Analiza compoziției și activitățile imunologice ale oligozaharidelor izolate din Cistanche Deserticola
Mar 02, 2022
Cum să îmbunătățești memoria fără medicamente?
Pentru mai multe informații, vă rugăm contactațiali.ma@wecistanche.com
Ying Bai1, Hai-yan Li1, Shi-xian Chen1 1Colegiul de Știință și Inginerie Alimentară, Universitatea Agricolă din Mongolia Interioară, Hohhot 010018, China
Abstract:O oligozaharidă (CDOS) a fost obținută dinCistanche deserticolaprin extracție cu alcalii (pH{{0}}), precipitare cu etanol și fracționat în două fracții purificate (adică, CDOS-1 și CDOS-2) de către Sephadex G-100 și cromatografia de filtrare pe coloană Sephadex G-25. Compoziția de monozaharidă a CDOS a fost testată prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC). S-a descoperit că CDOS-1 era compus doar din zaharoză, iar CDOS-2 era compus în principal din zaharoză, ramnoză și manitol, cu un raport molar de 1:0,73:3,61. Testele imunologice au indicat că CDOS a prezentat un efect semnificativ asupra indicelui splinei la șoarece, crescând activitatea de fagocitoză a macrofagelor și stimulând proliferarea celulelor producătoare de anticorpi. Se speră că CDOS va fi dezvoltat în alimente sau medicamente funcționale.
Cuvinte cheie:Cistanche deserticola, oligozaharidă, purificare, compoziție, activități imunologice.
Click pentru a extrage cistanche beneficii produse
1. Introducere
Cistanche deserticolaYCMa.(FamilieOrobanchaceae) este o plantă parazită scurtă originară din nord-vestul Chinei. Întreaga plantă uscată (fără flori) este cunoscută ca tonic și se numește "Rou Congrong„.În medicina orientală, este clasificat ca gust dulce și sărat, de natură caldă și atribuit canalelor renale și ale intestinului gros, cu funcția de revigorare a rinichilor și de completare a esenței, de hidratare a intestinului și de relaxare a intestinelor [1] -[3].Studiul farmacologic modern a arătat că ar putea determina sinteza ADN-ului și întârzia procesul de senilitate, crește antioxidantul [4], previne și trata bolile cardiovasculare [3] În plus, poate provoca și analgezice și anti -efecte inflamatorii [5], îmbunătățesc învățarea și memoria prin inducerea factorilor de creștere a nervilor.Unele studii au indicat căC. deserticola extractele ar putea activa funcția fagocitară a macrofagelor intra-abdominale la șoareci [7]-[9] și pot crește imunitatea organismului. Conform studiilor anterioare, această plantă conține mai mulți constituenți activi care includ glicozide feniletanoide, iridoide, lignani, zaharide, alcaloizi, etc. [11]C. deserticola glicozidele feniletanoide și polizaharidele sunt recunoscute ca componente active majore, numeroase studii s-au concentrat pe structurile și bioactivitățile lor în ultimele decenii [12]-[17]. Cât despre valoroasele oligozaharide dinC. deserticola, rapoartele sunt destul de limitate. Oligozaharidele, o zaharidă cu lanț scurt care conține homo- sau hetero-zaharuri, sunt bine cunoscute pentru efectele lor benefice asupra vieții umane și au fost utilizate pe scară largă de mult timp [18]. Oligozaharidele funcționale, care au o funcție fiziologică precum cariogenitatea scăzută și factorul de creștere a bifidobacteriilor [19], îmbunătățesc sănătatea oamenilor și a animalelor. Au fost folosite ca ingredient alimentar. Recent, au fost raportate noi funcții ale oligozaharidelor, care au capacitatea de a modula sistemul imunitar la oameni, animale și pești [20]. În această lucrare, raportăm prima parte a rezultatelor programului de cercetare, fracționarea din totalul oligozaharidelor obţinute din extractul alcalin deC. deserticolaprintr-o combinație de ultrafiltrare și cromatografie prin permeație în gel și analiza compoziției acestora prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC). În plus, prezentăm și activitățile imunologice aleC. deserticolaoligozaharide. Din cunoștințele noastre, sunt puține rapoarte publicate despre studiile activității imunostimulatoare aleC. deserticola oligozaharide.
