Expunerea la gazele de evacuare diesel modifică expresia rețelelor implicate în neurodegenerarea în creierul peștilor zebră Partea 2

Prepararea probelor de proteine

Pentru a pregăti probe de proteine, capetele de la 80 până la 100 de larve anesteziate (5 pdf) au fost izolate cu grijă și spălate cu PBS înainte de a fi transferate într-un tampon de liză care a constat din 15% TCA/acetonă prerăcită care conține 0,07% beta-mercaptoetanol (ME). ) și cocktail de inhibitor de protează (necesită producător) într-un volum total de 500 ul.

În ultimii ani, a existat un interes considerabil pentru efectele probelor de proteine ​​asupra memoriei. Din ce în ce mai mulți oameni încep să realizeze importanța dietei pentru sănătate, în special rolul important al proteinelor în corpul uman.

Proteinele sunt materialele de bază ale corpului uman și joacă un rol important în corpul uman. Din această cauză, probele de proteine ​​au devenit un canal important pentru mulți oameni în căutarea sănătății și frumuseții. Pe lângă construirea mușchilor și sculptarea corpului, mostrele de proteine ​​pot îmbunătăți și memoria unei persoane.

Unii oameni de știință au studiat relația dintre proteine ​​și memorie. Ei au descoperit că aportul pe termen lung de suficiente proteine ​​este benefic pentru toate aspectele sănătății fizice, în special pentru memorie. Există tot mai multe dovezi că aportul de proteine ​​din dietă are un impact important asupra funcției și memoriei creierului.

Proteina este o componentă importantă a neuronilor din creierul uman, astfel încât aportul zilnic de proteine ​​are un impact important asupra memoriei și capacității de gândire a oamenilor. Aportul de proteine ​​pe termen lung nu numai că satisface nevoile de proteine ​​ale organismului, dar ajută și creierul să rămână activ și sănătos.

În plus, proteinele pot ajuta organismul să mențină echilibrul zahărului din sânge și să mențină o stare de spirit stabilă. Acest lucru este foarte important pentru menținerea memoriei și a abilităților de gândire. Prin urmare, aportul moderat de proteine ​​poate ajuta la îmbunătățirea diferitelor funcții cognitive și stări emoționale ale corpului uman.

În general, există o relație puternică între probele de proteine ​​și memorie. Creșterea aportului de proteine ​​vă ajută să vă mențineți creierul și corpul sănătoși, îmbunătățind abilitățile de gândire și memoria. Pentru persoanele care au nevoie să-și îmbunătățească memoria, este foarte necesar să consume o cantitate adecvată de proteine. Ar trebui să mâncăm alimente proteice în mod corespunzător și să acordăm atenție meselor rezonabile pentru a menține un corp sănătos și o minte ascuțită. Se poate observa că trebuie să îmbunătățim memoria, iar Cistanche deserticola poate îmbunătăți semnificativ memoria, deoarece Cistanche deserticola are efecte antioxidante, antiinflamatorii și anti-îmbătrânire, care pot ajuta la reducerea oxidarii și a reacțiilor inflamatorii din creier, protejând astfel sănătatea sistemului nervos. În plus, Cistanche deserticola poate promova și creșterea și repararea celulelor nervoase, sporind astfel conectivitatea și funcția rețelelor neuronale. Aceste efecte pot ajuta la îmbunătățirea memoriei, a învățării și a vitezei de gândire și pot preveni, de asemenea, dezvoltarea disfuncției cognitive și a bolilor neurodegenerative.

Faceți clic pe cunoașteți suplimentele pentru a crește memoria

După omogenizare scurtă, proteinele au fost precipitate timp de 12 ore la 20 grade, urmate de centrifugare la 12,000 rpm timp de 5 min la 4 grade. Supernatantul a fost îndepărtat, iar granula proteică a fost spălată de două ori cu acetonă rece (conținând 0.{07% ME și cocktailuri de inhibitori de protează). Peleta de proteină finală a fost dizolvată într-un tampon de liză care conține 7,0 M uree, şi 2,0 M tiouree prin sonicare pe gheaţă.

