Metaboliți secundari ai cianobacteriilor ca ingrediente biotehnologice în produsele cosmetice naturale anti-îmbătrânire 2

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

2.3.Activități biologice

2.3.1.Activitatea Radical Scavenging

Radicalul anion superoxid este un radical liber fiziologic cu o importanță extremă pentru corpul uman. Când există o supraproducție a acestui ROS în timpul respirației aerobe, sau când mecanismele endogene de detoxifiere eșuează sau sunt insuficiente, există un risc crescut de deteriorare oxidativă cu efecte dăunătoare grave. În acest sens, găsirea unor mecanisme de inhibare a efectelor nocive ale Oz* este de o importanță cheie, nu numai în domeniul cosmeticelor, ci și în luarea în considerare a ameliorării și prevenirii unei game largi de boli. Comportamentul de eliminare a O2" al extractelor de cianobacterie este afișat în Figura 1, iar valorile IC sunt rezumate în Tabelul 6.

Extractele apoase au fost semnificativ mai eficiente în eliminarea Oz*- decât extractele de acetonă (Tabelul 6) și au prezentat o activitate dependentă de doză (Figura 1), cu tulpinile de apă dulce ieșind în evidență de tulpinile marine. Cephalothorax lacustris LEGE 15493 a fost cea mai eficientă tulpină, prezentând cea mai mică valoare ICso (65,5 ug extract uscat/mL, p<0.05), followed="" by="" leptolyngbya="" boryana="" lege="" 15486="" and="" nodosilinea="" nodulosa="" lege="" 06104.="" leptolyngbya="" cf.="" ectocarpi="" lege="" 11479="" was="" the="" only="" strain="" that="" did="" not="" reach="" the="" ic5o="" for="" the="" aqueous="" extract="" (table="" 6).="" on="" the="" other="" hand,="" the="" acetone="" extract="" of="" this="" strain="" was="" the="" most="" effective="" in="" o2*-="">

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

O comparație a capacităților antioxidante între diferite cianobacterii este o provocare din cauza diferitelor metode aplicate. Morone și colegii au evaluat capacitatea de captare a radicalilor a extractelor cu etanol (70% v/v) din diferite tulpini de cianobacterie [26], cea mai mică valoare ICso fiind de 822,70 ug/mL pentru Phormidium sp.LEGE 02 05292, în timp ce nu activitate a fost detectată pentru Nodosilinea nodulosa LEGE 06102. Lopes și colegii de muncă au raportat activitate de captare a O2 pentru Nodosilinea (Leptolynbbya) Antarctica LEGE13457 și Cuspidothrix issatschenkoi LEGE 03282 extracte de acetonă, cu valori IC25 și activitate Leptolynly de 28619, ca sp.LEGE 13412 [27]. Autorii au raportat, de asemenea, o eficacitate mai mare în extractele de acetonă în comparație cu extractele de etanol. Un alt studiu realizat de Amaro și colegii de muncă a relevat valori IC50 de 1394 și 826 ug/mL pentru Gloeothece sp. și Scenedesmus obliquus (M2-1), respectiv [37]. Rezultatele obținute aici pentru extractele de acetonă par mai puțin promițătoare decât cele raportate anterior, chiar dacă sunt în același ordin de mărime. Pe de altă parte, extractele apoase au relevat un potențial enorm demn de exploatare în continuare în ceea ce privește aplicațiile cosmetice în domeniul îmbătrânirii pielii.

2.3.2.Inhibarea enzimelor

MMP-urile sunt o familie de enzime extracelulare dependente de zinc, a căror funcție principală este de a remodela și degrada ECM [38], un material asemănător gelului esențial pentru a menține celulele împreună și pentru a oferi o cale pentru nutrienți și oxigen [39]. Modificările componentelor ECM, cum ar fi colagenul și elastina, induse de MMPs sunt baza leziunilor pielii și formării ridurilor [40]. Împreună cu aceste enzime, legate de structura pielii și formarea ridurilor, o alta își asumă un rol crucial în procesul de îmbătrânire datorită activității sale în melanogeneză: tirozinaza. Printre alți factori, expunerea la UVR determină o acumulare a unei cantități anormale de melanină, datorită producției crescute de ROS. Aceste specii reactive afectează activitatea melanocitelor, ceea ce crește conversia tirozinei în melanină prin oxidare, ducând la hiperpigmentare și pete neregulate pe piele [41].

