Efecte modulatoare duble ale diosminei asupra proceselor de formare a pietrelor la rinichi de oxalat de calciu: cristalizare, creștere, agregare, adeziunea celulelor cristaline, internalizare în celulele tubulare renale și invazia prin matrice extracelulară
Mar 16, 2022
pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com
Supaporn Khamchuna,b,c,1, Sunisa Yoodeea,1, Vizitați Thongboonkerda,*
aUnitatea de Proteomică Medicală, Biroul pentru Cercetare și Dezvoltare, Facultatea de Medicină Spitalul Siriraj, Universitatea Mahidol, Bangkok 10700, Thailanda
bDepartamentul de Tehnologie Medicală, Școala de Științe ale Sănătății, Universitatea Phayao, Phayao 56000, Thailanda
cUnitatea de Excelență în Biomedicină Moleculară Integrativă, Școala de Științe Conexe ale Sănătății, Universitatea Phayao, Phayao 56000, Thailanda
Cuvinte cheie: Compus bioactiv, Flavonoid, Inhibitor, Modulator, Nefrolitiază, Promotor, Urolitiază
ABSTRACT
Diosmineste un flavon glicozid natural (bioflavonoid) care se găsește în fructe și plante cu mai multe activități farmacologice. A fost utilizat pe scară largă ca supliment alimentar sau agent terapeutic în diferite boli/tulburări. Deși recomandat, dovezi ale mecanismelor sale de protecție împotrivarinichiboala de calcul (nefrolitiază/urolitiază), în special oxalat de calciu (CaOx) monohidrat (COM), care este cel mai frecvent tip, a rămas neclară. În acest studiu, am evaluat astfel sistematic efectelediosmină(la 2,5–160 nM) pe diferite stadii derinichiprocesele de formare a pietrelor, inclusiv cristalizarea COM, creșterea cristalelor, agregarea, aderența celulelor cristaline, internalizarea în celulele tubulare renale și invazia prin matricea extracelulară (ECM). Rezultatele au arătat cădiosminăa avut efecte modulatoare dependente de doză asupra tuturor proceselor de calcul renale COM menționate.Diosmina crescut semnificativ numărul și masa de cristale COM în timpul cristalizării, dar a redus dimensiunea și creșterea cristalului. In timp cediosminăa promovat agregarea cristalelor, a inhibat adeziunea și interiorizarea celulelor cristaline în celulele tubulare renale. În cele din urmă, diosmina a promovat invazia cristalelor prin ECM. Datele noastre oferă dovezi care demonstrează atât efectele de inhibare, cât și de promovare ale diosminei asupra COMrinichiprocesele de formare a pietrei. Pe baza acestor activități modulatoare duale ale diosminei, rolul său anti-urolitiază este îndoielnic și trebuie luate precauții pentru utilizarea sa înrinichiboala de pietre.
1. Introducere
Diosmin(3′,5,7-trihidroxi-4′-metoxiflavona-7-ramnoglucozidă) este un bioflavonoid natural care se găsește frecvent în diferite plante și fructe, în principal Citrus spp. [1,2]. Poate fi sintetizat sau derivat din celălalt flavonoid, hesperidina [1,2]. Diosmina singură sau în combinație cu hesperidina este utilizată pe scară largă ca medicament flebotrop pentru tratamentul tulburărilor venoase și limfatice, cum ar fi insuficiența venoasă cronică și hemoroizii [3,4]. În plus, diosmina prezintă câteva alte activități biologice și farmacologice, inclusiv activități antioxidante și antiinflamatorii [5,6], proprietăți anti-mutagene și anti-neoplazice [7,8], efecte antibiotice [9], proprietăți anti-hiperglicemiante [9] 10] și efectele protectoare împotriva leziunilor multi-organe, de exemplu,
cardiovasculare [11], retiniene [12],rinichi, leziuni hepatice și cerebrale [13].