Probele de proteine ​​solubilizate au fost centrifugate la 15,000 rpm timp de 10 minute la 4 grade pentru a precipita particule insolubile, iar concentrația probelor de proteine ​​​​finale a fost măsurată folosind metoda Bradford.

Analiză proteomică de mare randament bazată pe TMT

Probele au fost reduse, alchilate și digerate prin adăugarea secvențială de tripsină și proteaze lys-C. Peptidele au fost apoi etichetate folosind etichete izobarice 10-plexTMT conform instrucțiunilor producătorului. Probele marcate au fost amestecate și apoi fracționate fin folosind cromatografie cu fază inversă cu pH ridicat.

Fracțiile individuale au fost apoi analizate prin LC-MS/MS utilizând cromatografie în fază inversă online și spectrometrie de masă în tandem pe spectrometrul de masă Thermofsher Fusion Lumos. Datele au fost obținute folosind metoda MS3 bazată pe selecția precursorului sincron, așa cum a fost descris anterior (McAlister et al. 2014). Căutarea în baze de date și extragerea informațiilor despre ionii reporter TMT au fost efectuate folosind platforma software MaxQuant (Cox și Mann 2008).

Compararea datelor TMT între probe a fost efectuată folosind MSStats (Choiet al. 2014). Analiza transcriptomică Aproximativ 80-100 de capete au fost izolate din embrioni anesteziați (120 h), spălate cu PBS și supuse extracției de ARN total folosind Trizol (Sigma Aldrich, Saint Louis). , SUA) reactiv urmând instrucțiunile producătorului.

Calitatea și cantitatea de ARN au fost evaluate utilizând un spectrofotometru NanoDrop2000 (Thermo Scientific, MA) și mai departe de Agilent 2100 Bioanalyzer pentru a asigura concentrația minimă de 50 ng/ul și numărul de integritate a ARN (RIN) de 8. Pregătirea bibliotecii a fost apoi efectuată folosind un Illumina HiSeq4000 conform cu protocolul: „Fluxul de lucru TruSeqStranded Total ARN Library Prep with Ribo-Zero Gold”, iar eșantioanele au fost secvențiate în următoarele condiții: „Paired End run,R1=75 cycles (antisens strand), Index=8 cycles, R2=75 cicluri (catena de sens)."

Analiza datelor

Ambele seturi de date pentru studiile proteomice și transcriptomice au fost încărcate și analizate simultan folosind instrumentul online Metascape, care permite adnotarea genelor pentru diferite specii, inclusiv Danio rerio (Zhou et al. 2019). analizat prin utilizarea software-ului Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Krämer et al. 2014).

Seturi de date care conțin identificatori de genă sau proteină și valorile de expresie corespunzătoare au fost încărcate în aplicație. Fiecare identificator a fost mapat la obiectul său corespunzător în baza de cunoștințe a Ingenuity.

O limită de modificare a expresiei de 1.3-ori a fost stabilită pentru a identifica moleculele a căror expresie a fost reglată diferențial. Analiza funcțională a identificat funcțiile biologice și/sau bolile care au fost cele mai semnificative pentru setul de date. Pentru analiză au fost luate în considerare moleculele din setul de date care au îndeplinit limita și au fost asociate cu funcții biologice. Testul exact al lui Right-tailedFisher a fost utilizat pentru a calcula o valoare p care determină probabilitatea ca fiecare funcție biologică și/sau boală atribuită acelui set de date să fie datorată numai întâmplării.

Analiza căii

Pentru a evalua contribuția fie a modificărilor proteomului, fie a profilului transcriptomului în căi specifice, ambele seturi de date au fost încărcate în software-ul IPA (Krämer et al. 2014). Cele mai importante căi canonice modificate au fost apoi evaluate și interpretate în continuare utilizând PCR și western blot așa cum este descris mai jos.

Western blot

Un total de 25 µg de proteine ​​au fost încărcate pe un NuPAGE 12% (Novex, CA) și transferate pe membranele PVDF (Novex, CA) așa cum este descris (MahmoudianSani și colab. 2017; Rafee și colab. 2019). Membranele au fost blocate cu lapte degresat 5% în soluție tampon Tris și 0,01% tween 20 (tampon TBST) pentru 30 minat temperatura camerei și apoi incubate peste noapte la 4 grade fie cu anti-Cyp1A1 policlonal de iepure (Abcam, CA) fie cu anti-GAPDH monoclonal de șoarece ( Abcam, CA), diluat în tampon TBST care conține 1% lapte degresat.

După spălare în TBST, petele au fost incubate cu anticorpi secundari anti-iepure-HRP (Abcam, CA) sau capră anti-șoarece-HRP (Santa Cruz, CA) timp de 2 ore, urmate de dezvoltare cu substrat de Western blotting Pierce™ ECL Plus ( Thermo Fisher Scientific, SUA). Benzile au fost vizualizate prin imagistică folosind un scaner LI-COR și analizate prin densitometrie (LI_COR Biosciences, NE).

PCR în timp real

ARN-ul total a fost izolat din capete folosind reactiv TRIzol (Sigma Aldrich, Saint Louis, SUA) urmând instrucțiunile producătorului și apoi măsurat folosind un spectrofotometru NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, MA). O cantitate de 1 ug din fiecare probă de ARN a fost transcrisă invers utilizând supermix de transcripție inversă iScript™ (Bio-Rad, CA), iar PCR în timp real a fost efectuată utilizând supermix SsoAdvancedUniversal SYBR Green (Bio-Rad, CA), iar primerii sunt listați. în Tabelul suplimentar 1. Nivelurile de expresie relative au fost calculate folosind metoda 2-ΔΔCT, iar testul statistic T a fost folosit pentru a evalua diferențele semnificative.

Rezultate și discuții

Analizele proteomice și transcriptomice sunt două instrumente majore pentru înțelegerea mecanismelor moleculare care stau la baza proceselor bolii și a răspunsului la stimulii de mediu (Duan și colab. 2017; García-Estrada și colab. 2013; Jami și colab. 2014a, b, 2015; Kosalková și colab. 2012) . Aici, am efectuat analize profunde de expresie atât la nivelurile transcriptomice, cât și la cele proteomice din capetele embrionilor de pește zebra expuși la DEPe.

Capetele, compuse în principal din țesut cerebral, au fost izolate pentru a elimina profilele de expresie ale altor țesuturi, deoarece suntem interesați de determinarea căilor patologice intrinseci ale SNC.

Profilul de expresie al capetelor embrionilor de pește-zebră

Analiza profilului a dat 11.172 de proteine ​​detectate și 14.748 ținte ARNm din peste 26 de gene care codifică000 (Howe și colab. 2013). Dintre cele 11.172 de proteine ​​identificate din probele marcate cu TMT (Tabelul suplimentar 2), 141 de proteine ​​au fost reglate în mod semnificativ, iar 607 au fost reglate în jos (Tabelul suplimentar 3 și Fig. 1a). În mod similar, 367 de transcrieri au fost reglate în sus, iar 149 au fost reglate în jos printre cele 14.748 de transcrieri (Tabelul suplimentar 4) detectate în analiza ARN-seq (Fig. 1b și Tabelul suplimentar 5).
În majoritatea cazurilor, constatările din analizele proteomice și transcriptomice reglate în sus au fost consecvente. De exemplu, proteinele super-regulate includ citocromul P450 Cyp1a, Cyp1c1, subunitatea de proteină care leagă guaninenucleotidele gamma, anexina, izoforma scurtă Plexin B2b, membrul dehidrogenază/reductază (familia SDR) 13-cum ar fi 1, antigenul S ofretina/glanda pineală (arrestin) b și sulfotransferaza6B1.

De asemenea, genele cu cea mai mare transcriptomicupreglare includ citocromul P450 (Cyp1a), ligandul 27a al chemokinei (motivul C–C), represorul A aril-hidrocarbonreceptor, citocromul P450 (Cyp1b) și glicoproteina C din familia Rh. nu au fost întotdeauna foarte corelate.

De exemplu, complexina 2, spectrinul alfa, lanțul ușor miozinei cardiace-1, proteina care interacționează SEC23, subunitatea membranară ATPsintaza EA, citocromul b și proteina deacetilaza dependentă de NAD se numără printre proteinele de top reglate în jos, în timp ce proteina 1a a membranei segmentului retinian , transportor de dizolvat familia 5 (transportor de iodură), omologul B al oncogenei virale FBJ osteosarcomului murin, complexina 4c, antigenul 1a asemănător FOS, opsina 1 și v-fos prezintă cea mai mare reglare descendentă a transcripției (Tabelele 1 și 2).

Anticorpii care recunosc proteinele de pește zebra sunt limitati, dar am confirmat un eșantion din aceste modificări utilizând analiza Western blot. Reglarea în sus a proteinei Cyp1A și reglarea în jos a Complexinei 2 (CPLX2) au fost confirmate folosind GAPDH ca control de încărcare (Fig. 2a). Nivelurile mai ridicate ale transcripției TAT și UGT1B1 și nivelurile mai scăzute ale CHNRB și TH2 au fost, de asemenea, confirmate prin qPCR folosind Elf-alfa ca control intern (Fig. 2b).

Adnotarea genelor

Există mai multe instrumente bioinformatice și software online care pot oferi informații utile despre adnotarea genelor. Printre acestea, Metascape, cu capacitatea de adnotare a genelor pentru Danio rerio (Zhouet al. 2019), a fost folosit în această lucrare.

Ambele seturi de date pentru studiile proteomice și transcriptomice au fost încărcate și analizate simultan folosind acest instrument online. După combinarea rezultatelor modificărilor proteomice și transcriptomice în software, mai multe procese, cum ar fi răspunsul la stimulul xenobiotic, metabolismul xenobioticului de către citocromul P450 și reglarea expresiei circadiane a genei. au fost găsite induse după tratamentul cu DEPe (Fig. 3a).

Această analiză a sugerat, de asemenea, niveluri suprimate ale proceselor biologice, cum ar fi „Percepția vizuală”, „Fototransducția” și „interiorizarea receptorului cuplat cu proteina G”. Modificările profilurilor de expresie legate de vedere nu au fost neașteptate, deoarece tratamentul cu DEPe în timpul dezvoltării timpurii a dus la ochi mai mici (datele nu sunt prezentate).

Semnalizarea metabolismului xenobiotic

Xenobioticele, care sunt compuși chimici naturali sau sintetici străini, pot declanșa răspunsul la stres celular, ducând la diferențiere, proliferare, apoptoză sau necroză. Într-adevăr, organismul trebuie să se protejeze activ împotriva xenobioticelor, precum și a compușilor endogeni toxici și a metaboliților acestora, prin expresia enzimelor și transportatorilor implicați în eliminarea și detoxifierea lor.

Aceste enzime sunt clasificate în trei grupe: enzime de fază I (CYP, ALDH, FMO) care introduc polaritate în xenobiotice; Enzime de fază II (UGT, GST, SULT) care introduc hidrofilicitate prin conjugarea moleculelor hidrofile, cum ar fi sulfatul, acidul glucuronic și glutationul la xenobiotice; și enzimele de fază III (MDR1, OATP2, MRP) care transportă xenobioticele sau conjugații formați în faza II. spre zona extracelulară.

Aceste enzime sunt induse prin cascade de semnalizare care implică receptori specifici (CAR, PXR, AHR) și activarea mediată de MAPK a factorilor de transcripție (NRF2, MAF) (Omiecinski și colab. 2011).