Cistanche poate anti-imbatranire

În căutarea unor alternative naturale la ingredientele anti-îmbătrânire din comerț, concentrându-se pe enzimele menționate mai sus, a fost explorată activitatea extractelor de cianobacterie (Figura 2). În ceea ce privește HAase, doar trei tulpini au fost capabile să inhibe această enzimă, acționând într-o manieră dependentă de doză: extractul apos de Leptolyngbya cf. ectocarpiLEGE 11479 (IC50=863 ug/mL) și extractele de acetonă din Cephalothrix lacustris LEGE 15493 și Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, ultimele două atingând doar IC25 (832 și, respectiv, 995 ug/mL). Chiar dacă aceste valori par ridicate, domeniul lor de activitate a fost similar cu cel al medicamentului de referință cromoglicat disodic (DSCG) (IC50=105 ug/mL). Mai mult, este de menționat că, pentru cea mai mare concentrație testată (1 mg/ml), Leptolyngbya cf. ectocarpi LEGE 11479 a inhibat această enzimă în proporție de 80% (Figura 2), ceea ce face ca acest extract să fie promițător ca ingredient cosmetic.

Puține studii au raportat efectul potențial al compușilor și extractelor de cianobacterie asupra activității hialuronidazei, iar orice comparație asupra potențialului biologic al extractelor ar trebui să țină cont de faptul că metabolismul cianobacterian suferă variații semnificative în funcție de condițiile de cultivare, influențând compoziția chimică a extractelor. Morone și colegii [26] au evaluat efectul extractelor etanolice de Tychonema sp. LEGE 07196 și Cyanobium sp. LEGE 07175 pe hialuronidază și a găsit o activitate inhibitorie mai puternică, cu valori ICso de 182,74 și, respectiv, 208,36 ug/mL. Activitatea extractelor cu etanol a fost raportată și pentru o fracție insolubilă de Spirulina platensis, cu un IC5o de 150 ug/mL[42]. Un alt studiu, realizat de Yamaguchi și Koketsu [19], a arătat că Nostochopsis lobatus MAC0804NAN a produs o cantitate mare de polizaharide cu efect inhibitor ridicat (IC50=7.18 ug/mL). peptida derivată poate fi implicată în inhibarea hialuronidazei [4]. Împreună, aceste rezultate susțin potențialul compușilor și extractelor de cianobacterie ca ingrediente anti-îmbătrânire pentru aplicații cosmeceutice.

Luând în considerare elastaza, doar extractele de acetonă au prezentat o bioactivitate interesantă. Leptolyng-bya cf. ectocarpi LEGE 11479 a fost din nou cea mai activă (Figura 2), fiind singura tulpină care a ajuns la ICso, cu o valoare de 391 ug/mL. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, Cephalothrix lacustris LEGE 15493 și Leptolyngbya boryana LEGE 15486 au atins doar IC25, cu valori de 126, 86 și, respectiv, 99 ug/mL. În ceea ce privește hialuronidază, tulpinile marine s-au dovedit a fi cele mai promițătoare.

Din câte cunoștințele noastre, nu există rapoarte anterioare privind activitatea inhibitoare a elastazei pentru tulpinile explorate aici. În ceea ce privește alte tulpini, s-a descoperit că Nostoc minutum producea peptide de tip microviridine și nostopeptine, cu ICso =1.3 și 11.0 ug/mL [44,45]. Microviridinele B și conținutul din Microcystis aeruginosa au inhibat, de asemenea, eficient elastaza, cu valori ICso de 0.{044 și 0,084 ug/mL [46]. Majoritatea datelor disponibile privind inhibarea elastazei se concentrează pe compușii izolați, astfel încât comparațiile cu extractele din tulpinile noastre sunt dificil de făcut.

Pigmentarea neuniformă a pielii, asociată atât cu îmbătrânirea, cât și cu expunerea la UV, rămâne o preocupare majoră a populației în vârstă și a industriilor cosmetice. Majoritatea studiilor disponibile sunt nesemnificative și folosesc tirozinaza de ciuperci ca model enzimatic, ceea ce face dificilă transpunerea rezultatelor în mediul uman, cu toate acestea, această enzimă are o mare asemănare și omologie cu tirozinaza umană[47]. Astfel, același model enzimatic a fost utilizat aici pentru a explora potențialul extractelor de cianobacterie în inhibarea tirozinazei. În ceea ce privește elastaza, numai extractele de acetonă au fost capabile să inhibe tirozinaza. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 a fost cea mai eficientă (Figura 2), fiind singura tulpină care a atins IC#N (989,26±4,3 ug/mL). Mai jos era Leptolyngbya boryana LEGE 15486, cu IC25=784 78±4,33 ug/ mL și, în sfârșit, Leptolyngbya cf.ectocarpi LEGE 11479, cele mai promițătoare rezultate fiind găsite pentru tulpinile marine.

