Comparație a două teste de diagnosticare pentru detectarea anticorpilor de neutralizare a serului împotriva virusului diareei epidemice porcine

Abstract:

Imunitatea lactogenă este importantă pentru protecția purceilor împotriva multor agenți patogeni, inclusiv virusul diareei epidemice porcine. Circularea nivelurilor de anticorpi neutralizanți din serul de scroafe poate ajuta la determinarea dacă un răspuns imun detectabil ar putea conferi protecție purceilor. Anticorpii neutralizanți pot fi detectați prin diferite teste de diagnosticare. Acest studiu a evaluat caracteristicile de diagnostic a două teste de anticorpi neutralizanți pentru anticorpii de neutralizare a virusului diareei epidemice porcine în serul scrofelor provocate. Patru grupuri de tratament, martor, nevaccinat, vaccinat înainte de provocare și vaccinat după provocare, au fost compuse din 20 de scrofe. Probele de ser au fost colectate de la fiecare sturică înainte și după provocarea cu virusul diareei epidemice porcine. Probele au fost evaluate pentru prezența anticorpilor neutralizanți printr-un test de neutralizare cu focar fluorescent și un test de neutralizare cu randament ridicat. Sensibilitatea și specificitatea diagnosticului pentru testele de neutralizare a focarului fluorescent și de neutralizare cu randament mare pentru acest studiu au fost optimizate la o limită a unei diluții de 80 și, respectiv, 80% reducere fluorescentă și au demonstrat acord moderat pe baza statisticii kappa. Testele de neutralizare fluorescentă focalizată și neutralizare cu randament ridicat pot fi utilizate pentru a monitoriza starea anticorpilor de neutralizare în cadrul animalelor sau al unei populații de animale. Testul cu randament mare are avantaje față de testul fluorescent cu focalizare prin faptul că are o specificitate mai mare la limita indicată și natura rezultatelor permite o mai mare discriminare între rezultatele individuale.

beneficii supliment cistanche-crește imunitatea

Cuvinte cheie: PEDV; anticorp neutralizant; test de diagnostic

1. Introducere

Virusul diareei epidemice porcine (PEDV) este un Alphacoronavirus care a devenit endemic în Americi după apariția sa în Statele Unite în 2013 [1–3]. Măsurile de biosecuritate sunt axate pe menținerea agenților patogeni precum PEDV departe de efectivele de porci pentru a atenua impactul bolii [4]. Testarea serologică este un instrument util pentru a determina dacă porcii au fost anterior expuși și infectați cu un agent patogen. Expunerea poate avea loc în mod natural (de exemplu, ingestia de material încărcat cu virus) sau intenționat (de exemplu, amestecarea cu animale de semănat, inoculare oral-nazală sau lavaj gastric). În scopul acestui studiu, expunerea a fost realizată prin provocare intenționată cu un omogenat de țesut PEDV pozitiv dintr-un focar clinic confirmat de PEDV. Song și colab. [5] a demonstrat că titrurile de anticorpi neutralizanți în ser nu diferă între scroafele cărora li s-a administrat un vaccin PEDV DR13 cu celule Vero atenuate oral sau intramuscular. Acest studiu a demonstrat, de asemenea, că scroafele vaccinate oral au avut o mortalitate mai mică a purceilor în comparație cu vaccinarea intramusculară. În plus, de Arriba și colab. [6] a demonstrat o corelație între celulele secretoare de anticorpi IgA și IgG (ASC) din sânge și țesutul limfoid asociat intestinului. Placenta difuză, epiteliocorială a scroafelor împiedică transferul celulelor imune și anticorpilor către purcei în utero, făcând porcii agammaglobulinemici la naștere [7]. Imunitatea maternă este transferată de la scroafe la purceii lor prin secreții mamare și joacă un rol critic în protecția împotriva agenților patogeni enterici precum PEDV, TGEV și rotavirus. Prin urmare, purceii se bazează pe anticorpi din colostru și lapte pentru a se proteja de acești agenți patogeni. Imunoglobulinele serice contribuie semnificativ la colostru, în timp ce imunoglobulinele din lapte sunt produse în glanda mamară [8]. Astfel, testele de neutralizare a anticorpilor pot ajuta la determinarea dacă un răspuns imun detectabil în serurile de scroafă înainte de naștere ar putea conferi protecție purceilor. Mecanismele de neutralizare a anticorpilor includ agregarea, inhibarea intrării virale în celula țintă și inhibarea replicării virale în celula țintă [9]. Au fost dezvoltate teste de diagnosticare pentru a detecta anticorpi neutralizanți pentru PEDV, inclusiv neutralizarea virusului (VN), neutralizarea focarului fluorescent (FFN) și testul de neutralizare cu randament ridicat (HTNT) [2,10-13]. După cum este descris de Sarmento și colab. [2], testul FFN este o îmbunătățire față de testul VN, deoarece testul este mai sensibil, deoarece testul se bazează pe detectarea antigenelor virale exprimate pe suprafața celulelor Vero infectate, în timp ce testul VN se bazează pe efectul citopatic cauzat. de virus. În plus, rezultatele FFN pot fi obținute mai rapid decât rezultatele VN, deoarece efectul citopatic durează mai mult pentru a fi observat în comparație cu atașarea virală cu FFN. Testul HTNT este o îmbunătățire suplimentară a testului FFN, deoarece testul HTNT se bazează mai degrabă pe citometria digitală a imaginii decât pe interpretarea tehnicianului pentru a obține rezultate. Astfel, permițând citirea unei plăci întregi în mai puțin de 3 minute, producând o măsurare cantitativă a intensității fluorescente și posibilitatea de a stoca imagini pentru revizuire. Astfel, HTNT părea a fi potrivit pentru utilizare în efectivele comerciale de porci. Prezentul studiu a comparat caracteristicile de diagnostic (sensibilitate și specificitate) și valorile predictive pozitive și negative ale a două teste de anticorpi neutralizanți pentru testele PEDV, FFN și HTNT. Aceasta se bazează pe munca lui Sarmento et al. [2] prin testarea animalelor naive, infectate și vaccinate pentru a ajuta la validarea testului pentru utilizare într-un laborator de diagnosticare cu randament ridicat. Pe baza rezultatelor lui Sarmento et al. [2], ipoteza noastră nulă este că nu există nicio diferență în caracteristicile de diagnostic ale celor două teste pentru a detecta anticorpi neutralizanți PEDV în serul scrofelor provocate de PEDV.