2. Experimental
2.1. Materiale
TheC. deserticola a fost cultivat și colectat de la Alexa League (Inner Mongolia, China). Șoarecii Kunming (Grad II, în vârstă de șase săptămâni) au fost achiziționați de la Centrul Experimental de Farmacologie al Universității din Mongolia Interioară. Sephadex G-100, Sephadex G-25, acid trifluoracetic (TFA), 1-fenil-3-metil-5- pirazolonă (PMP), D-glucoză, D- galactoză, D-fructoză, D-xiloză, D-manoză, acid D-galacturonic, acid D-glucuronic, zaharoză, ramnoză, manitol, fucoză, ramnoză, au fost achiziționate de la Sigma (St. Louis, MO, SUA). RPMI mediu-1640 a fost achiziționat de la Gibco Invitrogen Co. (San Diego, CA, SUA). Toate celelalte substanțe chimice au fost de calitate analitică.
2.2. Extracția oligozaharidelor
Corpurile uscate aleC. deserticola au fost tăiate în bucăți mai mici și mai departe măcinate în pulbere cu o moară au fost extrase cu etanol anhidru (3 x 5000 ml) la 70 de grade timp de 3 ore sub presiune atmosferică. A fost fixat un condensator de reflux pentru a elimina lipidele. Reziduul rămas a fost apoi extras cu alcali (pH=10) la 60 de grade timp de 3 ori (2 ore de fiecare dată). După centrifugare (2000 g timp de 15 min, la 20 de grade), supernatantul a fost concentrat la o zecime din volum într-un evaporator rotativ sub presiune redusă la 50 de grade şi filtrat. Apoi filtratul a fost deproteinizat folosind reactivul Sevag [21] și decolorat cu cărbune activat.
2.3. Izolarea și purificarea oligozaharidelor
Oligozaharidele brute liofilizate au fost dizolvate în apă distilată, centrifugate, iar apoi supernatantul a fost purificat printr-o coloană Sephadex G-100 (1 x 50 cm), echilibrată cu apă ultrapură. După încărcarea cu proba, coloana a fost eluată cu apă ultrapură la un debit de 5 ml/min. Diferite fracții au fost colectate folosind eprubete. Conținutul total de carbohidrați al fiecărui tub a fost măsurat la 490 nm de fenol-H2ASA DE4metoda [22]. Soluția eluată cu apă a fost separată în două fracții CDOS-1 și CDO-2. Două fracții au fost, respectiv, purificate în continuare pe o coloană Sephadex G-25 (2,7 x 85 cm) utilizând apă ultrapură (la un debit de 1 ml/min). După colectarea fracțiunii purificate, aceasta a fost liofilizată.
2.4. Analiza monozaharidelor compoziţie
Compoziția de monozaharidă a CDO a fost obținută prin analiza HPLC. CDO (2 mg) au fost hidrolizate mai întâi cu metanol anhidru care conține 2 M HCI la 80 grade timp de 16 ore sub atmosferă de azot și apoi cu 2 M TFA la 120 de grade timp de 1 oră. După ce TFA a fost îndepărtat prin evaporare, hidrolizatele au fost ulterior derivatizate cu PMP conform metodei raportate [23] și analizate prin HPLC. Separarea HPLC a fost efectuată pe sistemul HPLC EF-2002 (compania KNAUER, Germania). Derivații PMP au fost cromatografiați folosind volumul Sugar-PAK (6,5 x 300 mm, paharele companiei de apă, America), iar absorbanța a fost măsurată la 245 nm. Volumul de injectare a fost de 20 uL, iar faza mobilă, compusă din PBS (solvent A) și acetonitril (solvent B), a fost utilizată pentru eluția izocratică la un raport de volum de 82% (A) la 18% (B). Timpul total de rulare HPLC a fost de 40 min, iar debitul a fost de 0,5 ml/min.