Morone și colegii [26] au explorat anterior activitatea extractelor etanolice de cianobacterie în același model, dar nu au găsit activitate. Un aspect interesant al acestui lucru este că una dintre tulpinile studiate a fost Nodosilinea nodulosa LEGE 06102, care a arătat cele mai bune rezultate aici, subliniind încă o dată importanța solvenților de extracție în obținerea de extracte bioactive vizate. În ceea ce privește celelalte enzime explorate, studiile care se concentrează pe cianobacterii sunt, de asemenea, rare pentru tirozinază. În munca efectuată de Yabuta și echipa sa [48], sa raportat că extractul de apă fierbinte din Nostochopsis spp. a inhibat semnificativ activitatea tirozinazei (IC50=250 ug/mL). Acesta este un rezultat foarte interesant, având în vedere că rezultă dintr-un extract apos, pentru care nu a fost găsită activitate în studiul de față. Autorii atribuie rezultatul compușilor cu greutate moleculară mică eliberați din PBP prin tratament termic, și anume o porțiune bilină care acționează ca un puternic captator de radicali peroxil. Un alt studiu a evaluat activitatea inhibitorie a extractelor de etanol de Arthrospira platensis (IC50=14,000 ug/mL) și apă (IC50 =72,000 ug/mL), unde valorile au fost atribuite prezenței compușilor fenolici precum acizii ferulic și cafeic în extractul etanolic [49].

2.3.3.Protecție UV

Chiar dacă un număr tot mai mare de companii cosmetice încorporează blocante solare în produsele lor, este încă dificil să convingi consumatorii despre beneficiile utilizării lor zilnice pentru a încetini îmbătrânirea prematură a pielii. Dacă pe de o parte, aplicarea zilnică a blocanților solari este un obicei puțin înrădăcinat, pe de altă parte, există o anumită teamă în utilizarea substanțelor sintetice, din cauza riscurilor nedorite asociate acestora[50]. În continuare, cercetările privind fotoprotecția naturală au crescut considerabil în ultimii ani, având în vedere potențialul lor de biodegradabilitate și toxicitate mai scăzută, făcându-le mai benefice pentru oameni și mediu. Pentru a explora extractele de cianobacterie în acest domeniu, capacitatea acestora de a acționa ca creme de protecție solară a fost evaluată in vitro pentru UVR-B, deoarece este cea mai dăunătoare radiație. Rezultatele găsite pentru extractele apoase și de acetonă de cianobacterii sunt prezentate în Tabelul 7.

În ceea ce privește extractele de acetonă, cea mai promițătoare valoare (19,2) a fost găsită pentru Leptolyngbya boryana LEGE 15486, urmată de Leptolyngbya cf.ectocarpiLEGE 1479 (10,7), ambele la cea mai mică concentrație testată, 200 ug/mL. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 a fost cea mai puțin promițătoare dintre extractele de acetonă. În extractele apoase, cele mai promițătoare rezultate au fost obținute pentru cea mai mare concentrație testată, cu Leptolyngbya boryana LEGE 15486 și Cephalothrix lacustris LEGE 15493 remarcându-se cu valori SPF in vitro de 17,1 și, respectiv, 14,9 (Tabelul 7).prelungirea vieții cistancheDiscutând studiile anterioare în acest domeniu, Hossain și echipa sa [51] au raportat că valoarea SPF pentru extractul de Cephalothrix komarekiana a fost 2,37. Un alt grup a constatat că SPF-ul unui extract metanolic de Aphanizomenon flos-aquae a fost de 4 [52]. Cu toate acestea, informațiile despre concentrația extractului folosit de autori nu au fost disponibile, ceea ce face posibilele comparații dificile.

Numărul tulpinilor de cianobacterie explorate în domeniul cosmeticelor, în special în ceea ce privește SPF, este foarte redus, având în vedere potențialitățile acestor resurse. Rezultatele prezentate aici demonstrează că speciile studiate pot fi opțiuni bune ca fotoprotectori biologici și, eventual, pot acționa ca amplificatori pentru alte creme de protecție solară comercializate în prezent, permițând o reducere a concentrației de creme de protecție solară sintetice în formule. Prin urmare, este crucial să se intensifice cercetările asupra acestor organisme, în special asupra extractelor lor bioactive, care, având un cost semnificativ mai mic, un randament mai mare și o obținere mai rapidă decât compușii izolați, sunt mai ecologici și mai atractivi din punct de vedere economic.