Rinichiboala de calcul (sau nefrolitiază/urolitiază) este cauzată de calculii solidi dezvoltați și depusi în interiorul rinichilor și afectează oamenii din toate zonele globului cu o rată mare de recurență [14–17]. Dintre toate cristalele cauzale, oxalatul de calciu (CaOx), în special forma monohidrat (COM), este componenta cristalină cea mai patogenă și cea mai comună găsită la formatorii de calculi (pacienții cu calculi renali) [18]. Din punct de vedere mecanic, cristalele COM au cea mai puternică capacitate de aderență și cele mai multe efecte citotoxice asupra celulelor epiteliale tubulare renale [19,20]. În timpul patogenezei calculilor, atât modelul plăcii lui Randall, cât și ipoteza intratubulară au caracteristici comune ale proceselor de formare a pietrelor COM, inclusiv cristalizarea COM, creșterea, agregarea, reținerea prin aderență la suprafață pe celulele tubulare renale sau pelvisul renal, internalizarea în celule și invazia în celule. interstițiul renal prin matricea extracelulară (ECM) [21,22].
Recent, multe studii s-au concentrat pe descoperirea medicamentelor folosind plante medicinale/fructe și compușii lor bioactivi, având ca scop prevenirea formării de pietre noi și/sau recurente. O serie de rapoarte anterioare au arătat că unii compuși bioactivi, în special compușii fenolici (polifenol, flavonoid, flavon glicozid etc.) extrași din mai multe plante/fructe medicinale, au efecte preventive împotriva mecanismelor patogenice alerinichiboala de calcul atât in vitro, cât și in vivo [23–25]. Printre aceste substanțe benefice, câteva rapoarte au sugerat că diosmina poate preveni depunerea cristalelor de CaOx în țesutul renal la modelele animale [26,27]. Cu toate acestea, rolul său modulator precis (inhibare sau promovare) și mecanismele (etape sau procese de formare a pietrelor) în formarea pietrelor la rinichi COM nu au fost investigate. Prezentul studiu a evaluat astfel în mod sistematic efectelediosmină(la 2,5–160 nM) pe diferite stadii derinichiprocesele de formare a pietrelor, inclusiv cristalizarea, creșterea cristalelor, agregarea, adeziunea celulelor cristaline, internalizarea în celulele tubulare renale și invazia prin ECM.
Apasa peDoza de Cistanche tubulosa pentru funcția renală
2. Materiale și metode
2.1. Preparat de Diosmină
Diosmin(Tokyo Chemical Industry; Tokyo, Japonia) a fost dizolvată cu 100% dimetil sulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) și s-au făcut alicote de lucru la concentrațiile finale de 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 și 160 nM pentru investigarea efectelor sale asupra cristalelor COM. În plus, 100% DMSO a fost folosit ca control negativ în toate experimentele.
2.2. Cultură de celule
Linia de celule epiteliale tubulare renale MDCK derivată din segmentul tubular distal al nefronului (ATCC; Manassas, VA) a fost propagată în mediu esențial minim (MEM) Eagle (Gibco; Grand Island, NY) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS), 60 U/ml penicilină G (Sigma-Aldrich) și 60 ug/ml streptomicina (Sigma-Aldrich). Celulele au fost menținute într-un incubator umidificat cu 5% CO2 la 37 ◦C.
2.3. Testul de cristalizare COM
Cristalizarea COM a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [28,29]. Pe scurt, 500 ul de 10 mM CaCl2⋅2H2O în tampon de cristalizare (conținând 10 mM Tris-HCI și 90 mM NaCI) (pH 7,4) s-au adăugat în fiecare godeu al plăcii de godeuri 24- (Corning Inc.; Corning, NY). Un volum egal (4 ul) de tampon de cristalizare (martor martor), DMSO (control negativ) saudiosmină(2,5, 5, 10, 2{0, 40, 80 sau 160 nM) a fost amestecat cu CaCI2. În cele din urmă, s-au adăugat apoi 500 ul de Na2C2O4 1,0 mM în tamponul de cristalizare pentru a face concentrațiile finale de CaCI2 și Na2C204 la 5 mM și, respectiv, 0,5 mM. Amestecul a fost incubat la 25°C timp de 1 oră și apoi examinat. Imaginile cu cristale au fost capturate aleatoriu din cel puțin 15 câmpuri de mare putere (HPF) sub microscopul luminos cu contrast de fază inversat Nikon Eclipse Ti-S (Nikon; Tokyo, Japonia). Dimensiunea și numărul cristalului au fost măsurate de la cel puțin 15 HPF pentru fiecare probă folosind software-ul NIS Element D versiunea 4.11 (Nikon). Masa cristalului a fost calculată din cel puțin 100 de cristale în 15 HPF folosind următoarea formulă: Masa cristalului (µm2/HPF)=Mărimea medie a cristalului în fiecare câmp (µm2) × Numărul de cristale în fiecare câmp (/HPF) ( 1)
2.4. Test de creștere a cristalelor COM
Testul de creștere a cristalelor a fost efectuat așa cum s-a descris anterior [30,31].