2.5. Imunobiologic Activități
2.5.1. Funcția fagocitară a monocit-macrofagului
Șaizeci de șoareci Kunming (Grad II, în vârstă de șase săptămâni) au fost achiziționați de la Centrul Experimental de Farmacologie al Universității din Mongolia Internă și au fost aclimatizați timp de 1 săptămână înainte de utilizare. Toți șoarecii au fost împărțiți aleatoriu în patru grupuri, constând dintr-un grup de control cu soluție salină, un grup cu dozare mare CDO, un grup cu dozare moderată și un grup cu dozare scăzută de CDO. Șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu soluție de oligozaharide 0,5 ml o dată pe zi timp de 5 zile. Grupul cu dozare CDO mare, moderată sau scăzută a primit 10{{10}}, 50 sau, respectiv, 25 mg/kg/BW CDO; și 0,5 ml de soluție salină au fost injectate în grupul de control. În a șaptea zi a fost efectuat un experiment de eliminare a particulelor de carbon, conform Hou [24], și s-au măsurat indicele splinei și indicele timusului. Pe scurt, 0,05 ml/10 g/bw de cerneală India a fost injectat în fiecare șoarece prin vena caudalis, apoi s-au obținut 20μL de sânge din vena orbitalis posterioară la 3 și 7 minute după injectare. Probele de sânge au fost plasate în tuburi cu 2 ml 0,1 la sută Na2CO3, iar valorile DO au fost măsurate la 600 nm. Indicele de clearance (K), indicele fagocitar ( ) și indicele organului imun au fost calculate după cum urmează(1), t2Si t1înseamnă 7 minute și, respectiv, 3 minute.
2.5.2. Celula producătoare de anticorpi proliferare
Grupuri de șoareci Kunming (cinci per grup) au fost imunizate prin injecție intraperitoneală de 2 x 107SRBC în 1,0 ml de PBS adăugat cu 50 ug de materiale de testat (nici unul în control). O săptămână mai târziu, splenocitele (106celule per 2 ml per godeu) de la șoareci Kunming au fost cultivate cu sau fără materiale de testare timp de 72 de ore în mediu RPMI 1640 10% sub 5% CO2în aer, în trei exemplare pentru fiecare cultură. Numărul de PFC față de SRBC la 106au fost determinate splenocite.
2.6. Statistic analiză
Datele au fost exprimate ca valori medii ± SD. Diferența dintre grupurile testate și control a fost analizată prin testul t Student. P < 0.05="" a="" fost="" considerat="" a="" fi="">
3. Rezultate și Discuţie
3.1. Izolarea și purificarea oligozaharidelor
CDO au fost izolate din extractul alcalin al corpurilor uscate deC. deserticola cu un randament de 3.07 la sută . Două fracții de CDOS-1 și CDOS-2 au fost izolate din apă distilată eluată prin coloana Sephadex G{-100, respectiv (Fig.1). Fracțiile purificate de CDOS-1 și CDOS-2 au prezentat un singur vârf pe coloana Sephadex G-25, indicând faptul că nu au fost prezente alte oligozaharide în probă. Rezultatele compozițiilor de monozaharide au arătat că CDOS-1 era compus doar din zaharoză (Fig.2), iar CDOS-2 era compus în principal din zaharoză, ramnoză și manitol (Fig.3), cu un raport molar din 1:0,73:3,61.