2.4. Discriminarea extractelor de cianobacterie prin analiza PCA

Căutarea de compuși bioactivi din surse naturale, cu potențial de utilizare ca ingrediente în domeniul cosmeticelor a crescut în ultimii ani. Pe lângă faptul că sunt potențial mai puțin toxici și complet biodegradabili, compușii derivați de cianobacterie sunt disponibili din surse regenerabile și pot fi obținuți la costuri reduse într-un mediu controlat.cistanche nzClasificarea extractelor bioactive în funcție de compoziția lor chimică și activitățile biologice poate fi valoroasă pentru a indica potențialele relații. În acest sens, a fost aplicată analiza componentelor principale (PCA), luând în considerare compoziția chimică a extractelor de cianobacterie și bioactivitatea celei mai mari concentrații testate în fiecare test (Figura 3). După cum se poate observa, 72,99 la sută din variabilitate ar putea fi explicată prin primele două dimensiuni: PCl a reprezentat 50,41 la sută din varianță, în timp ce PC2 a fost responsabil pentru 22,58 la sută. Au fost distinse trei grupuri (Figura 3A). ): Gl, implicând extractul apos Leptolyngbya cf.exocarp LEGE 11479; G2, care implică extractele apoase de Cephalothrix lacustris LEGE 15493, Leptolyngbya boryama LEGE 15486 și Nodosilinea nodulosa LEGE 06104; și G3, care implică toate extractele de acetonă. Conform figurii 3B, Gl este chimic distinct de celelalte probe datorită conținutului de PE; Extractele apoase de Cephalothrix lacustris LEGE 15493, Leptolyngbya boryana LEGE 15486 și Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 sunt grupate în funcție de conținutul lor în PC, APC și proteine ​​totale (G2), în timp ce toate extractele de acetonă se găsesc în același grup (G3)due la conținutul lor în carotenoide și clorofila a și derivații acesteia. Sunt afișați compușii dincolo de activitățile enzimatice, cu planurile formate cu axa pozitivă PCl (Figura 3B). Se poate observa că probele cu conținut mai mare de clorofilă a și carotenoide sunt strâns legate de inhibarea elastazei a și a tirozinazei. Acest lucru este demonstrat de corelația puternică pozitivă dintre carotenoizi și elastază (0,725,p<0.01) and="" tyrosinase=""><0.01) inhibition,="" with="" similar="" observations="" between="" chlorophyll="" a="" and="" the="" same="" enzymes=""><0.01 and=""><0.05,respectively). on="" the="" other="" hand,="" hyaluronidase="" inhibition="" is="" more="" correlated="" vvith="" pe="" content="" (figure="" 3b),="" with="" a="" significant="" positive="" correlation="" between="" the="" values=""><0.01).the compounds="" responsible="" for="" the="" radical="" scavenging="" activity="" of="" the="" extracts="" are="" displayed,="" with="" the="" planes="" formed="" with="" the="" pcl="" negative="" axis.="" the="" closest="" correlation="" is="" observed="" for="" tpc=""><0.05); other="" compounds="" such="" as="" total="" proteins,="" pc,and="" apc="" also="" contribute="" to="" the="" activity,="" although="" to="" a="" lower="" extent="" (figure="" 3b).regarding="" the="" spf,="" there="" is="" a="" close="" correlation="" between="" the="" activity="" of="" the="" extracts="" and="" their="" pbp="" content,mainly="" apc=""><0.01)and pc="" (0.838,="" p="" <="" 0.01),="" which="" points="" to="" these="" compounds="" as="" predominantly="" responsible="" for="" blocking="" uv-b="" radiation.="" the="" total="" protein="" content="" also="" contributed="" to="" this="" biological="" activity="" (0.670,=""><0.01), with="" the="" lowest="" contribution="" being="" observed="" for="" pe="" (0.210,p="">0.05).În general, analiza PCA a permis gruparea extractelor în funcție de activitățile biologice afișate în domeniul îmbătrânirii pielii, conducând la concluzia că extractele de acetonă sunt mai eficiente în inhibarea enzimelor responsabile de degradare. a matricei dermice și pierderea structurii pielii, în timp ce extractele apoase sunt mai eficiente în eliminarea radicalilor liberi și în protejarea pielii de efectele dăunătoare ale radiațiilor UV.

Din câte știm, aceasta este prima dată când s-a stabilit o relație între compoziția chimică și activitățile biologice ale extractelor din aceste tulpini de cianobacterie.

3.Materiale și Metode

3.1. Producția de biomasă de cianobacterii

Patru tulpini de cianobacterie filamentoase, Cephalothrix lacustris LEGE 15493 și Lep-tolyngbya boryana LEGE 15486, din ecosistemele de apă dulce braziliană, și Leptolyngbya cf. În acest studiu au fost utilizate ectocarpi LEGE 11479 și Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, din ecosistemele marine portugheze. Tulpinile au fost menținute în Colecția de Cultură de Biotehnologie și Ecotoxicologie Albastră (LEGE CC) la Centrul Interdisciplinar de Cercetare Marină și de Mediu (CIIMAR). În scopul producerii de biomasă, a fost stabilită o schemă de cultură extinsă, începând cu 40 mL în laborator - condiţii controlate, scalate secvenţial până la 4 L. Tulpinile au fost crescute în mediu Z8 [53], suplimentat cu 10 ug/L vitamina B12 şi 25g/LNaCl pentru tulpinile marine. Culturile au fost menținute la 25 de grade, cu o intensitate a luminii de 10 umol fotoni m-2 s{-4 și cu o fotoperioadă de 14 ore lumină: 10 ore întuneric. Biomasa proaspătă a fost colectată după 120 sau 150 de zile de creștere (în funcție de tulpină) prin filtrare și congelată, liofilizată și depozitată la grade -20 până la prepararea extractului.

