Reglarea coordonată a metabolismului triptofanului sistemic și renal de către transportatorii de medicamente OAT1 și OAT3

Jeffry C. Granados¹, Anne Richelle², Jahir M. Gutierrez¹, Patrick Zhang³, Xinlian Zhang⁴, Vibha Bhatnagar⁵, Nathan E. Lewis^1,2,6și Sanjay K. Nigam^2,7,*

^{A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com}

experiență cistanche

Cum organele simt metaboliții circulanți este o întrebare cheie. Aici, arătăm că transportatorii anioni organici multispecifici ai medicamentelor, OAT1 (SLC22A6 sau NKT) și OAT3 (SLC22A8), joacă un rol în sensul organelor. Analizele metabolomice ale serului șoarecilor knockout Oat1 și Oat3 au relevat modificări ale derivaților de triptofan implicați în metabolism și semnalizare. Câțiva dintre acești metaboliți sunt derivați din microbiomul intestinal și sunt implicați ca toxine uremice încronicrinichiboala. Interacțiunea directă cu transportorii a fost susținută de teste de transport pe bază de celule. Pentru a evalua impactul pierderii funcției OAT1 sau OAT3 asupra rinichilor, un organ în care acești transportori de absorbție sunt foarte exprimați, datele transcriptomice knockout au fost mapate pe un model de calcul bazat pe „sarcini metabolice” care evaluează peste 150 de funcții celulare. În ciuda modificărilor metaboliților triptofanului în ambele knockouts, numai în knockout-ul Oat1 au fost crescute funcțiile celulare multiple legate de triptofan. Astfel, lipsit de capacitatea de a lua kinurenină, kinurenat, antranilat și N-pentru-milantranilat prin OAT1, rinichiul răspunde activând propriile căi de biosinteză legate de triptofan. Rezultatele susțin teoria de detecție și semnalizare de la distanță, care descrie modul în care transportorii „de droguri” ajută la optimizarea nivelurilor de metaboliți și de molecule de semnalizare prin facilitarea dialogului între organe. Deoarece OAT1 și OAT3 sunt inhibate de multe medicamente, datele implică potențialul de interacțiuni medicament-metabolit. Într-adevăr, tratamentul oamenilor cu probenecid, un inhibitor de OAT folosit pentru a trata guta, metaboliți circulanți crescuti ai triptofanului. Mai mult, având în vedere că agențiile de reglementare au recomandat ca medicamentele să fie testate pentru legarea sau transportul OAT1 și OAT3, rezultă că acești metaboliți pot fi utilizați ca biomarkeri endogeni pentru a determina dacă candidații la medicamente interacționează cu OAT1 și/sau OAT3.

Transportatorii de anioni organici OAT1 (SLC22A6, inițial NKT (1)) și OAT3 (SLC22A8, inițial ROCT (2)) se găsesc în tubul proximal alrinichiși plexul coroid al creierului și controlează distribuția fiziologică și eliminarea a numeroase medicamente și toxine de mediu, precum și metaboliți endogeni, cum ar fi -ketoglutarat, prostaglandine și urat (3, 4). În plus, OAT ajută la reglarea nivelurilor de produse naturale ingerate și compuși derivați din microbiom intestinal (de exemplu, epicatechină, 3-indoxil sulfat, p-crezol sulfat) (5, 6).

OAT1 și OAT3, membri ai familiei SLC22, sunt printre cei mai cunoscuți transportatori de medicamente multispecifice. Acest grup de transportatori de medicamente include alți membri ai superfamiliilor SLC (purtător solut) și ABC (caseta de legare ATP) (7, 8). Există o literatură extinsă despre rolurile farmaceutice și toxicologice ale acestor transportatori, dar funcțiile endogene ale acestor proteine ​​conservate evolutiv, precum și rețeaua de reglementare în care participă, abia încep să fie caracterizate (9). Acești transportatori multispecifici influențează multe aspecte ale fiziologiei și fiziopatologiei, probabil prin funcționarea în combinație cu transportori mono- sau oligo-specifici. Trei exemple fiziopatologice bine caracterizate sunt rolurile OAT1, OAT3, URAT1 și ABCG2 în gută (10), rolul OAT1 și OAT3 în acumularea de toxine uremice asociate cu boli cronice.rinichiboala (CKD) (11, 12), iar familia SLC22 în acutrinichiaccidentare (13).

Datorită gamei vaste de compuși anionici organici mici transportați de OAT1 și OAT3, o gamă largă de xenobiotice și molecule endogene pot concura pentru accesul și clearance-ul renal de către acești transportori OAT (14, 15). Acest lucru are implicații importante deoarece mulți dintre metaboliți, inclusiv cei care provin din microbiomul intestinal și transportați de OAT1 și OAT3, reglează fiziologia endogenă și au fost legați de dezvoltarea unor tulburări clinice, cum ar fi CKD, sindromul metabolic și diabetul (14, 16, 17). De exemplu, cantitatea de CMPF (3-carboxi-4-metil-5-propil{-2- acid furan propanoic), un substrat al OAT3, din circulație a fost legată de diabet. CMPF este un metabolit al acidului gras furan care se găsește în uleiurile de pește, uleiurile vegetale, unt și alte alimente și perturbă funcția celulelor pancreatice, ducând la intoleranță la glucoză (18, 19). Consecințele potențiale ale competiției la nivel de transportor între un medicament și metabolitul endogen transportat includ (a) concentrații intracelulare modificate de metaboliți deoarece un medicament transportat blochează intrarea metabolitului în celulă; (b) concentrații serice modificate ale medicamentului, metabolitului sau ambelor, conducând la creșterea timpilor de înjumătățire și/sau a nivelurilor metaboliților; și (c) metabolismul sistemic alterat care decurge din efectele distale în cascadă asupra căilor metabolice multiple care depind de OAT1 sau OAT3 sau ambele.

Am aplicat o abordare de biologie a sistemelor care a folosit date metabolomice și transcriptomice de la șoarecii Oat1 și Oat3knockout (KO) pentru a analiza funcțiile metabolice majore care sunt influențate de OAT1 și OAT3. Datele metabolomice serice de la șoarecii Oat1 și Oat3 KO au reprezentat impactul pe care acești transportatori îl au asupra metabolismului sistemic endogen. Am folosit datele transcriptomice de larinichi, care este locul de exprimare al genelor transportoare de codificare, pentru a evalua activitatea a sute de funcții metabolice folosind analiza sarcinilor metabolice. Procedând astfel, am reușit să completăm înțelegerea modificărilor metaboliților extracelulari datorate pierderii transportorului OAT1 sau OAT3 cu o analiză a căilor metabolice intracelulare afectate.