3.2. Activitățile imunobiologice ale CDO
Multe dovezi in vivo și in vitro au demonstrat că oligozaharidele naturale au prezentat funcție imunomodulantă prin stimularea răspunsurilor imune atât celulare, cât și umorale [27], [28]. În această lucrare, 100 mg/kg/bw CDO au crescut indicele splinei la șoarece, dar nu au existat diferențe semnificative în indicele timusului între grupurile tratate și grupurile de control (Tabelul 1). Macrofagele sunt o componentă importantă a apărării gazdei împotriva infecției virale prin inhibarea replicării intracelulare a virusurilor și prin uciderea celulelor infectate cu virus [29]. Când sunt activate, o varietate de intermediari de oxigen sau azot și citokine sunt eliberate de macrofage și participă la diferite funcții biologice importante, cum ar fi activități antiinflamatorii și antitumorale [30]-[32]. Prin urmare, activitatea fagocitară a macrofagelor este un indicator important al funcțiilor imune ale organismului. În acest studiu, dozele moderate și mari de CDO au crescut activitatea de fagocitoză a macrofagelor (Tabelul 1). Proliferarea celulelor producătoare de anticorpi indusă de CDO a fost studiată prin examinarea creșterii PFC hemolitice în splinele șoarecilor Kunming care au fost imunizați cu SRBC plus specimenul de testat. Rezultatele au indicat că dozele moderate și mari de CDO sporesc semnificativ proliferarea celulelor producătoare de anticorpi (Tabelul 2). Dozele mari de CDO au determinat o creștere foarte semnificativă a numărului de PFC (P <>
Referințe
[1] J. Li, Y. Jiang, R. Fan. Recunoașterea semnalului biologic mixt pe baza analizei wavelet. În: Y. Jiang, et al (eds).Proc. al atelierului de inginerie sportivă din Marea Britanie-China. Liverpool: Uniunea Academică Mondială. 2007, p. 1-8.
[2] J. Ouyang, XD Wang, B. Zhao, et al. Efectele elementelor pământurilor rare asupra creșteriiCistanche deserticolacelulelor și producerea de glicozide feniletanoide.JB io-technol, 2003, 102 (2) : 129-134
[3] Xu Zhaohui, Yang Junshan, Lu Ruimian și colab. Un nou produs natural de laCistanche deserticolaYCMA. Jurnalul de Științe Farmaceutice Chineze,1999, 8(2):61-63.
[4] X. Wang, L. Li, Muhuyati, X. Wanag, N. Du. Acțiunea antioxidantă a glicozidelor dinCistancheîn țesutul șoarecilor.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998, 23(9):554-5.
[5] Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CRA Activitate anti-nociceptivă și antiinflamatoare cauzată deCistanche deserticolala rozătoare.J Etnofarmacol. 2002, 83(3):177-82.
[6] Choi, JG; Luna, M; Jeong, HU; Kim, MC; Kim, SY; Oh, MSCistanches Herbaîmbunătățește învățarea și memoria prin inducerea factorului de creștere a nervilor.Cercetarea comportamentală a creierului. 2011, 216 (2): 652–8.
[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. Comparație întreCistanche deserticolaYC Ma și C,tubulosa(Shenk) Wight asupra unor acțiuni farmacologice.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi.1996, 21(7):436-7.
[8] He W, Shu XF, Zeng GZ și colab. Studiu de creștere a potenței sexuale aC. deserticola. J Chin Med.1996, 21(9): 534- 537.
[9] Zeng GZ, He W, Wu GL și colab. Comparaţii întreCistanche deserticolaYC Ma și C.tubulosa greutate asupra unor acțiuni farmacologice.J Chin Med. 1996, 21(7): 436-438.
[10] Zeng QL, Zheng YF, Lu ZL Efectele imunomodulatoare ale polizaharidei deCistanche deserticolaYC Ma.J Zhejiang Univ, Med Sci.2002, 31(4): 284- 287.
[11] Li Yuan, Song Yuanyuan, Zhang Hongquan. Progrese în cercetarea constituenților chimici și a activității medicinale a Cistanche.Resurse de plante sălbatice din China, 2010, 29(1):7-11.
[12] Du NS, Wang H, Yi YH. Izolarea și identificarea glicozidelor feniletanoide dinCistanche deserticola.
Nat Prod R&D, 1993, 5(4): 5- 8.
[13] Lu NS, Liu JL Determinarea glicozidelor feniletanoide înCistanche deserticolaprin rășină macroveziculară- spectrofotometrie.Nat Prod R&D, 1993, 5(3): 30-33.
[14] Xiong QB, Tezuka Y, Kaneko T și colab. Inhibarea oxidului nitric de către feniletanoizi în macrofagele activate.
Jurnalul European de Farmacologie, 2000, 400: 137- 144.