3.2.Pregătirea extractelor

Două extracte diferite au fost preparate secvenţial din fiecare tulpină: acetonă şi apoasă. Mai întâi, extractul de acetonă a fost preparat, folosind 2 g de biomasă uscată. Biomasa a fost suspendată în acetonă și extrasă timp de 10 minute într-o baie cu ultrasunete (Fisherbrand [FB15053, Loughborough, Marea Britanie). După extracția cu acetonă, granula rezultată a fost lăsată să se usuce în hotă și apoi extrasă cu 70 mL de apă distilată, urmând aceeași procedură. Resturile celulare au fost îndepărtate prin centrifugare la 10,00×× g Gs timp de 5 minute la 4 grade, într-o microcentrifugă HERAEUS MegafugeTM 16R (Thermo ScientificTM, Waltham, MA, SUA). presiune (Evaporator rotativ BUCHIR-210) (extract de acetonă) sau congelat și liofilizat (extract apos). Extracția cu supernatul corespunzător a fost repetată de 3 ori. Extractele uscate au fost păstrate la -20 grade până la analize chimice și biologice ulterioare.

3.3.Teste de celule

3.3.1.Cultura celulară

Pentru evaluarea citotoxicității au fost utilizate keratinocitele umane HaCAT (ATCC), fibroblastele de șoarece 3L1 (ATCC) și celulele endoteliale umane hCMEC (furnizate de Dr. POCouraud (INSERM)). Liniile celulare au fost cultivate în mediu Eagle modificat Dulbecco (DMEM GlutaMAXTM, Gibco, Glasgow, Marea Britanie), suplimentat cu 10 procente (v) ser fetal bovin (Gibco), 1 procente penicilină-streptomicina (Pen-Strep 100 UI). /mL și, respectiv, 10 mg/mL) (Gibco) și 0,1 procente Amfotericină B (Gibco). Întreținerea celulelor și testele au fost efectuate la 37 de grade într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2, iar mediul de cultură a fost reînnoit la fiecare două zile. La 80-90 procente de confluență celulară, celulele aderente au fost spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS, Gibco), detașate cu enzima TrypLEX expres (1×) (Gibco), trecute pentru întreținere și însămânțate pentru testele planificate.

3.3.2.Citotoxicitatea — Testul MTT

Viabilitatea celulară a fost evaluată prin reducerea bromurii de {{{0}}(4,{5-dimetiltiazol-2-il){-2,5-difeniltetrazoliu (MTI, Sigma-Aldrich, Germania), după cum sa raportat anterior [26]. Toate liniile celulare (celule endoteliale, fibroblaste și keratinocite) au fost însămânțate în plăci de godeuri 96-, la o densitate de 1,0 × 10 celule/mL, 3,3 × 104 celule/mL și, respectiv, 2,5 × 104 celule/mL.dimensiunea penisului cistancheDupă 24 de ore de aderență celulară, mediul de cultură a fost îndepărtat, iar celulele au fost expuse timp de 24 și 48 de ore la mediu proaspăt care conține diferite extracte de cianobacterie în cinci concentrații în serie, de la 12,5 la 200 ug/mL. Pentru extractele de acetonă, soluțiile stoc au fost preparate în dimetil sulfoxid (DMSO) (Gibco) și diluate cu DMEM înainte de expunerea celulelor, astfel încât concentrația maximă de DMSO să nu depășească 1 la sută. Extractele apoase au fost preparate în PBS și diluate cu DMEM înainte de expunerea celulelor. Martorul negativ a fost PBS, iar controlul pentru moartea celulelor a fost DMSO 20%. După incubare, s-a efectuat testul de citotoxicitate MIT. Pe scurt, 20 μL de soluție MTT au fost adăugate în fiecare godeu și incubate la 37 de grade timp de 3 ore. După incubare, mediul a fost îndepărtat cu grijă, iar sărurile de formazan de culoare violetă au fost dizolvate în DMSO. Absorbanța a fost citită la 550 nm cu un cititor de microplăci cu detecție multiplă Synergy HT (Biorek, Bad Friedrichshall, Germania) operat de software-ul GEN51M. Testul a fost efectuat în patru exemplare și a fost mediatizat. Pentru reproductibilitate, fiecare test a fost repetat independent de cel puțin trei ori. Citotoxicitatea a fost exprimată ca procent de viabilitate celulară, luând în considerare viabilitatea de 100% în controlul solventului.