În absența activatorilor, receptorul constitutiv activ (CAR) este localizat în citoplasmă ca complex cu CCRP și HSP90. Dar când este prezent un activator, CAR se translocă în nucleu și se leagă de RXR pentru a forma un heterodimer și se leagă în continuare la mai multe variante ale motivului repetat, cum ar fi DR3, DR4, ER6 și ER8 și contribuie la reglarea expresiei genelor (Tabelul suplimentar 2).

Analiza noastră proteomică a relevat activarea metabolismului xenobiotic. Într-adevăr, reglarea clară a CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (hemoxigenaza 1), CAT (catalaza) și CES1 (carboxilesterază 1) arată inducerea metabolismului de fază I, în timp ce expresia crescută a UGT1A1 (UDP glucuronoziltransferaza familia 1 membru A1 () și GSTP1 glutationS-transferaza pi 1) indică activarea metabolismului de Faza II.

În mod interesant, reglarea în jos a sulfatotransferazelor, cum ar fi SULT1A1 (membrul 1 al familiei de sulfotransferaze 1A), SULT1C2 (membru 2 al familiei sulfotransferazei 1C) și SULT2B1 (membrul 1 al familiei sulfotransferazei 2B), sugerează că creșterea hidrofilității în faza II tinde să apară prin metabolismul gluthcuronic și, de preferință, cu acid glucuronic. , dar nu conjugarea cu sulfat (Fig. 4).

Rezultatele studiului transcriptomic sunt destul de consistente, deoarece CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1 și UGT1A1 sunt toate supraregulate la nivelurile de ARN. Cu toate acestea, SULT2B1 prezintă o reglare ascendentă la nivel de ARN (în timp ce este subreprezentată la nivelurile de proteine).

Acest lucru se poate datora implicării altor mecanisme care induc degradarea sau inactivarea enzimelor sulfat transferaze după tratamentul cu DEPe. Ceea ce este deosebit de surprinzător este că aceste modificări ale metabolismului xenobiotic au avut loc în capul (probabil creier) peștilor. Exprimarea genelor xenobiotice a fost descrisă în sistemul nervos al mamiferelor, dar acesta este primul raport al acestora în creierul peștilor zebra (McMillan și Tyndale 2018).

Aceste constatări sunt în concordanță cu un studiu similar realizat de Shankar și colegii care au testat efectele diferitelor grupuri de hidrocarburi aromatice policiclice (HAP) de mediu asupra dezvoltării embrionilor și au evaluat în continuare impactul fiecărui regim de tratament asupra profilului transcriptomului.

Pe întregul corp de embrioni de 48 hpost-fertilizare (hpf), aceștia au arătat că reglarea Cyp1a atât la nivel de transcripție, cât și la nivel de proteine ​​este un biomarker timpuriu de încredere al activării AHR xenobiotice și al modificărilor transcriptomice în aval (Shankar et al. 2019).

Răspunsul la stres oxidativ mediat2-NRF

Stresul oxidativ poate declanșa apoptoza și necroza și se crede că este implicat în neurodegenerare (Ahmadinejad et al. 2017; Jami et al. 2014b, 2015). Un răspuns major de apărare celulară la stresul oxidativ este inducerea enzimelor antioxidante și detoxifiante.

Factorul 2 (Nrf2) înrudit 2-factorului nuclear-eritroid se leagă de elementele de răspuns antioxidant promotor (ARE) și activează transcripția acestora. Nrf2 inactiv este asociat cu o proteinăKeap1 care leagă actina și este reținută în citoplasmă.

Declanșat de stresul oxidativ, Nrf2 este fosforilat ca răspuns la căile proteinei kinazei C, fosfatidilinozitol 3-kinazei și MAP kinazei. Nrf2 fosforilat se poate transloca apoi în nucleu și se poate lega ARE pentru a transactiva enzimele de detoxifiere și antioxidante (Tabelul suplimentar 3) (Ma 2013).

For more information:1950477648nn@gmail.com