Împreună, abordarea multi-omică și analiza biologiei sistemelor utilizate aici oferă un portret al căilor metabolice și de semnalizare locale și sistemice modulate separat și în comun de OAT1 și OAT3. Arătăm că OAT1 nu numai că reglează metabolismul triptofanului în mod sistemic, dar joacă, de asemenea, un rol cheie în căile metabolice ale triptofanului în interiorul țesutului în care se găsește. Astfel, rezultatele noastre indică faptul că studiile noilor entități medicamentoase nu ar trebui să ia în considerare doar efectele interacțiunii medicament-metabolit (DMI) în ser, ci și să evalueze potențialele schimbări în metabolismul celular datorită pierderii influxului de metaboliți prin competiție la nivelul transportorului. În sprijinul relevanței umane a muncii noastre, arătăm că multe dintre modificările nivelurilor serice ale metaboliților triptofanului observate la șoarecii knockout sunt observate și la oameni după administrarea probenecidului, un medicament utilizat pentru tratarea gutei care inhibă OAT1 și OAT3.

\

cistanche beneficii masculine

Rezultate

Rezumatul abordării generale

Familia de gene SLC22 (OAT, OCT, OCTN) codifică transportorii care participă la absorbția multor compuși unici în mai multe țesuturi, deși o mare parte a cercetării s-a concentrat pe o mână de membri (SLC22A1, SLC22A2, SLC22A6, SLC22A8) care se ocupă. multe medicamente comune (20, 21). Cu toate acestea, aceste gene sunt foarte conservate, cu ortologi în muscă, vierme, pește și arici de mare (22); aceasta înseamnă că au roluri fiziologice importante dincolo de manipularea drogurilor. Pentru a determina rolurile endogene ale OAT1 și OAT3 în controlul metabolismului la nivel de țesut și la nivel de organism independent de rolurile lor binecunoscute ca transportatori de medicamente și toxine, am analizat datele transcriptomice specifice țesutului și datele metabolomice serice (Fig. 1). Am comparat datele de la șoareci cu deficit genetic fie în Oat1, fie în Oat3 și martorii lor de tip sălbatic. Aceste seturi de date au fost examinate anterior dintr-o perspectivă chimioinformatică (23) și pentru a oferi o privire de ansamblu asupra căilor afectate (24), dar aici punem accent pe rolul lor specific în dispunerea metaboliților triptofanului. Pentru că aceste două transportoare se găsesc înrinichi, am analizatrinichidate transcriptomice utilizând Analiza sarcinilor metabolice, o metodă de biologie a sistemelor care grupează genele în funcție de rolurile lor coordonate în biosinteza unui set limitat de intermediari cheie de metaboliți din diverse intrări de metaboliți (a se vedea secțiunea Metode pentru mai multe detalii). Am susținut aceste studii în cadrul testelor de transport vitro; susținem, de asemenea, relevanța clinică a constatărilor noastre cu datele metabolomice umane.

Caracteristici cunoscute ale șoarecilor Oat1 KO și Oat3 KO Aproape toate caracteristicile șoarecilor cu deficit de Oat1 sau Oat3 sunt similare cu cele ale șoarecilor de tip sălbatic (25-27) (Tabelul 1). Șoarecii knockout sunt viabili cu supraviețuire comparabilă cu cea a șoarecilor de tip sălbatic. Mai mult decât atât, nu prezintă anomalii aparente de dezvoltare sau de creștere, iar examinarea histologică și fiziologică a acestor diverse knockouts (cu vârsta de ~2-8 luni) a evidențiat diferențe mici sau deloc față de tipul sălbatic, în afară de șoarecii Oat3 KO care au o tensiune arterială puțin mai scăzută ( 28). S-a observat, de asemenea, o tendință către depunerea lipidelor hepatice în Oat1 KO, dar numai pentru șoarecii foarte bătrâni (29).

Acești șoareci knockout transportatori au fost, de asemenea, caracterizați din punct de vedere farmacologic și toxicologic (Tabelul 2). OAT1 și OAT3 joacă roluri importante în manipularea diferitelor medicamente și toxine, atât de mediu, cât și produse endogen (30–38). Ambii șoareci knockout au răspunsuri modificate la diureticele de ansă și tiazidice din cauza incapacității acestor medicamente de a accesa lumenul nefronului - un proces care depinde de absorbția mediată de OAT1-sau OAT3-în celula tubului proximal. . Animalele Oat1 KO sunt protejate împotriva nefrotoxicității induse de mercur din cauza lipsei derinichiabsorbția conjugaților de mercur. Ambii șoareci au acumulat toxine uremice în ser și au prezentat o secreție scăzută de acid uric. Analiza ex vivo a țesuturilor de la șoareci Oat1 KO sau Oat3 KO arată o absorbție redusă a mai multor antivirale.

Am raportat că animalele cu1-deficiență de ovăz pot avea o expresie redusă a OAT3 (39). Cu toate acestea, o serie de studii au indicat că impactul funcțional al acestuia este în cel mai bun caz modest în starea bazală. De exemplu, knockout-ul Oat1rinichiau redus semnificativ transportul HAP, dar nu aparent pierderea de transport a substratului OAT3, sulfatul de estronă (26). Analiza chimioinformatică a identificat seturi de proprietăți moleculare care disting metaboliții modificați în Oat1 în comparație cu șoarecii cu deficit de Oat3 (23). În plus, embrionarărinichiculturile de organe din ambele linii de șoareci au transportat seturi diferite de antivirale (36-38). Există, de asemenea, diferențe între tipurile de toxine uremice găsite în Oat1 versus Oat3 KO (34).

Metabolismul triptofanului este alterat sistemic la șoarecii KO Oat1 și Oat3

Analizele metabolomice publicate ale șoarecilor Oat1 KO și Oat3 KO sugerează modificări importante din punct de vedere fiziologic în manipularea metaboliților endogeni și a produselor microbiomului intestinal, inclusiv unele toxine uremice (34, 35). Aici, am analizat 731 de metaboliți cu identitate cunoscută în serul colectat de la șoarecii martor și Oat1 KO. De asemenea, 611 metaboliți cu identitate cunoscută au fost detectați în serul de la șoareci martor și Oat3 KO.