3.4. Profilul chimic al extractelor de cianobacterie

3.4.1.Conținutul fenolic total (TPC)

Pentru determinarea TPC-ului extractelor s-a folosit un test colorimetric, bazat pe metodologia Folin-Ciocalteu [54] cu ușoare modificări. Extractele de acetonă au fost solubilizate în DMSO, iar extractele apoase în apă. Pe scurt, 25 μL din fiecare extract （10mg/mL） a fost amestecat complet cu 25 μL de reactiv Folin-Ciocalteu （Sigma-Aldrich）20{{20}} μL de soluție de NagCO3 și 500 μL de apă deionizată. Pentru martor, reactivul Folin-Ciocalteu a fost înlocuit cu apă deionizată. Absorbanța produsului colorat format a fost măsurată la 725 nm, folosind un cititor de microplăci Synergy HT Multi-detecție (Biotek, Bad Friedrichshall, Germania) operat prin software-ul GEN51M. Curbele standard pentru cuantificarea TPC au fost obținute folosind șapte concentrații de acid galic (GA) (0,025 până la 0,5 mg/mL), preparate în același solvent ca extractele care urmează să fie testate (y=2.097x＋0.01560 R²{{ 22}}.9989, pentru acetonă și y=2.204x＋0.01401, R2=0.9982, pentru apă, unde „y” se referă la absorbanță și „x” se referă la concentrație) . Au fost efectuate trei determinări independente în dublu exemplar. Conținutul total de fenolici a fost exprimat ca ug echivalenți GA (GAE) per mg de extract uscat.

3.4.2.Proteine ​​totale

Concentrația totală de proteine ​​a fost determinată utilizând trusa de analiză a proteinei BCA (#23227, Thermo-Scientific). Extractele apoase au fost preparate în apă, în timp ce extractele de acetonă au fost preparate în DMSO. Pe scurt, într-o placă de 96-godeuri, 25 uL din fiecare extract (1 mg/ml) au fost amestecați cu 200 uL de reactiv de lucru. Absorbanța a fost măsurată la 562 nm, utilizând un cititor de microplăci Synergy HT Multi-detecție (Biotek, Bad Friedrichshall, Germania) operat prin software-ul GEN5IM. O curbă standard (y=-126.87x3＋547.73.353 -10.017; R{2=0.999 și y{=162.87x{3-248.51x²＋932.13x -11.715;R{2=0}.99, unde „y” se referă la absorbanță și „x” se referă la concentrație) a fost obținut pentru fiecare extract, utilizând nouă concentrații de albumină (BSA) (25 până la 2000 ug/mL) pentru a cuantifica proteinele. Au fost efectuate trei experimente independente în trei exemplare. Conținutul total de proteine ​​a fost exprimat ca ug de echivalenți de albumină serică bovină (BSA) per mg de extract uscat.

3.4.3.Pigmenti

Pigmenții prezenți atât în ​​extractul apos, cât și în extractul de acetonă au fost cuantificați spectrofotometric. Clorofila a și derivații săi au fost cuantificați folosind o curbă de calibrare obținută cu standardul comercial (Sigma-Aldrich): y=8.0791x-0.0{{19} }22 (R2=0.996), unde „y” se referă la absorbanță și „x” se referă la concentrație. Carotenoizii totale au fost cuantificați ca -caroten (Sigma-Aldrich), prin curba sa de calibrare （y=17.133x＋0,0099; R²=0.990, unde „y” se referă la absorbanță și „x” se referă la concentrație). Concentrația totală de carotenoid a fost exprimată ca ug de -caroten per mg de extract uscat. Curbele de calibrare pentru ambele standarde au fost obținute folosind cinci concentrații diferite (0,001 până la 0,025 mg/mL). Determinările spectrofotometrice au fost efectuate în plăci de godeuri, la 450 nm pentru -caroten și 663 nm pentru clorofila a, folosind un cititor de microplăci cu detecție multiplă Synergy HT (Biotek, Bad Friedrichshall, Germania) operat prin software-ul GEN5TM.

Conținutul de PBP a fost determinat spectrofotometric prin măsurarea absorbanțelor extractelor apoase la diferite lungimi de undă (562,615 și 645 nm) și aplicând formulele corespunzătoare, așa cum a fost descris anterior de Pagels și colab. [34]: Extractele apoase au fost resuspendate la o concentrație finală de 0,5 mg/mL. Experimentul a fost efectuat în trei exemplare, iar rezultatele au fost exprimate în ug/mg de extract uscat. 3.5.Activități biologice

3.5.1.Captarea radicalilor anioni superoxid (O2*-).