beneficii supliment cistanche-crește imunitatea

2. Materiale și metode

2.1. Surse și selecție de porci

După cum a fost descris anterior de Brown și colab. [14], acest studiu a folosit 4 grupuri de tratament denumite Control, NV (nevaccinat), Pre (vaccinat înainte de provocare) și Post (vaccinat după provocare). Fiecare grup a fost compus inițial din 20 de slăvițe comerciale, încrucișate. Un total de 60 de scrofe au fost selectate în mod convenabil dintr-o fermă comercială de porci din centrul Iowa, care nu a avut antecedente de PEDV. Cele 20 de scrofe din lotul martor au fost reutilizate pentru grupul NV. Grupul NV a fost format din doar 18 porci, deoarece două scrofe au fost eliminate din studiu din cauza unor complicații care nu au legătură cu provocarea PEDV.

Ca o dovadă suplimentară a stării negative PEDV, s-au recoltat 12 ml de sânge prin puncție venoasă jugulară folosind un 16-gabar, un ac de 1,5-inci și o seringă de 12 ml. Serul a fost recoltat din probe de sânge prin centrifugare la 1.500 x g timp de 8 minute (min), împărțit în părți alicote de 1 ml și depozitat la -80 ◦ C. Probele de ser au fost testate cu un wv-ELISA la Laboratorul de Diagnostic Veterinar al Universității de Stat din Iowa (ISU-VDL, Ames, IA, SUA) [15].

2.2. Alocarea animalelor în grupurile de tratament

Cele șaizeci de scrofe au fost împărțite în mod egal în 3 grupuri, fiecare compus din 20 de femele comerciale, încrucișate. Pentru a forma patru grupuri de tratament, 20 de scrofe au fost utilizate secvenţial pentru două dintre grupurile de tratament, CONTROL şi NV. Reutilizarea celor 20 de scrofe a permis dezvoltarea și controlul unui grup de scrofe pozitive PEDV care au fost expuse la PEDV și a redus numărul total de animale utilizate în studiu. Restul de 40 de scrofe au cuprins grupele PRE și POST, cu câte 20 de scrofe în fiecare grupă. Cronologia evenimentelor în funcție de grupul de tratament este descrisă în Brown și colab. [14]. Pe scurt, probe individuale de sânge au fost colectate o dată pe săptămână în fiecare grup de tratament în urma provocării. Elaborarea ulterioară este discutată în Secțiunile 2.4 și 2.5. Purcelele din grupul de tratament „PRE” au fost vaccinate înainte de sosirea la unitatea din afara amplasamentului. Purcelele din grupul de tratament „POST” nu au fost vaccinate decât după provocare.

2.3. Adăpostirea și îngrijirea porcinelor

La sosirea la unitatea de cercetare, scelele au fost găzduite în grup de un grup de tratament: toate cele 20 de scrofe dintr-un grup de tratament au fost într-un singur țar cu hrană ad libitum și apă. Toate pixurile erau în aceeași cameră. Un stilou injector a fost lăsat gol între grupurile NV PRE și POST pentru a minimiza contaminarea. Furajele, apa, valorile ridicate și scăzute ale temperaturii camerei și valorile ridicate și scăzute ale umidității au fost monitorizate pentru a asigura coerența cu standardele de producție. Observațiile de sănătate au fost efectuate și înregistrate o dată pe zi pentru a evalua ambulația, letargia, consistența fecalelor și alte semne clinice ale bolii. O crotalie pentru ureche (Integra Hog, Allflex, Dallas, TX, SUA) a fost plasată în urechea dreaptă a fiecărei spărturi pentru identificarea individuală a animalului.

2.4. Provocare orală

După o perioadă de aclimatizare de 4-zi, fiecare sturică din CONTROL a fost expusă oral la PEDV utilizând un omogenat de țesut colectat dintr-un focar clinic confirmat de PEDV într-o fermă comercială. Omogenatul a fost secvențiat de Laboratorul de Diagnostic Veterinar al Universității de Stat din Iowa și s-a dovedit a fi tulpina prototip din SUA, genogrupul G2b. Zece mililitri de omogenat au fost amestecați cu 590 mL de soluție salină tamponată cu fosfat și 30 mL de amestec au fost administrați ironic la fiecare sturică. Inoculul a fost confirmat pozitiv PEDV prin reacția în lanț a polimerazei cu transcriptază inversă în timp real, cu o valoare CT de 19,6 și 14,23 × 107 copii genomice per ml și dezvoltarea diareei la scrofe după provocare. Au fost colectate probe individuale de sânge la fiecare 7 zile după provocare prin puncție venoasă jugulară, așa cum este descris mai sus, până în ziua 42 după provocare. Serul a fost recoltat și depozitat așa cum s-a descris mai sus și probele au fost trimise la ISU VDL pentru detectarea anticorpilor neutralizanți printr-un test de neutralizare fluorescentă focalizată și un test de neutralizare a virusului cu randament ridicat. În ziua 60 de la provocarea inițială a CONTROL, restul de 40 de scrofe au fost aduse la unitatea de cercetare și 18 dintre stropile CONTROL au devenit NV. Două scrofe au fost eliminate din CONTROL din cauza unor condiții care nu au legătură cu studiul. După o perioadă de aclimatizare de 3-zi după sosire, 18 scrofe au fost reprovocate (NV) și 40 scrofe (PRE și POST) au fost provocate, s-au recoltat probe de sânge, s-au recoltat ser și au fost trimise probe pentru testare, așa cum este descris aici .