Pentru șoarecii Oat1 KO, am constatat că 63 de metaboliți din Superpathway aminoacizilor (tabelul suplimentar S1) au fost semnificativ crescute (p mai mic sau egal cu 0.05, 54 metaboliți, dintre care 12 metaboliți au avut modificări de ori mai mari de 3) sau au tendința de a crește semnificativ (0.05 Mai mică sau egală cu p Mai mică sau egală cu 0,10, nouă metaboliți), sugerând că sunt fie substraturi OAT1, fie că concentrațiile lor serice depind pe OAT1. Pentru șoarecii Oat3 KO, am constatat că zece metaboliți din Superpathway aminoacizilor au fost semnificativ crescuți, în timp ce 11 au avut tendința de a crește semnificativ (Tabelul suplimentar S2). Ca o completare a valorilor p, am calculat, de asemenea, d-ul lui Cohen, care a arătat dimensiuni mari ale efectului (variind de la 1,76 la 4,17) pentru metaboliții triptofanului. În concordanță cu alte date farmacologice și fiziologice obținute de la șoarecii knockout OAT1 și OAT3 sau de la țesutul lor care indică diferențe funcționale importante (23, 36, 38), compararea modificărilor metaboliților serici în modul Superpath aminoacizilor între Oat1 KO (63 metaboliți) și Șoarecii Oat3 KO (21 de metaboliți) au dezvăluit doar zece metaboliți suprapuneri în aceste subseturi (Tabelul suplimentar S3).

Fiecare metabolit a fost clasificat folosind software-ul Metabolon într-una dintre cele opt Supercăi (aminoacizi, carbohidrați, cofactori și vitamine, energie, lipide, nucleotide, peptide, xenobiotice) și una dintre cele 90 de subcăi. Dintre cei 17 metaboliți care s-au acumulat semnificativ în serul animalelor Oat1 KO și Oat3 KO, patru aparțineau Subpathway-ului de metabolizare a triptofanului, ceea ce indică faptul că acești doi transportatori au un rol comun important în reglarea metabolismului sistemic al triptofanului (Fig. 2) . În mod independent, metabolismul triptofanului a fost printre cele mai îmbogățite sub căi pentru ambele modele knockout (Fig. 3). Șaisprezece Figura 3. Metabolismul triptofanului este una dintre căile cele mai modificate la ambii șoareci knockout. O diagramă vulcanică pentru Oat1 KO (n=5) ​​arată metaboliții triptofanului față de toți ceilalți metaboliți măsurați. B, metabolismul triptofanului este a doua cale cea mai îmbogățită pentru metaboliții semnificativ crescuți. C, graficul vulcanului pentru Oat3 KO (n=3) care arată metaboliții triptofanului față de toți ceilalți metaboliți măsurați. D, metabolismul triptofanului este calea cea mai îmbogățită pentru metaboliții semnificativ crescuți pe baza analizei sub-căii metabolonului. Rolul OAT1 și OAT3 în metabolismul triptofanului 4 J. Biol. Chim. (2021) 296 100575Meboliții triptofanului au fost măsurați în serul ambilor șoareci și 12 au fost modificați semnificativ în cel puțin un grup. Șoarecii Oat1 KO au avut 11 metaboliți crescuți, inclusiv unul (hranilat de N-formilant) care nu a fost măsurat în serul Oat3 KO (Tabelul 3). Analiza Oat3 KO a dezvăluit că șase dintre cei 16 metaboliți au fost semnificativ sau au avut tendința de a modifica semnificativ. Unii dintre acești metaboliți, inclusiv cei care provin din bacterii din microflora intestinală, sunt cunoscuți a avea efecte distale asupra mai multor alte organe. De exemplu, 3-sulfatul de indoxil este asociat cu progresiarinichiboala și sindromul uremic (12, 40). Datele indică faptul că OAT1 și OAT3 lucrează împreună pentru a regla metabolismul sistemic al triptofanului și, totuși, au funcții specifice în metabolismul triptofanului prin manipularea seturi distincte de metaboliți care afectează diferite reacții biochimice.

Evaluarea interacțiunilor medicament-metabolit la oameni care implică un medicament care inhibă OAT și metaboliți ai triptofanului

Probenecidul, un medicament folosit pentru tratarea gutei, a fost administrat oamenilor pentru a determina impactul pe termen scurt al unui medicament care leagă OAT cu afinitate mare asupra nivelurilor metaboliților circulanți. Probenecidul are trei ținte bine stabilite: SLC22A12 (URAT1, Rst), OAT1 și OAT3, toate acestea fiind gene strâns înrudite din grupul transportor de anioni organici din familia de purtători de soluți SLC22. URAT1 este un transportor de acid uric situat pe membrana apicală (partea orientată spre urină) a tubului proximal, astfel încât OAT1 și OAT3, care sunt multispecifice și exprimate pe partea orientată spre sânge a tubului proximal, sunt de așteptat să exercite o efect mai profund asupra metabolomului seric. Comparațiile dintre măsurătorile metabolice ale sângelui înainte și la 5 ore după dozare arată modificări majore ale Sub-căii de metabolizare a triptofanului (Tabelul 4). Datorită diferitelor platforme, au existat 22 de metaboliți în această sub-cale, dintre care 16 au fost modificați semnificativ. Paisprezece metaboliți au fost măsurați pe toate cele trei platforme și au evidențiat mai multe aspecte comune între șoarecii knock-out și oamenii tratați cu probenecid (Fig. 4). De exemplu, s-au observat creșteri ale 3-sulfatului de indoxil, chinureninei, N-acetilchinureninei și lactatului de indol atât la grupurile de șoareci knockout, cât și la oameni. Cu toate acestea, a existat mai multă suprapunere între șoarecele Oat1 KO și oamenii tratați cu probenecid. Toți cei opt metaboliți care au fost semnificativ crescuți în Oat1 KO au fost, de asemenea, semnificativ crescuți la oamenii tratați cu medicamente. Doar serotonina, care a fost crescută la șoarecele Oat3 KO, nu a fost modificată la om.

Șoarecii tratați cu un medicament care inhibă OAT prezintă modificări în metabolismul triptofanului

Ca intermediar între modelele noastre de șoareci knockout și oameni, am tratat șoarecii de tip sălbatic cu probenecid, un medicament bine stabilit care inhibă OAT. Acest tratament medicamentos a condus la creșterea a șase metaboliți ai triptofanului, inclusiv chinurenină, chinurenat și indolelactat (Fig. 5). Acești metaboliți au fost crescuti în unul sau ambele experimente knock-out și la oamenii tratați cu probenecid.