Testul de captare a radicalilor liberi a Oz*- a fost efectuat pentru a evalua potențialul antioxidant al extractelor de cianobacterie, conform lui Barbosa și colaboratorii [55], cu modificări minore. Extractele apoase au fost preparate în apă, în timp ce extractele de acetonă au fost preparate în DMSO. Au fost preparate cinci diluții în serie pentru fiecare extract și testate pentru a evalua comportamentul extractelor și valorile IC. Toți reactivii au fost dizolvați în tampon fosfat (19 uM, pH 7,4). Un volum de 50μL din fiecare diluție a fost amestecat cu 50 uM de soluție 166 uM -nicotinamidă adenină dinucleotidă redusă (NADH) și 150 uL de clorură de albastru de nitrotetrazolium 43 uM (NBT) într-o placă 96-godeu. După adăugarea a 50 μL de metosulfat de fenazină 2,7 μM (PMS), activitatea de captare a radicalilor a probelor a fost monitorizată cu un cititor de microplăci Synergy HT Multi-detecție (Biotek, Bad Friedrichshall, Germania) operat prin software-ul GEN51M, în funcție cinetică, la temperatura camerei timp de 2 min la 562 nm. Au fost efectuate trei teste independente în trei exemplare. GA a fost folosit ca martor pozitiv. Rezultatele au fost exprimate ca procent de captare a radicalilor în comparație cu controlul netratat. Rezultatele pentru valorile IC calculate au fost exprimate ca medie ± SD (ug/mL) a cel puțin trei teste independente efectuate în duplicat. Valorile IC și curbele doză-răspuns corespunzătoare au fost calculate cu software-ul Graphpad Prism@ (San Diego, CA, SUA; versiunea 9, pentru MacOS).

3.5.2.Inhibarea hialuronidazei

Testul de inhibare a hialuronidazei a fost ușor modificat față de cel propus de Ferreres și colab.【56】. Pe scurt, 25 μL din fiecare extract (9 mg/mL), 175 μL acid hialuronic （HA）（0,7 mg/mL） și 25 μL de hialuronidază (HAase)（90{{ 14}} U/mL în NaCl0,9 procente ）au fost amestecate într-un tub de reacție. Extractele apoase au fost preparate în apă, iar extractele de acetonă au fost preparate în DMSO. După 30 de minute de incubare la 37 de grade, reacția a fost oprită prin adăugarea a 25 μL de tetraborat de disodiu (0,8 M în apă), urmată de incubare timp de 3 minute la 90 de grade într-o baie de apă. Tuburile de reacție au fost răcite la temperatura camerei înainte de a fi adăugate 375 uL de soluție de DMAB[4-(dimetilamino)benzaldehidă]. După 20 de minute de incubare la 37 de grade, absorbanța produsului colorat format a fost măsurată la 560 nm, într-un cititor de microplăci Synergy, HT Multi-detecție (Biotek, Bad Friedrichshall, Germania) operat prin software-ul GEN5IM. Controlul negativ a fost efectuat în absența extractului. Cromoglicatul disodic (DSCG) a fost utilizat ca martor pozitiv.

Au fost efectuate trei teste independente în trei exemplare, iar rezultatele au fost exprimate ca procent de inhibare a enzimei în comparație cu controlul netratat.

3.5.3.Inhibarea elastazei

Testul de inhibare a elastazei pancreatice porcine a fost efectuat conform lui Mota și colaboratorii[57] cu ușoare modificări. Extractele apoase au fost preparate în apă, în timp ce extractele de acetonă au fost preparate în DMSO. Pe scurt, într-o placă de 96-godeuri, 50 μL de extract au fost amestecați cu 90 uL de tampon HEPES (0,1 M), 10 uL de substrat N-succinil-Ala-Ala-Ala p-nitroanilid (100 uM), 70 uL de tampon acetat (200 mM) și 30 uL de elastază (1 U/mL) Placa a fost incubată la 37 de grade pentru 10 min, iar absorbanța produsului de reacție a fost măsurată la 405 nm, într-un cititor de microplăci Synergy HT Multi-detecție (Biotek, Bad Friedrichshall, Germania) operat prin GEN51M. Controlul negativ a fost efectuat în absența extractului, iar acidul ascorbic a fost utilizat ca martor pozitiv.pulbere de cistancheAu fost efectuate trei teste independente în trei exemplare. Rezultatele au fost exprimate ca procent de inhibare a enzimei în comparație cu controlul netratat.