2.5. Vaccinarea puricilor

Patruzeci de scrofe au rămas la ferma de origine și au fost aduse la unitatea de cercetare la 8,5 săptămâni după sosirea CONTROL. Douăzeci de scrofe au fost vaccinate cu 5 și 2 săptămâni înainte de provocare, așa cum a recomandat compania care produce vaccinul, cu un vaccin anti-PEDV ucis disponibil comercial, genogrupul G2b, (vaccin împotriva diareei epidemice porcine, Zoetis, Inc., Florham Park, NJ). , SUA) cuprinzând grupul PRE. Restul de douăzeci au fost vaccinați cu același vaccin, la 1 și 3 săptămâni după provocarea PEDV care cuprinde grupul POST. Optsprezece dintre cele douăzeci de scrofe CONTROL originale au rămas în studiu și au cuprins grupul NV și nu au primit vaccinarea pentru PEDV

cistanche plant-creșterea sistemului imunitar

2.6. Teste de neutralizare a anticorpilor

2.6.1. Procedura de neutralizare a focalizării fluorescente (FFN).

FFN a fost efectuat de către Laboratorul de Diagnostic Veterinar al Universității de Stat din Iowa, procedura standard de operare 9.5324 [16]. Pe scurt, celulele Vero 76 au fost preparate prin clătire și incubare cu tripsină-acid etilendiaminotetraacetic (EDTA) timp de 5 minute la 37 ◦C. S-a făcut o diluție de 1:20 a celulelor și a mediului de propagare celulară și s-au adăugat 200 uL în fiecare godeu al unei plăci de godeuri 96-și incubat timp de 48 de ore. Plăcile au fost aruncate și clătite cu mediu de inoculare cu virus. Probele de ser au fost inactivate la căldură într-o baie de apă la 56 ◦C timp de 30 de minute și apoi diluate într-o diluție în serie de 2-ori, începând cu 1:10 în placă. Virusul stoc a fost diluat la 100-200 de unități formând focare per 100 µL și 100 µL adăugate în fiecare godeu și incubate timp de 60 de minute la 37 °C cu 5% dioxid de carbon (CO2). Placa de testare a fost aruncată, clătită și s-au adăugat 150 uL de amestec ser/virus în godeurile corespunzătoare și incubate timp de 60 de minute la 37 °C. Amestecuri de ser/virus au fost aruncate şi godeurile au fost spălate cu mediu de inoculare cu virus. S-au adăugat 150 µL de mediu de inoculare virală în fiecare godeu și s-au incubat timp de 24 de ore la 37 °C și 5% CO2. Mediul a fost îndepărtat de pe placă și celulele au fost fixate prin adăugarea de 80% acetonă, care a fost răcită într-o baie de gheață, timp de 15 min. Acetona a fost aruncată și placa a fost uscată la aer. S-a preparat o diluție 1:100 de anticorp monoclonal PEDV NP conjugat cu FITC diluat în PBS (pH 7,2) și s-au adăugat 50 uL în toate godeurile și s-au incubat la 37 °C timp de 60 de minute. Placa a fost spălată cu PBS și apoi citită folosind un microscop cu fluorescență (Olympus BX51, obiectiv 10X, filtru FITC). Godeurile pozitive nu prezintă plăci fluorescente, iar cele negative prezintă plăci verzi. Titrurile de anticorpi neutralizanți au fost exprimate ca cea mai mare diluție a serului, cu o reducere de 90% a replicării virusului în comparație cu controlul virusului. Probele cu un titru mai mare sau egal cu 20 au fost clasificate drept pozitive pentru anticorpii de neutralizare a PEDV. Un titru mai mare indică o concentrație mai mare de anticorpi neutralizanți în probă. Un exemplu de probe de ser pozitive și negative sunt disponibile în materialele suplimentare.