Astfel, rezultatele generale la oamenii și șoarecii tratați cu probenecid, precum și la șoarecii knockout, susțin rolul OAT1 și OAT3 în reglarea nivelurilor circulante ale metaboliților triptofanului.

Metaboliții triptofanului interacționează cu testele de transport in vitro OAT1 și OAT3 umane Pentru a confirma constatările noastre, am efectuat teste de transport in vitro folosind celule care supraexprimă OAT1 și OAT3 uman. Mulți dintre metaboliții din această cale secundară au fost testați împotriva acestor transportatori (Tabelul 3), dar alți metaboliți rămân neexplorați. Testele de transport pentru acid indoleacetic (ILA) au arătat că ILA interacționează cu OAT1 și OAT3 (IC50=229.1 ± 74,56 μM, respectiv 74,49 ± 23,29 μM) (Fig. 6). În plus, serotonina, care a fost crescută în mod unic în Oat3 KO, a interacționat doar cu OAT3 in vitro (IC50=288.2 ± 167.0 μM) (datele nu sunt prezentate). Valorile IC50 au fost apoi integrate cu valori Km cunoscute pentru a calcula constantele inhibitorii. Constanta inhibitorie (Ki) pentru ILA cu OAT1 a fost de 119,3 μM.

Analiza metabolomică a rinichilor knockout indică un rol esențial pentru OAT1 în detectarea tubulilor proximali a metaboliților triptofanului

Am folosit date microarray de larinichide Oat1 KO, Oat3 KO și controalele lor de tip sălbatic pentru a identifica modul în care modificările transportorului influențeazărinichifuncții metabolice. În acest scop, am folosit o metodă de biologie a sistemelor (analiza sarcinilor metabolice (41) din instrumentul CellFie) care prezice modul în care schimbările în expresia genelor influențează o listă predefinită de 175 de sarcini metabolice (Tabelul suplimentar S4), acoperind sistemele metabolice generale ale unui celula (energie, nucleotide, carbohidrați, aminoacizi, lipide, vitamine și cofactori și metabolismul glicanilor). Așa cum este descris în Metode, calculul unui „scor de activitate metabolică” preia date transcriptomice și atribuie un scor de activitate a genei pentru fiecare genă. Un model de metabolism la scară genomică este utilizat pentru a compila o listă de reacții necesare pentru a îndeplini fiecare dintre cele 175 de sarcini metabolice. Astfel, analiza transcriptomică poate fi utilizată direct pentru a compara cantitativ activitatea relativă a fiecărei funcții metabolice în diferite condiții (de exemplu, de tip sălbatic versus Oat1 KO, de tip sălbatic versus Oat3 KO).

Am descoperit că sarcinile metabolice legate de triptofan erau comune în rândul celor cu o diferență mare între Oat KO și șoarecii de tip sălbatic. Ceea ce a fost neașteptat, însă, a fost cărinichiSarcinile metabolice legate de triptofan au fost dependente de OAT1, dar nu de OAT3. La șoarecii Oat1 KO, sinteza kinureninei, kinurenatului, antranilatului și N-pentru-milantranilat din triptofan a avut scoruri crescute ale sarcinilor metabolice, în timp ce fiecare dintre aceste sarcini a avut un scor scăzut al sarcinii metabolice în Oat3 KO. Acest lucru este în concordanță cu analizele metabolomice serice, care arată creșteri semnificative ale nivelurilor de chinurenină, kinurenat, antranilat și N-pentru-milantranilat în Oat1 KO.

Discuţie

OAT1 și OAT3 sunt recunoscute pentru rolul lor în eliminarea a sute de medicamente (42). Cu toate acestea, studiile in vivo și in vitro ale OAT1 și OAT3 au arătat că aceste proteine ​​sunt implicate în transportul a numeroși metaboliți endogeni și derivați din microbi intestinali, toxine uremice, molecule de semnalizare, nutrienți ingerați, toxine industriale și produse naturale (9, 24, 26, 34, 35, 43). Acesta pare să fie și cazul altor transportatori multispecifici de medicamente, ceea ce sugerează că contribuția lor la metabolismul endogen este foarte subapreciată (44).

Acești transportatori de medicamente multispecifici sunt foarte exprimați în aproape toate țesuturile și joacă un rol deosebit de critic în Figura 4. Metaboliții triptofanului au fost crescuți la șoarecii knockout de ovăz și la oamenii tratați cu probenecid. O diagramă Venn a metaboliților triptofanului modificați semnificativ la șoarecii knockout și la oameni tratați cu probenecid. Dintre cei 14 metaboliți comuni tuturor celor trei platforme, 12 au fost semnificativ crescuți în cel puțin unul dintre experimente. Patru metaboliți au fost semnificativ crescuți în fiecare experiment. B, structuri chimice ale metaboliților crescute în fiecare experiment: 3-sulfat de indoxil, indolelactat, chinurenină și N-acetilchinurenină. C, diagrame cu casete pentru fiecare metabolit la oamenii tratați cu probenecid (n=20), șoarecii Oat1 KO (n=5) și șoarecii Oat3 KO (n=3). Liniile din boxplot indică mediana. Rolul OAT1 și OAT3 în metabolismul triptofanului. Biol. Chim. (2021) 296 100575 7bariere epiteliale și endoteliale între sânge și alte fluide/compartimente ale corpului (de exemplu, bariera hemato-encefalică, bariera sânge-retină, bariera sânge-LCR, bariera nas-creier, bariera sânge-urină). În calitate de regulatori ai metabolismului sistemic, precum și a metabolismului local în țesutul lor de expresie, tipul de studii și analize pe care le-am descris aici dacă sunt efectuate pentru toți transportatorii „de medicamente”, pot modifica radical opiniile noastre fiziologice despre aceste proteine ​​conservate evolutiv.