[15] Zhao Wei, Yan Hong, Liang Zhong-Yan și colab. Analiza structurală a polizaharidelor hidrosolubile SPA izolate din tulpina Cistanche Deserticola Ma.Jurnalul de chimie al universităților chineze, 2005, 26(3):461-463.
[16] Wang Xiangyan. Studiu asupra farmacologiei imune și a caracterului de absorbție al polizaharidelor deCistanche deserticola. 2011, nr.S1,Medicina si stiintele sanatatii, E057-235-1-70.
[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Hepatoprotective activity of phenylethanoids fromCistanche deserticola. Planta Med. 1998, 64(2):120-5.
[18] Handbook of Amylases and Related Enzymes (ed. de The Amylase Research Society of Japan), Pergamon Press (1988)
[19] Araya, S. (ed.) Proceedings of the 5thConferință despre cariile dentare și zahărul de cuplare (în japoneză), Institutul Național de Sănătate, Tokyo (1980)
[20] Kodo Otaka. Oligozaharidă funcțională și noul său aspect ca modularea imună.J. Biol. Macromol. 2006, 6
(1), 3-9.
[21] Navarini L, Gilli R, Gombac V, Abatangelo A, Bosco M, Toffanin R. Polysaccharides from hot water extracts of roasted Coffea arabica beans: Isolation and characterization. Glucide.Polim.1999, 40:71–81.
[22] Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Metoda colorimetrică pentru determinarea zaharurilor și a substanțelor înrudite.Anal. Chim. 1956, 28:350–356.
[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Analiza componentelor monozaharidelor din polizaharidele Angelica prin cromatografie lichidă de înaltă performanță.Anal Sci. 2005, 21:1177–1180.
[24] Yufang Hou, Yubao Hou, Liu Yanyan și colab. Extracția și purificarea unei lectine din fasole roșie și studii preliminare ale funcției imune a lectinei și a patru polizaharide din plante chinezești.Jurnalul de Biomedicină și Biotehnologie, 2010:1-9.
[25] Cunningham, AJ și A. Szenberg. Îmbunătățiri suplimentare ale tehnicii plăcii pentru detectarea celulelor formatoare de anticorpi unici.Imunologie.1968, 14:599-600.
[26] Haruhiko Takada, Tomohiko Ogawa, Fuminobu Yoshimura și colab. Activitățile imunobiologice ale unei fracțiuni porine izolate din Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 [J]. Infecție și imunitate. 1988, 56(4): 855-863.
[27] Wang MQ, Guilbert LJ, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu SR, Pang P, Shan JJ Activitatea de imunomodulare a CVT-E002: un extract de proprietate din ginseng nord-american (Panax quinque folium).J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515–1523.
[28] Nergard CS, Kiyohara H, Reynolds JC, Thomas-Oates JE, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen BS Structuri și relații structură-activitate a trei mitogeni și fixarea complementului arabinogalactani pectici din plantele antiulceroase din MaliCochlospermum tinctoriumA. Bogaţi şiVernonia kotschianaSch Bip. fost Walp.Biomacromolecule. 2006, 7:71–79.
[29] E.-M. Choi, A.-J. Kim, Y.-O. Kim și J.-K. Hwang, Activitatea imunomodulantă a Arabinogalactanului și Fucoidanului in vitro.Journal of Medicinal Food. 2005, 8(4):446–453.
[30] Y. Chen, J.-A. Duan, D. Qian, et al. Evaluarea și compararea activității imunoreglatoare a patru fracții hidrosolubile de Angelica Sinensis in vitro pe macrofagele peritoneale la șoarecii ICR.Imunofarmacologie internațională. 2010, 10:422–430.
[31] YS Lee, OK Han, CW Park și colab. Expresia genei citokinelor proinflamatorii și reglarea oxidului nitric al radixului Astragali extras în apă în celulele macrofage RAW 264.7.Jurnalul de etnofarmacologie. 2005, 100(3): 289–294.
[32] KY Lee și YJ Jeon. Polizaharida izolată din Poria cocos sclerotium induce activarea NF-kB/Rel și expresia iNOS în macrofagele murine.Imunofarmacologie internațională. 2003, 3(10-11):1353–1362.