2.6.2. Procedura testului de neutralizare fluorescentă de mare capacitate (HTNT).

HTNT a fost efectuat de Laboratorul de Diagnostic Veterinar al Universității de Stat din Iowa, procedura standard de operare 9.5324 Versiunea 2 [17]. Probele de ser au fost inactivate la căldură într-o baie de apă la 56 ◦ C timp de 30 de minute. Stocul de virus a fost diluat în serie de 10-ori în mediu de inoculare virală (DMEM cu 2 µg/mL Tripsină-TPCK), transferat în celule Vero 81 (ATTC® CCL-81™) și incubat la 37 ◦C cu 5% CO2 timp de 5 zile. Ultima diluție în care s-a observat efectul citopatic a fost utilizată pentru a determina doza medie infecțioasă a culturii de țesut (TCID50) folosind metoda Spearman și Karber [18]. O sută de microlitri de soluție celulară (Cell propagation Medium, Trypsin-EDTA și celule Vero 81) au fost diluate cu 100 µL de mediu de propagare celulară (DMEM cu 10% FBS și 1% penicilină-streptomicină) pentru a face o diluție 1:1 . Un hemocitometru a fost folosit pentru a număra și a calcula diluția pentru a obține 5 × 104 celule/godeu și s-a adăugat la fiecare godeu dintr-o placă 96-de fund neagră transparent (microplacă CellBind cu 96 de godeuri Coring, Sigma) și s-a incubat timp de 48 de ore la 37 ◦C cu 5% CO2 pentru a face celulele confluente (100% confluente). Fiecare placă a avut godeuri de control pozitiv, control negativ și control al virusului. Apoi, cinci microlitri de controale și probe inactivate la căldură au fost plasați în godeuri duplicat pentru a face o diluție de 1:40 la primul 1:20 prin adăugarea a 95 µL de mediu de inoculare virală, apoi 100 µL de virus PEDV diluat 1:10 (3,16 × 105). TCID50/ml). Amestecul ser/virus a fost incubat timp de 1 oră la 37 °C cu 5% CO2. Toate godeurile de celule ale plăcii de testare au fost spălate de 3 ori cu 150 ui de mediu de spălare a celulelor (DMEM cu 1% penicilină-streptomicina) și 150 ui de amestec ser/virus și martori de virus au fost transferate pe placa de testare și incubate timp de 90 de minute. la 37 ◦C. Amestecul de ser/virus a fost aruncat și plăcile au fost spălate o dată cu un mediu de spălare a celulelor, așa cum s-a descris mai sus, urmat o dată cu un mediu de inoculare cu virus. Mediul de inoculare virală (150 µL) a fost adăugat în fiecare godeu și incubat timp de 24 de ore la 37 °C cu 5% CO2. Mediul de inoculare a virusului a fost aruncat şi placa a fost spălată cu PBS pH 7,4. Celulele au fost fixate prin adăugarea de 4 °C, 80% acetonă în fiecare godeu și incubate la temperatura camerei timp de 15 minute. Acetona a fost apoi îndepărtată și placa a fost uscată la aer timp de 30 de minute. Fiecare godeu a fost clătit cu PBS pH 7,4. La fiecare godeu s-au adăugat 50 uL de anticorp monoclonal PEDV NP conjugat cu FITC (clonă SD6-29, Medgene Labs) diluat 1:100 în PBS pH 7,4 și incubat timp de 60 de minute la 37 °C. Placa a fost spălată de patru ori cu PBS pH 7,4, lăsând ultima spălare în placă timp de 5 minute, apoi aruncată și înlocuită cu 100 uL de PBS pH 7,4. Plăcile au fost apoi citite cu SpectraMax i3× utilizând SoftMax Pro 6.5 (Molecular Devices, San Jose, CA, SUA) utilizând un timp de expunere de 30 ms și ajustări focale de 20 um pentru 541 lungimi de undă. Probele cu o reducere totală a fluorescenței (%FR) mai mare sau egală cu 85% au fost clasificate drept pozitive pentru anticorpi neutralizanți [2]. Reducerea fluorescenței totale a fost calculată ca 100 - ([Intensitatea totală a fluorescenței probă medie/Intensitatea fluorescenței totale a controlului negativ mediu]) × 100). O reducere mai mare a fluorescenței totale indică concentrații mai mari de anticorpi neutralizanți în probe. Un exemplu de probe de ser pozitive și negative sunt disponibile în materialele suplimentare.

2.7. Caracteristici de diagnostic: sensibilitate și specificitate și valori predictive pozitive și negative

Sensibilitatea și specificitatea diagnosticului au fost calculate pentru HTNT utilizând o limită %FR de 70, 75, 80, 85 și 90 și FFN folosind limitele de diluție a probei de 20, 40, 80 și 160 pentru a determina limita optimizată. Optimizat a fost definit ca limită în care specificitatea diagnosticului este maximizată cu pierderea minimă a specificității diagnosticului. Un subset de șaptezeci și șase de eșantioane PEDV-negative cunoscute au fost selectate din primele două puncte de eșantionare pentru grupurile CONTROL și POST. 36 de probe cunoscute pozitive PEDV au fost selectate din ultimele două puncte de eșantionare pentru grupul NV. O limită mai mare de 85 a fost utilizată pentru a defini probele pozitive, în congruență cu procedura de operare standard ISU VDL pentru test [17]. Sensibilitatea diagnosticului a fost estimată prin împărțirea numărului de probe pozitive cunoscute care au fost testate pozitiv la totalul eșantioanelor pozitive cunoscute. Specificitatea diagnosticului a fost estimată prin împărțirea numărului de probe negative cunoscute care au fost testate negative la numărul de probe negative cunoscute. Limita care a optimizat specificitatea și sensibilitatea diagnosticului a fost selectată pentru compararea testelor. În scopul acestui studiu, specificitatea de diagnostic (DSp) și sensibilitatea (DSe) au fost maximizate, unde valoarea absolută a diferenței dintre valorile de sensibilitate și specificitate este cea mai mică. Valoarea predictivă pozitivă (PPV) a fost estimată prin împărțirea numărului de eșantioane pozitive cunoscute care au fost testate pozitive (TP) la totalul probelor test pozitive (TP plus fals pozitiv [FP]). Valoarea predictivă negativă (NPV) a fost estimată prin împărțirea numărului de eșantioane negative cunoscute (TN) care au fost testate negative la totalul eșantioanelor test negative (TN plus fals negativ [FN]).

cistanche tubulosa-imbunatateste sistemul imunitar

Faceți clic aici pentru a vedea produsele Cistanche Enhance Immunity

【Cereți mai multe】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.8. Analize statistice

Nu au existat rezultate nedeterminate sau date lipsă în acest studiu. Toate datele au fost analizate folosind SAS Versiunea 9.4 (SAS Instit. Cary NC). Au fost utilizate 609 observații de la 6{{10}} porci aparținând unuia din cele 4 loturi. Au fost luate în considerare două valori limită posibile (40 și 80) pentru testul FFN și au fost comparate cu o valoare limită de 85 pentru HTNT. Pentru fiecare, un model liniar cu efecte mixte a fost potrivit pentru a explica efectul grupului asupra acordului testelor FFN și HTNT, cu un efect aleator specific porcului. Au fost efectuate toate analizele de comparație pe perechi ale grupurilor. În plus, pentru două dintre cele trei valori limită utilizate pentru testul FFN, a fost calculat coeficientul Kappa al lui Cohen pentru a determina acordul global al testelor FFN și HTNT. Coeficienții Kappa au fost interpretați după cum urmează: mai puțin de 0.0, acord „slab”; între 0.0 și 0.20, acord „ușor”; între 0.21 și {{30}}.40, acord „echitabil”; între 0,41 și 0,60, acord „moderat”; între 0,61 și 0,80, acord „substanțial”; iar între 0,81 și 1,0, acord „aproape perfect” [19]. Semnificația a fost stabilită la p Mai mică sau egală cu 0,05. Diagramele de tip box și whisker au fost dezvoltate utilizând software-ul R.