Importanța clinică farmaceutică a acestor transportatori este imensă, iar agențiile de reglementare au recomandat screening-ul noilor entități medicamentoase împotriva a cel puțin șapte transportatori multispecifici de medicamente (OAT1, OAT3, OATP1B1, OATP1B3, OCT2, P-GP, BCRP) pentru a limita posibilitatea de apariție a medicamentelor. interacțiuni medicamentoase (DDI) – cazuri în care două sau mai multe medicamente concurează pentru accesul la același transportator. DDI-urile mediate de transportor pot modifica concentrația medicamentelor în sânge, ceea ce poate duce la efecte clinice adverse (45). Având în vedere numărul de substraturi pentru OAT1 și OAT3, un fenomen similar poate apărea între medicamente și metaboliți în circulație. Aceste DMI au, de asemenea, potențialul de a afecta funcția țesuturilor, deoarece metaboliții și moleculele de semnalizare pot fi incapabile să intre în celulă și să își exercite efectele asupra fiziologiei celulare normale. Studiul de față susține această posibilitate.

În analizele noastre metabolomice ale serului șoarecilor knockout Oat1 și Oat3, au existat modificări marcate ale metaboliților legați de triptofan. Creșterea nivelurilor sistemice de metaboliți, datorită absenței acestor transportatori la interfața sângelui curinichi, a ridicat posibilitatea scăderii concentrației intracelulare înrinichicelule tubulare proximale. Cum ar putea aceste celule să răspundă la rândul lor? Am folosit analiza sarcinilor metabolice bazată pe transcriptomică pentru a aborda această întrebare. Am identificat mai multe sarcini metabolice locale (rinichi) legate de triptofan, afectate de absența transportatorilor. Aceste modificări ale scorurilor sarcinilor metabolice sunt cauzate de creșteri compensatorii ale expresiei genelor asociate sarcinii metabolice în contextul deficienței OAT1. În timp ce multe căi metabolice au fost cercetate atât de metabolomică, cât și de analiza sarcinilor metabolice bazată pe transcriptomică, utilizarea ambelor abordări ne-a oferit perspective unice asupra modului în care anumiți transportatori de medicamente participă la comunicarea dintre țesut și mediul extracelular. Astfel, în timp ce metaboliții triptofanului au fost reglați de ambii transportatori la nivel sistemic, sarcinile metabolice legate de triptofan din rinichi au fost dependente în principal de OAT1.

Rezultatele indică faptul că tubul proximal alrinichi, unde se găsesc OAT, nu este pur și simplu o conductă pentru eliminarea renală a metaboliților triptofanului; sesizează metaboliții triptofanului și răspunde la modificările abundenței lor intracelulare. În mod colectiv, datele susțin opinia că OAT1 joacă un rol cheie nu numai în eliminarea metaboliților legați de triptofan din circulație prin promovarea absorbției acestora de cătrerinichidar și că acest transportor reglează metabolismul intracelular, în special metabolismul triptofanului.

Acest lucru susține opinia conform căreia transportul mediat de OAT1-chinurenină, kinurenat, antranilat și N-pentru-milantranilat este important pentrurinichifuncţie (Fig. 8). Acești patru metaboliți aparțin subcăii chinureninei de degradare a triptofanului și, cu excepția chinurenatului, ei sunt implicați în producerea de energie celulară prin sinteza NAD plus (46). Astfel, este posibil ca lipsa OAT1 să conducă la metabolismul celular afectat care poate fi, cel puțin parțial, recuperat prin producerea acestor metaboliți.

Aproape tot triptofanul ingerat este metabolizat în trei subcăi principale: chinurenina, serotonina și indolul (47, 48). În plus față de rolul său în producerea NAD plus, sub-calea chinureninei produce metaboliți care au o varietate de funcții atât în ​​​​stări sănătoase, cât și în cele bolnave (46, 49). Calea serotoninei produce neurotransmițătorul, serotonina, care are un rol în numeroase procese fiziologice, în special ca reglator al funcției SNC (50). Sub-calea indolului, care este mediată de microbiomul intestinal, produce molecule de semnalizare care participă la comunicarea gazdă-microbian (51). Sistemic, OAT1 și OAT3 modulează biodisponibilitatea metaboliților triptofanului din fiecare dintre cele trei subcăi, deși majoritatea metaboliților provin din subcăile chinureninei și indolului.

Având în vedere multitudinea de roluri de semnalizare pe care le au metaboliții crescuți, există potențialul ca OAT1 și OAT3 să influențeze multe aspecte ale fiziologiei. De exemplu, kinurenatul activează GPR35, o țintă de medicament și un GPCR implicat în răspunsurile inflamatorii și bolile cardiovasculare (52). Mulți dintre metaboliții de triptofan modificați semnificativ sunt, de asemenea, stabiliți sau liganzi presupuși ai receptorului de hidrocarburi arii (AhR) (Tabelul 3), un regulator transcripțional exprimat în aproape toate țesuturile care răspund la xenobiotice (53).

Studiile metabolomice ale celor doi șoareci knockout au arătat că o funcție endogenă cheie a OAT1 și OAT3 este de a regla nivelurile sistemice ale metaboliților triptofanului. Astfel, un medicament care vizează OAT1 și OAT3 ar fi de așteptat să aibă un impact similar asupra metabolomului. După cum sa prezis, potențialul de translație al șoarecilor noștri knockout ca modele de DMI a fost puternic susținut de rezultatele de la oameni tratați cu probenecid, un medicament care inhibă OAT care este utilizat în întreaga lume pentru a trata guta. Câțiva dintre metaboliții triptofanului au fost crescuți atât în ​​serul oamenilor, cât și în cel al șoarecilor knockout.

Astfel, există potențialul ca compușii crescuți în studiile la om și la rozătoare să fie utilizați ca biomarkeri pentru noi entități medicamentoase care pot inhiba OAT1 și OAT3. În timp ce modelele de șoareci knockout (care au o speranță de viață normală) și oamenii tratați cu probenecid au fost sănătoși, unii dintre metaboliții crescuti sunt toxine uremice cunoscute care sunt crescute în serul oamenilor care suferă de insuficiență renală cronică și asociate cu rezultate negative (54). , 55). Suprapunerea metaboliților implicați în aspecte ale CKD și studiile noastre au sugerat că OAT-urile pot juca un rol cheie în manifestările CKD sau progresia acesteia, deși este, de asemenea, posibil ca concentrațiile metaboliților să fie crescute din cauza pierderii secreției ca urmare a țesutului. daune (56, 57). CKD poate duce, de asemenea, la insuficiență multiorganică, în parte datorită acumulării de toxine uremice, iar acest lucru se poate datora parțial absorbției în alte țesuturi prin intermediul transportatorilor de medicamente SLC și ABC (12, 58).

Calea metabolismului triptofanului necesită funcția coordonată a mai multor organe. Triptofanul este absorbit de intestin, modificat de ficat sau de alte organe, iar metaboliții sunt transportați în cele din urmă de cătrerinichi, în parte prin funcția OAT1 și OAT3. În mod convențional, aceasta este privită pur și simplu ca o cale de eliminare. Rezultatele noastre, care indică faptul că celulelerinichirăspund la absența acestor metaboliți și molecule de semnalizare pregătindu-se pentru a le produce, sugerează altfel. Deși rolul lor specific înrinichitubul proximal este slab definit, este clar că mulți dintre intermediarii produși sunt neurotransmițători și au un rol important în funcția SNC (46, 49, 59, 60). Pe lângă comunicarea între organe, metabolismul triptofanului reflectă și comunicarea interorganismă dintre gazdă și microbiomul intestinal. Într-adevăr, serul șoarecilor fără germeni are niveluri scăzute de 3-indoxil sulfat, indolepropionat și serotonină (61). În plus, studiile anterioare au arătat că în celulele OAT1-pozitive renale, 3-sulfatul de indoxil funcționează în semnalizarea celulară prin activarea AhR și prin reglarea propriei secreții prin OAT1 (62). Descoperirile noastre că metaboliții derivați din intestin au fost crescuti în serul șoarecilor Oat1 KO și Oat3 KO - împreună cu demonstrația noastră că unii sunt liganzi in vitro, oferă un sprijin suplimentar pentru importanța acestor transportatori în reglarea comunicării dintre gazdă și comensal. organisme. În total, rezultatele noastre se aliniază cu teoria teledetecției și semnalizării, care propune că transportatorii de medicamente și enzimele care metabolizează medicamentele participă la comunicarea interorganică și interorganismă prin transportul și modificarea moleculelor mici pentru a menține homeostazia (63, 64). Astfel, este esențial să înțelegem gama de funcții fiziologice endogene ale transportatorilor de medicamente la nivel sistemic și local.

Cu date de metabolomică îmbunătățite, am identificat metaboliți afectați de absența OAT1 și OAT3 în modelele de rozătoare și metaboliții afectați de inhibarea OAT1 și OAT3 la oameni tratați cu medicamente care inhibă OAT. Grupul nostru a folosit anterior rețele de reconstrucție metabolică pentru a prezice funcția metabolică și a raportat câteva căi comune și unice reglementate de OAT1 și OAT3 (43, 65). Cu toate acestea, aceste studii au fost limitate de versiunile timpurii ale instrumentelor de reconstrucție și de foarte puține date metabolomice. Aici, folosind o abordare diferită, Metabolic Task Analysis a pus un accent mult mai mare pe rolul OAT1 în metabolismul intracelular al triptofanului.rinichi. Abordarea noastră poate fi aplicată pentru a investiga funcțiile endogene ale altor membri ai familiei SLC și ABC și pentru a construi rețele separate, dar care se suprapun, pentru toți acești transportatori de medicamente, care se găsesc nu numai la șoareci, ci și în întregi și viermi (20, 66). Astfel de reprezentări vor facilita, de asemenea, înțelegerea întregii dimensiuni a DMI-urilor pentru medicamentele care interacționează cu OAT1, OAT3 sau ambele, care probabil depășesc simpla concurență la nivelul transportatorului.

Proceduri experimentale

animale

Toate protocoalele experimentale care implică utilizarea animalelor au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) UCSD. Toate animalele au fost manipulate în conformitate cu Ghidurile instituționale privind utilizarea animalelor vii pentru cercetare. Masculii adulți WT, Oat1 KO și Oat3 KO au fost găzduiți separat sub un ciclu lumină-întuneric de 12-h și au primit acces ad libitum la hrană și apă. Aceste animale au fost descrise în publicațiile anterioare (26, 27). Şoarecilor trataţi cu probenecid li s-a administrat o injecţie intraperitoneală zilnică de 200 mg/kg probenecid sau PBS timp de 3 zile înainte de sacrificiu. Injecția finală a fost administrată cu 2 ore înainte de sacrificiu. Seturile de date utilizate pentru această analiză au fost, de asemenea, parțial descrise (23, 24). Setul de date Oat1 KO a fost parțial studiat din perspectivă chimioinformatică, dar nu a fost efectuată o analiză detaliată a căii (23). Setul de date Oat3 KO a fost reanalizat și doar două grupuri au fost comparate (24).

Studii umane cu probenecid

Toate protocoalele experimentale au fost revizuite și aprobate de Consiliul de examinare instituțional și respectă Declarația principiilor etice de la Helsinki. Au fost recoltate probe de sânge integral de la 20 de indivizi (14 femele, șase bărbați). Vârsta medie a fost de 30,85 ± 10,98, iar IMC mediu a fost de 24,18 ± 3,52. Participanții care nu luau niciun medicament și urmau diete vegetariene pe durata studiului. S-a administrat o doză orală de 1 gram de probenecid, iar după 5 ore s-a recoltat din nou sânge integral. Fiecare probă a fost păstrată congelată la –80 de grade până la analiza metabolomică.

Metabolomice Probele de ser uman au fost stocate imediat la –80 de grade și expediate pe gheață carbonică la Metabolon Inc. Probele de ser de șoarece au fost colectate și analizate, așa cum s-a descris anterior (23, 24). Pentru a recapitula pe scurt, pentru fiecare probă, a fost efectuată profilarea metabolomică țintită de Metabolon Inc. Sistemul MicroLab STAR de la Hamilton Company a fost utilizat pentru a pregăti fiecare probă și au fost adăugate mai multe standarde de recuperare pentru controlul calității. Serul a fost precipitat cu metanol și agitat cu Glen Mills GenoGrinder 2000 pentru a îndepărta proteinele din ser și a elibera moleculele legate de acele proteine. Soluția rezultată a fost separată în patru probe mai mici. Două au fost analizate prin spectrometrie de masă (MS) cu cromatografie lichidă ultraperformanță (UPLC) în fază inversă (RP) cu ionizare electrospray în modul ion pozitiv (ESI). O probă a fost analizată prin RP/UPLC-MS/MS cu modul de ioni negativi ESI. O probă a fost analizată prin HILIC/UPLC-MS/MS. Solventul organic a fost îndepărtat prin plasarea fiecărei probe pe un TurboVap (Zymark).

Statistici

Atât pentru probele umane, cât și pentru cele de șoarece, valorile brute au fost normalizate la volum, transformate în log, iar valorile lipsă au fost înlocuite cu cea mai mică valoare observată pentru fiecare compus. În probele de ser uman, semnificația statistică a fost determinată folosind contraste ANCOVA care încorporează IMC și vârsta. Pentru probele de ser de șoarece, semnificația a fost determinată utilizând testul t Welch cu două eșantioane cu metaboliți care au obținut semnificație statistică (p mai mic sau egal cu 0.05), precum și cei care se apropie de semnificație ( 0.05 Mai mic sau egal cu p Mai mic sau egal cu 0,10) inclus în analizele ulterioare. Îmbogățirea a fost determinată utilizând ecuația 1, unde k este numărul de metaboliți modificați semnificativ dintr-o cale secundară, m este numărul de metaboliți dintr-o cale secundară, n este numărul de metaboliți modificați semnificativ din setul total de date și N este numărul de metaboliți modificați semnificativ din setul total de date. metaboliți măsurați în setul total de date.

Analiza sarcinilor metabolice

Am folosit analiza sarcinilor metabolice, așa cum este implementată în modulul CellFie din GenePattern, pentru a cuantificarinichifuncțiile metabolice și influența modificărilor transportorului OAT din datele de exprimare a genelor (41) (adică, date microarray de la rinichii Oat1 KO, Oat3 KO și controalele lor de tip sălbatic). Această analiză prezice activitatea unei colecții organizate de sute de sarcini care acoperă șapte activități metabolice majore ale unei celule (generarea de energie, nucleotide, carbohidrați, aminoacizi, lipide, vitamine și cofactor și metabolismul glicanilor) direct din datele transcriptomice prin utilizarea genomului. modele la scară ale metabolismului uman. Mai precis, calculul activității relative a unei sarcini metabolice (adică scorul sarcinii metabolice) se bazează mai întâi pe preprocesarea datelor transcriptomice disponibile și pe atribuirea unui scor de activitate a genei pentru fiecare genă (67). Modelul la scară de genom al metabolismului uman este utilizat în continuare pentru a identifica lista de reacții necesare pentru îndeplinirea fiecărei sarcini metabolice și, făcând aceasta, pentru a identifica lista de gene care pot contribui la dobândirea unei funcții metabolice pe baza regulilor GPR (adică , Regulile de reacție a proteinelor genice). Prin urmare, scorul sarcinii metabolice este calculat ca scorul mediu al activității tuturor genelor care contribuie la o funcție metabolică. Procedând astfel, datele transcriptomice pot fi utilizate direct pentru a cuantifica activitatea relativă a fiecărei funcții metabolice într-o anumită stare.

Teste de transport in vitro

Embrionar umanrinichiCelulele (HEK)-293 care supraexprimă stabil OAT1 și OAT3 uman (Solvo Biotechnology) au fost crescute până la confluența în Dulbecco's Modified Eagle'sMedium (Invitrogen) suplimentat cu 10% ser fetal bovin și 1% penicilină/streptomicina și menținute în 5 procent de CO2 la 37 C. Celulele care exprimă OAT1-au fost selectate în prezența blasticidinei, iar celulele care exprimă OAT3-au fost selectate în prezența puromicinei. Ambele linii celulare au fost testate negative pentru contaminarea cu Mycoplasma. Înainte de testele funcționale, celulele au fost placate pe 96-plăci de godeuri, incubate timp de 24 de ore și suplimentate cu mediu. Experimentele competitive de absorbție au fost efectuate prin incubarea celulelor în soluție tampon cu o concentrație fixă ​​de 10 μM6-carboxifluoresceină și o concentrație diluată în serie a substratului propus începând de la 2 mM. Tamponul a fost îndepărtat după o incubare de 10-minute la temperatura camerei și celulele au fost clătite cu DPBS de trei ori. Fluorescența FL a fost apoi evaluată folosind un cititor de plăci fluorescente FL. Valorile IC50 au fost determinate folosind GraphPad Prism 8.

Valorile intensității fluorescente au fost normalizate astfel încât cea mai mică valoare a fost setată la 0 procente și cea mai mare valoare a fost setată la 100 la sută . După normalizare, datele au fost potrivite unui model neliniar, iar IC50 a fost determinat folosind ecuația 2.

Ki a fost apoi calculat pentru fiecare metabolit folosind ecuația Cheng-Prusoff (Ecuația 3), cu Km pentru celulele hOAT1 HEK293 derivate din experimentele anterioare (68).

Disponibilitatea datelor

Toate datele metabolomice relevante sunt conținute în articol și în materialul suplimentar. Datele transcriptomice sunt disponibile la cerere de la snigam@health.ucsd.edu. ipoteza, a supravegheat proiectul, a conceput experimentele și a scris și editat articolul.

Finanțare și informații suplimentare-Această activitate a fost susținută de un grant de la National Institutes of Health (NIH) către SKN de la Institutul Național de Științe Medicale Generale (NIGMS) (R01GM132938). Sprijinul pentru JCG vine din grantul de formare acordat de Institutul Național de Imagistica Biomedicală și bioinginerie (NIBIB) (T32EB009380) și un supliment la R01GM132938. Această lucrare a fost finanțată parțial prin finanțare generoasă de la NIGMS către NEL (R35GM119850), Institutul Național de Alergie și Boli Infecțioase (NIAID) către NEL (UH2AI153029), o bursă LIFA către AR și o bursă pentru JMG de la guvernul Mexicului ( CONACYT) și Institutul Universității din California pentru Mexic și Statele Unite (UC-MEXUS). Conținutul este responsabilitatea exclusivă a autorilor și nu reprezintă neapărat opiniile oficiale ale NIH. Unele cifre au fost generate folosind Biorender. Acest articol este dedicat memoriei lui Vibha Bhatnagar, MD, MPH.

Conflicte de interes—Autorii declară că nu au niciun conflict de interese cu conținutul acestui articol.

Abrevieri—Abrevierile folosite sunt: ​​AhR, receptor de hidrocarburi aril; BRC, cronicărinichiboala; DMI, interacțiune medicament-metabolit; ESI, ionizare electrospray; HEK, embrion umanrinichi; ILA, acid indol acetic; KO, knockout; RP/UPLC/MS,cromatografie lichidă ultraperformanță în fază inversă–spectrometrie de masă.

Cistanche tubulosa previne bolile de rinichi, faceți clic aici pentru a obține mostra

De la 1Departamentul de Bioinginerie, 2Departamentul de Pediatrie, 3Departamentul de Biologie, 4Divizia de Biostatistică și bioinformatică, Departamentul de Medicină de Familie și Sănătate Publică, 5Departamentul de Medicină de Familie și Preventivă, 6NovoNordisk Foundation Center for Biostainability la UC San Diego și 7Department of Medicine Universitatea din California SanDiego, La Jolla, California, SUA Editat

de Mike Shipston

Referințe

1. LopezNieto, CE, You, GF, Bush, KT, Barros, EJG, Beier, DR și Nigam, SK (1997) Clonarea moleculară și caracterizarea NKT, un produs genetic legat de familia transportorului de cationi organici care este aproape exclusiv exprimată înrinichi. J. Biol. Chim. 272, 6471–6478

2. Brady, KP, Dushkin, H., Fornzler, D., Koike, T., Magner, F., Her, H., Gullans, S., Segre, GV, Green, RM și Beier, DR (1999) ) Un nou transportor presupus mapează mutația osteosclerozei (oc) și nu este exprimat la șoarecele mutant OC. Genomica 56, 254–261

3. Riedmaier, AE, Nies, AT, Schaeffeler, E. și Schwab, M. (2012) Transportatori de anioni organici și implicațiile lor în farmacoterapie.Pharmacol. Apoc. 64, 421–449

4. Ahn, SY și Bhatnagar, V. (2008) Actualizare privind fiziologia moleculară a transportatorilor de anioni organici. Curr. Opinează. Nefrol. Hipertens. 17, 499–505

5. Nigam, SK (2018) Familia de transportoare SLC22: O paradigmă pentru impactul transportatorilor de medicamente asupra căilor metabolice, semnalizării și bolii. Annu. Rev. Pharmacol. 58, 663–687

6. Lowenstein, J. și Grantham, JJ (2016) Renașterea interesului pentru funcția tubulară renală. A.m. J. Physiol. Renal 310, F1351–F1355

7. Govindarajan, R. și Sparreboom, A. (2016) Transportatori de droguri: avansuri și oportunități. Clin. Pharmacol. Acolo. 100, 398–403

8. Tu, GF și Morris, ME (2014) Prefață. În Drug Transporters Molecular Characterization and Role in Drug Disposition, ediția a 2-a. Wiley Ser Drug Disc, Hoboken, NJ. Xix

9. Nigam, SK, Wu, W., Bush, KT, Hoenig, MP, Blantz, RC și Bhatnagar, V. (2015) Handling of drugs, metabolites, and uremic toxins byrinichitransportatori de medicamente tubul proximal. Clin. J. Am. Soc. Nefrol. 10, 2039–2049

10. Bhatnagar, V., Richard, EL, Wu, W., Nievergelt, CM, Lipkowitz, MS, Jeff, J., Maihofer, AX și Nigam, SK (2016) Analiza ABCG2 și a altor transportatori de urati în acidul uric homeostazia în cronicărinichiboala: Rolul potențial al teledetecției și semnalizării. Clin.RinichiJ. 9, 444–453 Rolul OAT1 și OAT3 în metabolismul triptofanului

12 J. Biol. Chim. (2021) 296 100575

11. Nigam, SK și Bhatnagar, V. (2018) Biologia sistemelor transportatorilor de acid uric: rolul teledetecției și semnalizării. Curr. Opinează. Nefrol. Hipertens. 27, 305–313

12. Nigam, SK și Bush, KT (2019) Sindromul uremic al croniciirinichiboala: teledetecție și semnalizare alterate. Nat. Rev. Nephrol. 15, 301–316

13. Saito, H. (2010) Reglarea patofiziologică a transportatorilor organizației renale SLC22A în situații acuterinichivătămare: Implicații farmacologice și toxicologice. Pharmacol. Terapeutul. 125, 79–91

14. Lepist, EI și Ray, AS (2017) Dincolo de interacțiunile medicament-medicament: Efectele inhibiției transportorului asupra antibioticelor, nutrienților și toxinelor. Opinia expertului. Drug Metab. Toxicol. 13, 1075–1087

15. Duan, P., Li, SS, Ai, N., Hu, LQ, Welsh, WJ și You, GF (2012) Potenți inhibitori ai transportatorilor de anioni organici umani 1 și 3 din bibliotecile clinice de medicamente: Descoperire și caracterizare moleculară . Mol. Pharmaceut. 9, 3340–3346

16. Evers, R., Piquette-Miller, M., Polli, JW, Russel, FGM, Sprowl, JA, Tohyama, K., Ware, JA, de Wildt, SN, Xie, W., Brouwer, KLR și Consorțiu, IT (2018) Modificările asociate bolilor în transportatorii de medicamente pot avea un impact asupra farmacocineticii și/sau toxicității medicamentelor: o carte albă de la International Transporter Consortium. Clin. Pharmacol. Ther.104, 900–915

17. Masereeuw, R., Mutsaers, HA, Toyohara, T., Abe, T., Jhawar, S., Sweet, DH și Lowenstein, J. (2014) Therinichiși îndepărtarea toxinei uremice: Glomerul sau tubul? Semin. Nefrol. 34, 191–208

18. Liu, Y., Prentice, KJ, Eversley, JA, Hu, C., Batchuluun, B., Leavey, K., Hansen, JB, Wei, DW, Cox, B., Dai, FHF, Jia, WP și Wheeler, MB (2016) Creșterea rapidă a CMPF poate acționa ca un punct de basculanță în dezvoltarea diabetului. Cell Rep. 14, 2889–2900

19. Prentice, KJ, Luu, L., Allister, EM, Liu, Y., Jun, LS, Sloop, KW, Hardy, AB, Wei, L., Jia, WP, Fantus, IG, Sweet, DH, Sweeney , G., Retnakaran, R., Dai, FF și Wheeler, MB (2014) Metabolitul acidului gras furan CMPF este crescut în diabet și induce disfuncția celulelor beta. Cell Metab. 19, 653–666

20. Engelhart, DC, Granados, JC, Shi, D., Saier, MH, Jr., Baker, ME, Jr., Abagyan, R. și Nigam, SK (2020) Analiza biologiei sistemelor dezvăluie opt subgrupuri de transportoare SLC22, inclusiv OAT, OCT și OCTN.Int. J. Mol. Sci. 21, 1791