3.5.4.Inhibarea tirozinazei

Testul de inhibare a tirozinazei a fost efectuat conform lui Adhikari et al.[58] cu mici modificari. Pe scurt, într-o placă de 96-godeuri, 20 μL din fiecare extract au fost amestecați cu 10{0 μL de tirozinază (30 U/mL în tampon fosfat). Extractele apoase au fost preparate în apă, în timp ce extractele de acetonă au fost preparate în DMSO. Amestecul a fost incubat la 30 de grade timp de 8 minute. Apoi, s-au adăugat 80 μL de soluție de L-DOPA (L-3,{4-dihidroxifenilalanină) (2,5 mM în tampon fosfat), iar absorbția (T0, absorbanța la un moment dat „zero”) a fost imediat măsurată cu un cititor de microplăci cu detecție multiplă Synergy HT (Biotek, Bad Friedrichshall, Germania) operat prin software-ul GEN5TM, la 475 nm. Determinarea absorbanței la T0 (înainte de formarea produsului de reacție) a permis eliminarea eventualelor interferențe datorate culorii naturale a extractelor studiate. După 8 minute de incubare la 30 de grade, absorbanța a fost măsurată din nou (T8). Procentul de inhibare a tirozinazei în prezența extractelor de cianobacterie a fost calculat în comparație cu martorul netratat (negativ), unde diferența dintre absorbanțe (T{ {21}}T0) corespunde la 100% din activitatea enzimatică. Controlul negativ a fost efectuat în absența extractului, iar acidul kojic a fost folosit ca martor pozitiv. Au fost efectuate trei teste independente în trei exemplare. Rezultatele au fost exprimate ca procent de inhibare a enzimei în comparație cu controlul netratat.

3.5.5.Factor de protecție solară (SPF)

Factorul de protecție solară in vitro a fost determinat conform lui Rohr și colaboratorii[59], cu ușoare modificări. Extractele apoase au fost preparate în apă, în timp ce extractele de acetonă au fost preparate în acetonă. Pe scurt, absorbanța a 2 mL din fiecare extract (20 și 1000 ug/mL) a fost măsurată într-un spectrofotometru (de la 290 la 320 nm, 5 în 5 nm). SPF a fost calculat folosind formula propusă de Mansur [60]: unde EE（A） este spectrul efectului eritemal, I （A） este spectrul intensității solare, Abs（λ）este absorbanța extractului și CF este corecția factorul (28) determinat folosind o protecție solară comercială cu o valoare SFP cunoscută de 30.

3.6.Analiza statistică

Analiza statistică a fost efectuată utilizând software-ul de statistică IBM SPSS (versiunea 23.0 pentru macOS, IBM Corporation, New York,NY, SUA,2015). Datele au fost analizate pentru normalitate și omogenitatea variațiilor de către Kolmogorov-Smirnov și Leven. teste, apoi supuse unui ANOVA unidirecțional folosind un HSD Tukey (diferență semnificativă sincer) ca test post-doc sau unui test t neîmperecheat. Un test de corelație Pearson a fost utilizat pentru a compara datele de expresie normalizate între profilurile chimice și activitățile biologice ale extractelor de cianobacterii.

3.7. Analiza componentelor principale (PCA)

PCA a fost folosit pentru a transforma un număr de variabile potențial corelate într-un număr de variabile relativ independente, care pot fi clasificate pe baza contribuției lor la explicarea variației întregului set de date[61]. Componentele relativ importante ale tiparelor cu dimensiuni înalte pot fi identificate cu succes. Datele originale cu dimensiuni înalte pot fi mapate într-un spațiu de dimensiuni inferioare și, prin urmare, complexitatea unei probleme de clasificare a modelelor de dimensiuni înalte este mult redusă [62]. Pentru studiul de față, recunoașterea modelelor bazată pe PCA a fost efectuată folosind software-ul de statistică IBM SPSS (versiunea 23.0 pentru macOS, IBM Corporation, New York, NY, SUA, 2015). Matricea de date a constat din metaboliții prezenți în extractele apoase și de acetonă ale celor patru tulpini de cianobacterie și activitatea lor la cea mai mare concentrație testată.

4. Concluzii

Activitatea biologică prezentată de extractele de cianobacterie analizate aici s-a dovedit a fi clar corelată. Conform prezenței PBP-urilor bioactive, extractele apoase au fost cele mai eficiente pentru protecția UV care, împreună cu capacitatea lor de captare a radicalilor, le sugerează ca ingrediente promițătoare pentru a fi utilizate în formulări anti-îmbătrânire menite să prevină îmbătrânirea pielii exacerbată de factori externi. Pe de altă parte, extractele de acetonă s-au dovedit mai eficiente în inhibarea activității enzimelor responsabile de degradarea matricei dermice și pierderea structurii pielii, fiind astfel mai potrivite pentru îmbătrânirea pielii legată de vârstă.extract de salsa cistancheSchema de extracție secvențială pe care o propunem s-ar putea dovedi avantajoasă, permițând obținerea de extracte bioactive chimic diferite prin monetizarea biomasei de cianobacterie, făcând procesul mai durabil și mai atractiv din punct de vedere economic. În total, extractele de cianobacterie s-au dovedit demne de exploatare în continuare în domeniul îmbătrânirii pielii, vizând căutarea de ingrediente naturale, sigure și durabile pentru formulările cosmetice.

Acest articol este extras din Mar. Drugs 2022, 20, 183. https://doi.org/10.3390/md20030183 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs