru a detecta celulele NK din sângele periferic, s-au recoltat 100 uL de sânge anticoagulant. Pentru sângele periferic al șoarecelui, au fost adăugate CD3-FITC, NK1.1-APC și CD69-PE-Cy7. Pentru sângele periferic uman, au fost adăugate CD3-BV421 (OKT3) și CD56-FITC și incubate timp de 20 de minute la temperatura camerei.

Apoi s-au adăugat 400 μL 1 x lizat de eritrocite (BD Biosciences) și s-au incubat timp de 3 minute, urmate de trei spălări cu PBS. Pentru a detecta proliferarea celulară în țesutul adipos, șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu 200 μL de 10 mg/mL bromodeoxiuridină (BrdU) cu 24 și 72 de ore înainte de eutanasie. După eutanasie, depozitele de grăsime inghinale au fost îndepărtate și tăiate în fragmente, digerate la 37 C timp de 30 de minute cu colagenază ll și DNază și filtrate folosind un filtru celular de 100 um. Celulele au fost procesate cu kitul Cytofix/Cytoperm Plus și colorate cu BrdU-FITC (3D4) și Ki67-PE (16A8). Citometria în flux a fost efectuată pe un citometru în flux CytoFLEX. Kit-ul LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific, SUA) a fost folosit pentru a exclude celulele moarte din toate experimentele. Datele au fost analizate folosind software-ul FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR, SUA).

PCR cantitativ cu transcripție inversă

ARN-ul a fost extras utilizând reactiv Trizol și inversat și transcris în ADNc utilizând Kitul de sinteză a ADNcului Hair 1st Strand (Yepsen Biotechnology, China). PCR cantitativă (qPCR) a fost efectuată folosind amestecul de reacție de SYBR Green (Yepsen Biotechnology) pe sistemul ABC QuantStudio 3 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, SUA), cu GAPDH servind ca control intern. Datele au fost analizate folosind metoda 2-△ACt. Lista secvențelor de primer este raportată în Material suplimentar (Tabelul 2-3).

Colorarea cu galactozidază asociată senescenței

Pentru colorarea celulelor, celulele au fost spălate o dată cu PBS, fixate în soluție de -galactozidază (SA- -gal) asociată senescenței (Cell Signaling Technology, SUA) la temperatura camerei timp de 15 minute, spălate de trei ori cu PBS și incubate. peste noapte în soluție de colorare SA- -gal la 37 grade C. Placa a fost sigilată cu parafilm pentru a preveni evaporarea mediului de colorare. Celulele

au fost spălate cu PBS și observate cu un microscop. Pentru colorarea secțiunilor înghețate, secțiunile au fost uscate la 37 de grade timp de 30min și fixate la temperatura camerei în soluție de fixare SA- -gal timp de 15 minute. Secțiunile au fost spălate de trei ori cu PBS și incubate peste noapte în soluție de colorare SA- -gal la 37 grade C. Apoi au fost colorate cu eozină timp de 1 min și clătite cu apă timp de 2 minute. Datele de colorare SA- -gal au fost analizate folosind software-ul Image-Pro Plus 6.0.

Explante de țesut adipos uman

Țesutul adipos de la trei indivizi a fost obținut prin liposucție. Unul dintre subiecți a fost un bărbat, iar doi au fost femei. Vârsta medie a subiecților a fost de 57,0±7,6 ani (media±SD: interval, 50-65). IMC mediu a fost de 40,5±5,1 kg/m²（medie± SD; interval, 36.7-46.2）. Comitetul de etică al Spitalului de Cancer din Shanghai Mengchao (nr.05, 2020, Comitetul de etică medicală al Spitalului de Cancer din Shanghai Mengchao) a aprobat schema experimentală. A fost obținut consimțământul informat pentru toți voluntarii. Țesutul adipos a fost tăiat în bucăți mici cu un diametru de aproximativ 2 mm. Cinci bucăți de țesut au fost plasate în fiecare godeu al unei plăci 96-godeuri și 200 uL fie de preadipocite, fie de mediu condiționat din preadipocite senescente induse de radiații, suplimentat cu 10% ser AB uman, 1% L-glutamină, 1 s-au adăugat la cocultură timp de 24 de ore penicilină/streptomicina, 1% aminoacizi neesențiali MEM și 1% acid piruvat de sodiu. Apoi mediul a fost înlocuit cu un mediu proaspăt care conține celule NK autologe de 5 x 10 grade (viabilitate celulară: 92,3-95,7 la sută 6) și cultivat pentru încă 48 de ore, după care celulele NK au fost colectate pentru citometrie în flux. Țesutul adipos a fost spălat de cinci ori cu PBS și același mediu a fost adăugat pentru o cultură suplimentară timp de 48 de ore; supernatantul (100 uL) a fost utilizat pentru detectarea multifactorială. Preadipocitele sau preadipocitele senescente induse de radiații au fost derivate din țesutul adipos al aceluiași individ.

Acest articol este extras din Cell Death and Disease (2022) 13:305