3. Rezultate

Tabelul 1 prezintă sensibilitatea și specificitatea diagnosticului pentru testele FFN și HTNT la limitele selectate. Sensibilitatea și specificitatea diagnosticului pentru cele două teste pentru acest studiu au fost optimizate la o limită a unei diluții de 80 și, respectiv, 80% FR.

Tabelul 1. Sensibilitatea diagnostică (DSe), Specificitatea diagnostică (DSp), Valoarea predictivă pozitivă (PPV) și Valoarea predictivă negativă (NPV) pentru testele HTNT și FFN folosind diferite limite enumerate în al doilea rând al tabelului. De exemplu, pentru testul HTNT la o limită de 70, DSe=0,97 (97%), DSP=0,91 (91%), PPV=0,83 ( 83%), iar VAN=0,95 (95%). U=nedefinit.

Figura 1 afișează diagrame cu casete și mustăți ale rezultatelor HTNT în funcție de zilele post-provocare, în funcție de grupul de tratament de studiu. Probele din grupurile CONTROL și POST (n=76) au fost clasificate ca negative în zilele -4, 0 și 7 așa cum era de așteptat din cauza stării anterioare a porcilor. Grupul NV a dezvoltat un răspuns anamnestic în urma provocării. Scăderea variabilității a avut loc printre rezultatele HTNT, așa cum se arată printr-o scădere a intervalului de valori în ambele grupuri vaccinate (PRE și POST) în urma provocării cu PEDV. Această variație scăzută poate fi observată în Figura 1, deoarece mustații și valorile aberante ale diagramelor POST și PRE devin mai scurte la 14 zile după provocare. Figura 2 afișează diagrame cu casete și mustăți ale rezultatelor FFN transformate în log natural în zilele post-provocare pe grupul de tratament, care au rezultate similare cu testul HTNT. Atât rezultatele HTNT (Figura 1) cât și FFN (Figura 2) arată un răspuns la provocare și vaccinare, așa cum s-a observat cu o creștere a %FR și a titrurilor din ambele teste. Deși este similară ca mărime, variația rezultatelor fiecărui test a fost redusă în urma provocării omoloage (NV). Scăderea variației a apărut și în urma vaccinării (PRE și POST). Această variație a valorilor anticorpilor neutralizanți în funcție de săptămâna post-expunere scade în urma vaccinării și provocării omoloage cu PEDV (Figurile 1 și 2). A existat o tendință similară în scăderea variației anticorpilor neutralizanți observată în rezultatele ambelor teste ale grupurilor de tratament provocate vaccinate și omoloage. Provocarea omoloagă a PEDV și a doua vaccinări a produs un răspuns anamnestic generând un nivel mai ridicat de anticorpi neutralizanți cu o variație redusă între porci în comparație cu valorile pre-provocare și post-vaccinare, măsurate prin ambele teste (Figura 1). Pe baza analizei sensibilității și specificității diagnosticului, limitele de 80 (titru) și 85 (%FR) au fost selectate pentru a analiza acordul testului pentru testele FFN și, respectiv, HTNT. Testul kappa a demonstrat o concordanță „moderată” de 0.5257 cu un interval de încredere de 95% de 0.461, 0,5904 din testele pentru limita 80 (titru) și 85 (%FR) pentru Testele FFN și HTNT.

Figura 1. Diagrame box-and-whisker ale curbelor de răspuns la anticorpi HTNT în zilele post-provocare pentru fiecare grup de tratament. Bara din mijloc reprezintă valoarea mediană a rezultatelor pe săptămână. Balamalele (sus și jos ale cutiei) reprezintă prima (Q1) și a treia (Q3) quartile. Regiunea umbrită reprezintă intervalul intercuartil (IQR). Mustatile sunt determinate dupa cum urmeaza: mustata de sus=Q3 + 1.5∗IQR; Mustată de jos=Q1 + 1.5∗IQR. Dacă niciun punct de date nu se află la valoarea calculată, următorul punct de date cel mai apropiat de Q1 sau Q3 este limita mustații. Cercurile deschise (◦) indică valori aberante. O tăietură de 85 este notă cu linia întreruptă la 85 pe axa y.

Figura 2. Diagrame box-and-whisker ale curbelor de răspuns la anticorpi FFN în zilele post-provocare pentru fiecare grup de tratament. Bara din mijloc reprezintă valoarea mediană a rezultatelor pe săptămână. Balamalele (sus și jos ale cutiei) reprezintă prima (Q1) și a treia (Q3) quartile. Regiunea umbrită reprezintă intervalul intercuartil (IQR). Mustatile sunt determinate dupa cum urmeaza: mustata de sus=Q3 + 1.5∗IQR; Mustată de jos=Q1 + 1.5∗IQR. Dacă niciun punct de date nu se află la valoarea calculată, următorul punct de date cel mai apropiat de Q1 sau Q3 este limita mustații. Cercurile deschise (◦) indică valori aberante. O tăietură de 40 este notă cu linia întreruptă la ln(40) pe axa y.

4. Discutie

Emitem ipoteza că o variație redusă și un răspuns anamnestic sunt asociate cu imunitatea omogenă a turmei și cu protecția împotriva bolii, chiar dacă semnele clinice au fost încă observate în grupul PRE așa cum a fost descris anterior [14]. Impactul clinic și severitatea bolii la aceste animale nu au fost evaluate în scopul acestui studiu. Boala se manifestă diferit între adulți și nou-născuți cu semne clinice mai severe și deces la nou-născuți comparativ cu animalele adulte [1,20]. Deși nivelurile de anticorpi neutralizanți circulanți singure nu conferă protecție [21], ele pot fi utilizate pentru a evalua un răspuns de anticorpi după expunerea intenționată sau administrarea vaccinării în efective. În timp ce absența viremiei este caracteristică PEDV, viremia a fost raportată la purceii cu vârsta de până la 4 săptămâni [22,23]. Astfel, anticorpii neutralizanți circulanți pot influența evoluția clinică a bolii [21]. Cu toate acestea, imunitatea lactogenă, în special IgA în secrețiile mamare, ar fi o măsură mai precisă a protecției purceilor [21]. Testele descrise în acest studiu ar putea fi utilizate pentru a monitoriza anticorpii de neutralizare a serului după administrarea vaccinării la grupuri de scroafe sau scroafe, în plus față de colectarea secrețiilor mamare pentru a testa IgA lactogenă/secretoare. Ar fi benefic dacă datele generate din aceste teste ar putea prezice cantitatea și stabilitatea imunității lactogene produse în urma vaccinării. Cu toate acestea, acest lucru nu a fost analizat în studiul de față. Răspunsurile serice ale anticorpilor IgG după vaccinare s-au dovedit a fi predictive pentru răspunsul IgG colostral, dar nu a existat o corelație între anticorpii de neutralizare a serului și cei ai secrețiilor mamare [15]. Deși nu a existat o corelație între anticorpii de neutralizare a serului și cei ai secrețiilor mamare, animalele vaccinate s-au dovedit a avea anticorpi neutralizanți mai mari în secrețiile mamare comparativ cu animalele martor [15]. Prin urmare, după cum este susținut de, Bjustrom-Kraft, și colab. [15], dacă anticorpii de neutralizare a serului sunt mari, atunci IgG și IgA din secrețiile mamare pot fi, de asemenea, crescute. Astfel, colectarea probelor de ser înainte de deplasarea femelelor la casa de naștere ar minimiza stresul și durerea induse în timpul colectării periparturiente a sângelui și a secrețiilor mamare care pot avea un impact negativ asupra scroafei și a litierului [24]. Este important ca utilizatorii să înțeleagă modul în care valoarea limită poate afecta sensibilitatea de diagnosticare și specificitatea unui test. Creșterea valorii limită va scădea numărul de rezultate fals pozitive și va crește numărul de rezultate fals negative. În mod invers, scăderea valorii limită va crește numărul de rezultate fals pozitive și va scădea numărul de rezultate fals negative. Această cunoaștere permite unui utilizator să aleagă ce valoare limită să folosească pentru situația sa specifică. Pentru acest studiu, pe baza rezultatelor acestui studiu și a rezultatelor anterioare publicate de Sarmento et al. [2], am ales 80% FR pentru HTNT și o diluție de 80 FFN. La aceste limite, specificitatea diagnosticului este mai mare pentru HTNT (97%) comparativ cu FFN (76%) și oferă o valoare predictivă pozitivă mai mare din HTNT comparativ cu FFN. De asemenea, trebuie înțeles că valorile predictive sunt dependente de prevalența bolii [25,26]. În acest studiu, pe baza eșantioanelor clasificate, prevalența a fost de 32,1% (36 probe pozitive și 76 probe negative). Pe măsură ce prevalența crește, PPV ar crește, de asemenea, deoarece animalul (eșantionul) testat este mai probabil să fie pozitiv; pe măsură ce prevalența scade, VAN ar scădea. Figurile 3A și B ilustrează acest lucru pentru testele HTNT și FFN la diferitele limite evaluate în acest studiu urmând metodele descrise de Erb [25]. Prin urmare, atunci când se iau în considerare rezultatele diagnosticului, ar trebui să se ia în considerare sensibilitatea diagnostică și specificitatea testului și să se înțeleagă prevalența în cadrul grupului dacă se utilizează valori predictive.

Figura 3. (A). Valori predictive pozitive pentru testele HTNT (linii negre) și FFN (linii gri) la diferite limite. O limită de 90 nu este reprezentată pentru HTNT. (B). Valori predictive negative sau testele HTNT (linii negre) și FFN (linii gri) la diferite limite. O limită de 20 nu este reprezentată pentru testul FFN.

HTNT are o sensibilitate și o specificitate diagnostic superioară în comparație cu FFN. Când se analizează rezultatele anticorpilor, acest lucru este ideal pentru a minimiza numărul de rezultate fals pozitive și fals negative. De exemplu, când se folosește o limită de 80 pentru FFN, am observat o sensibilitate de 97% și o specificitate de 76%. Aceasta înseamnă că ar exista puține rezultate fals negative, dar ar exista un număr mare de fals pozitive. Dacă rezultatele sunt clasificate în mod fals drept pozitive, atunci acest lucru poate duce la o interpretare greșită că o turmă are anticorpi împotriva PEDV, când de fapt nu au. Deoarece HTNT are diagnostic și specificități mai mari în diferite limite, este testul preferat pentru detectarea anticorpilor PEDV. Rezultatele de la Sarmento et al. [2] au arătat specificități de diagnostic mult mai mari pentru FFN și sensibilități și specificități comparabile pentru HTNT. Aceste teste de diagnostic au arătat acord moderat conform statisticii kappa (κ). Un punct slab al lui κ este că un test trebuie considerat standardul de aur. Când se compară două teste imperfecte, acest lucru poate denatura interpretarea lui κ. Pentru acest studiu, am evaluat performanța de diagnosticare a testelor împreună cu κ pentru a determina că testul este de acord, dar poate avea o utilitate diferită. Un avantaj suplimentar al HTNT față de testul FFN este că rezultatele HTNT sunt calculate din date continue în comparație cu valorile categorice (titrari) din FFN. Natura continuă a datelor HTNT permite o mai mare discriminare a rezultatelor probei pentru a descrie starea anticorpilor neutralizanți la scroafe. După cum au raportat Sarmento și colab. [2], HTNT are un timp de citire mai scurt al unei plăci cu 96 de godeuri la mai puțin de 4 minute, permițând o schimbare mai rapidă a rezultatelor. Anticorpii sistemici circulanți pot contribui la protecția purceilor împotriva infecțiilor cu PEDV [21]. Cu toate acestea, nu există literatură privind cantitatea de anticorp neutralizant circulant din scroafă care ar conferi purceilor protecție PEDV. Nivelurile ridicate de anticorpi circulanți conduc la concentrații mai mari în colostru și oferă o protecție sporită. O evaluare ulterioară este justificată pentru a determina o asociere între, când în timpul gestației pentru a colecta probe, și protecția anticorpilor colostrali împotriva infecției cu PEDV. Imunitatea lactogenă și a mucoasei este de o importanță vitală pentru supraviețuirea porcilor expuși la PEDV. Anticorpii se colectează în lapte prin intermediul axei intestin-MG-sIGA și sunt trecuți purceilor pentru a conferi protecție. Langel și colab. [27] a constatat că scrocelele expuse în timpul celui de-al doilea trimestru au avut niveluri semnificativ mai mari de IgA, IgG circulanți și anticorpi neutralizanți, comparativ cu scrocelele din primul și al treilea trimestru. În plus, Langel și colab. [27] au descoperit că purceii de purcei expuși la PEDV în al doilea trimestru au avut o rată de supraviețuire de 100%, comparativ cu mai puțin de 87,2% în alte trimestre, ceea ce sugerează că IgA, IgG și anticorpi neutralizanți în ser sunt asociate cu supraviețuirea purceilor în fața PEDV. Deși anticorpii serici nu conferă protecție pentru PEDV, rezultatele studiului nostru sugerează că nivelurile de anticorpi de neutralizare a serului sunt asociate cu protecția împotriva infecției cu PEDV. După cum au raportat anterior de către Brown și colab. [14], PEDV este vărsat în materiile fecale în urma provocării omoloage și a vaccinării puricelor. Prezentul studiu a folosit mostre de la aceleași animale ca Brown și colab. [14]. arată în continuare că creșterea anticorpilor de neutralizare a serului în urma expunerii la provocare sau a vaccinării nu influențează modelul de eliminare a virusului, deoarece nivelurile de anticorpi au crescut în urma provocării și vaccinării. Sunt necesare studii ulterioare pentru a confirma dacă cantitatea de virus revărsat în fecale este asociată cu cantitatea de anticorp neutralizant care este prezent în ser [21].

cistanche beneficii pentru bărbați-întărește sistemul imunitar

5. Concluzii

Ipoteza nulă a acestui studiu a fost că nu a existat nicio diferență în caracteristicile de diagnostic a două teste de anticorpi de neutralizare a PEDV, FFN și HTNT. Rezultatele arată că aceste teste sunt moderat de acord pe baza statisticii kappa, în timp ce există variații în caracteristicile lor de diagnostic și valorile predictive pe baza limitei pentru test. Aceste teste ar putea fi utilizate pentru a măsura răspunsul la vaccinare al unui efectiv. Eșecul de a respinge ipoteza nulă arată că HTNT este testul preferat pentru detectarea anticorpilor de neutralizare a PEDV în ser. În urma vaccinării atât în ​​grupurile PRE, cât și în cele POST, acest studiu a constatat că majoritatea rezultatelor sunt pozitive. În grupul PRE, variația scăzută între rezultate a urmat, de asemenea, provocării. Aceste rezultate sugerează că practicienii de porci ar putea măsura anticorpii de neutralizare a serului pentru a determina dacă vaccinurile PEDV sunt administrate corect în turmă.

Referințe

1. Saif, L.; Wang, Q.; Vlasova, A.; Jung, K.; Xiao, S. Coronavirus. În Diseases of Swine, ed. a 11-a; Zimmerman, JJ, Ed.; Wiley Blackwell: Hoboken, NJ, SUA, 2019.

2. Sarmento, LV; Poonsuk, K.; Tian, ​​L.; Mora-Diaz, JC; Principal, RG; Baum, DH; Zimmerman, JJ; Gimenez-Lirola, LG Detectarea anticorpilor de neutralizare a virusului diareei epidemice porcine folosind citometrie imagistică de mare performanță. J. Vet. Diag. Investig. 2020, 32, 324–328. [CrossRef]

3. Stevenson, GW; Hoang, H.; Schwartz, KJ; Burrough, ER; Soare, D.; Madson, D.; Cooper, VL; Pillatzki, A.; Gauger, P.; Schmitt, BJ; et al. Apariția virusului diareei epidemice porcine în Statele Unite: semne clinice, leziuni și secvențe genomice virale. J. Vet. Diag. Investig. 2013, 25, 649–654. [CrossRef]

4. Kim, Y.; Yang, M.; Goyal, SM; Cheeran, MC; Torremorell, M. Evaluarea măsurilor de biosecuritate pentru prevenirea transmiterii indirecte a virusului diareei epidemice porcine. BMC Vet. Res. 2017, 13, 89. [CrossRef]

5. Song, DS; Oh, JS; Kang, BK; Yang, JS; Luna, HJ; Yoo, HS; Jang, YS; Park, BK Eficacitatea orală a tulpinii DR13 a virusului diareei epidemice porcine atenuate cu celule Vero. Res. Veterinar. Sci. 2007, 82, 134–140. [CrossRef] [PubMed]

6. de Arriba, ML; Carvajal, A.; Pozo, J.; Rubio, P. Răspunsurile și protecția anticorpilor specifici pentru izotipul mucoasei și sistemici la porcii convenționali expuși la virusul diareei epidemice porcine virulente sau atenuate. Veterinar. Imunol. Imunopatol. 2002, 85, 85–97. [CrossRef] [PubMed]

7. Furukawa, S.; Kuroda, Y.; Sugiyama, A. O comparație a structurii histologice a placentei la animalele de experiment. J. Toxicol. Pathol. 2014, 27, 11–18. [CrossRef] [PubMed]

8. Bourne, FJ; Curtis, J. Transferul imunoglobinelor IgG, IgA și IgM din ser în colostru și lapte la scroafă. Imunologie 1973, 24, 157–162. [PubMed]

9. Parren, PW; Burton, DR Activitatea antivirală a anticorpilor in vitro și in vivo. Adv. Imunol. 2001, 77, 195–262. [CrossRef]

10. Bjustrom-Kraft, J.; Woodard, K.; Gimenez-Lirola, L.; Rotolo, M.; Wang, C.; Soare, Y.; Lasley, P.; Zhang, J.; Baum, D.; Gauger, P.; et al. Detectarea virusului diareei epidemice porcine (PEDV) și răspunsul anticorpilor la porcii în creștere comercială. BMC Vet. Res. 2016, 12, 99. [CrossRef]

11. Oh, JS; Song, DS; Yang, JS; Song, JY; Luna, HJ; Kim, TY; Park, BK Comparația unui test imunosorbant legat de enzime cu testul de neutralizare a serului pentru serodiagnosticul infecției cu virusul diareei epidemice porcine. J. Vet. Sci. 2005, 6, 349–352. [CrossRef]

12. Okda, F.; Liu, X.; Singrey, A.; Clement, T.; Nelson, J.; Christopher-Hennings, J.; Nelson, EA; Lawson, S. Dezvoltarea unui ELISA indirect, ELISA de blocare, imunotest cu microsfere fluorescente și test de neutralizare a focarului fluorescent pentru evaluarea serologică a expunerii la tulpinile nord-americane de virusul diareei epidemice porcine. BMC Vet. Res. 2015, 11, 180. [CrossRef] [PubMed]

13. Chen, Q.; Li, G.; Stasko, J.; Thomas, JT; Stensland, WR; Pillatzki, AE; Gauger, PC; Schwartz, KJ; Madson, D.; Yoon, KJ; et al. Izolarea și caracterizarea virusurilor diareei epidemice porcine asociate cu focarul bolii din 2013 în rândul porcilor din Statele Unite. J. Clin. Microbiol. 2014, 52, 234–243. [CrossRef]

14. Brown, J.; Rademacher, C.; Baker, S. Eficacitatea unui vaccin comercial cu virusul diareei epidemice porcine la reducerea duratei excreției virale la scrofe. JSHAP 2019, 27, 256–264.

15. Bjustrom-Kraft, J.; Woodard, K.; Giménez-Lirola, L. Răspunsuri cu anticorpi de secreție și secreție mamară la diareea epidemică porcină - scrofe imune după vaccinarea împotriva diareei epidemice porcine. JSHAP 2018, 26, 34–40.

16. Universitatea de Stat din Iowa. Procedura pentru testul de neutralizare a focarului fluorescent (FFN) cu virusul diareei epidemice porcine (PEDV). Serologie 2017, 1–7.

17. Universitatea de Stat din Iowa. Procedura pentru testul de neutralizare a virusului cu randament ridicat (HTNT) cu virusul diareei epidemice porcine (PEDV). Serologie 2017, 1–16.

18. Hierholzer, JC; Killington, RA; Kangro, HO; Mahy, BWJ Manualul metodelor de virologie; Academic Press: Londra, Marea Britanie, 1996; p. 21.

19. Thrusfield, M. Epidemiologie veterinară, ed. a II-a; Blackwell Science LTD: Hoboken, NJ, SUA, 1995; p. 479.

20. Lee, C. Virusul diareei epizootice porcine: un virus porcin epizootic emergent și re-emergent. Virol. J. 2015, 12, 193. [CrossRef]

21. Poonsuk, K.; Gimenez-Lirola, LG; Zhang, J.; Arruda, P.; Chen, Q.; Correa da Silva Carrion, L.; Magtoto, R.; Pineyro, P.; Sarmento, L.; Wang, C.; et al. Anticorpul circulant joacă un rol în protecția purceilor împotriva virusului diareei epidemice porcine? PLoS ONE 2016, 11, e0153041. [CrossRef]

22. Niederwerder, MC; Nietfeld, JC; Bai, J.; Peddireddi, L.; Breazeale, B.; Anderson, J.; Kerrigan, MA; An, B.; Oberst, RD; Crawford, K.; et al. Localizarea țesutului, eliminarea, transportul virusului, răspunsul anticorpilor și transmiterea prin aerosoli a virusului diareei epidemice porcine după inocularea porcilor hrănitori de 4-săptămâni. J. Vet. Diag. Investi. 2016, 28, 671–678. [CrossRef]

23. Madson, DM; Arruda, PH; Magstadt, DR; Burrough, ER; Hoang, H.; Soare, D.; Bower, LP; Bhandari, M.; Gauger, PC; Stevenson, GW; et al. Caracterizarea virusului diareei epidemice porcine izolate infecția US/Iowa/18984/2013 la purceii de 1-o zi de vârstă deprivați de colostru derivati ​​prin cezariană. Veterinar. Pathol. 2016, 53, 44–52. [CrossRef]

24. Mainau, E.; Manteca, X. Durere și disconfort cauzate de naștere la vaci și scroafe. Appl. Anim. Comportament. Sci. 2011, 135, 241–251. [CrossRef]

25. Erb, HN Probabilitatea anterioară (pretestare cea mai bună presupunere) afectează valorile predictive ale testelor de diagnostic. Veterinar. Clin. Pathol. 2011, 40, 154–158. [CrossRef] [PubMed]

26. Tenny, S.; Hoffman, MR Prevalența. În StatPearls; Editura StatPearls: Treasure Island, FL, SUA, 2022. 27. Langel, SN; Paim, FC; Alhamo, MA; Buckley, A.; Van Geelen, A.; Lager, KM; Vlasova, AN; Saif, LJ Stadiul de gestație la epidemia porcină Infecția cu virusul diareei porcinelor gravide afectează imunitatea maternă și protecția imună lactogenă a purceilor nou-născuți care alăptează. Față. Imunol. 2019, 10, 727. [CrossRef] [PubMed]