Pe scurt, un volum egal (500 ul) de 10 mM CaCl2⋅2H2O și 1,0 mM Na2C2O4 în tampon de cristalizare a fost amestecat (1:1) (v/v) în fiecare godeu al { {12}}plăcuță de puț. Amestecul a fost incubat la 25°C timp de 1 oră pentru a permite cristalizarea completă. În acest moment (T0), un volum egal (4 ul) de tampon de cristalizare (control martor), DMSO (control negativ) saudiosmină(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 sau 160 nM) a fost adăugat în fiecare godeu și amestecul a fost incubat în continuare timp de 60 de minute (T60). La T0 și T60, imaginile cu cristale au fost capturate aleatoriu de la cel puțin 15 HPF-uri sub microscop cu lumină cu contrast de fază inversat Nikon Eclipse Ti-S. Dimensiunile cristalelor la T0 și T60 au fost măsurate folosind software-ul NIS Element D versiunea 4.11 (Nikon), în timp ce creșterea cristalului (reprezentată prin Δ dimensiunea cristalului) a fost calculată din cel puțin 100 de cristale în 15 HPF-uri folosind următoarea formulă: Δ dimensiunea cristalului (µm2)=Mărimea cristalului la T60 − Mărimea cristalului la T0 (2)
2.5. Testul de agregare a cristalelor COM
Testul de agregare a cristalelor a fost efectuat așa cum s-a descris anterior [32,33]. Cristalele COM au fost generate așa cum sa menționat mai sus în testul de creștere a cristalelor, dar cu un volum mai mare într-un tub conic de 50-ml (Corning Inc.) și apoi recoltate prin centrifugare la 2000 g timp de 5 minute. Supernatantul a fost aruncat, în timp ce cristalele COM au fost spălate de trei ori cu metanol. După o altă centrifugare la 2000 g timp de 5 minute, metanolul a fost aruncat și cristalele au fost uscate la aer peste noapte la 25 ◦ C. Cristalele COM (1000 ug greutate uscată) au fost resuspendate în 1 ml de tampon de cristalizare în fiecare godeu al plăcii de godeuri (Corning Inc.). Un volum egal (4 ul) de tampon de cristalizare (martor martor), DMSO (control negativ) saudiosmină(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 sau 160 nM) a fost adăugat în suspensia de cristale COM în fiecare godeu. Placa a fost agitată continuu într-un incubator cu agitare (Zhicheng; Shanghai, China) la 150 rpm și 25 ◦ C timp de 1 oră. După aceea, formarea agregatului de cristal COM (definit ca „un ansamblu de trei sau mai multe cristale COM individuale care s-au unit strâns între ele” [32]) a fost examinată și fotografiată la microscopul luminos cu contrast de fază inversat Nikon Eclipse Ti-S. Numărul de agregate de cristal COM a fost numărat de la cel puțin 15 HPF aleatorii per godeu.
2.6. Testul de aderență a celulelor cristaline COM
Testul de aderență a celulelor cristaline a fost efectuat așa cum s-a descris anterior [34,35]. Pe scurt, cristalele COM au fost generate așa cum s-a menționat mai sus într-un tub conic de 50-ml și apoi recoltate prin centrifugare la 2000 g timp de 5 minute. Supernatantul a fost aruncat, în timp ce cristalele COM au fost spălate de trei ori cu metanol. După o altă centrifugare la 2000 g timp de 5 minute, metanolul a fost aruncat și cristalele au fost uscate la aer peste noapte la 25 ◦ C. Cristalele au fost decontaminate cu radiații UV timp de 30 de minute înainte de intervenția cu celulele.
Celulele MDCK (la o densitate de 2 × 105 celule/godeu) au fost însămânțate și crescute în fiecare godeu al plăcii de godeuri 6- (Corning Inc.) timp de 48 de ore pentru a obține un monostrat confluent. Mediul de cultură a fost apoi împrospătat înainte de adăugarea de cristale COM (100 ug cristale cu greutate uscată per ml mediu de cultură). Un volum egal (4 ul) de tampon de cristalizare (martor martor), DMSO (control negativ) saudiosmină(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 sau 160 nM) a fost adăugat în fiecare godeu. Celulele au fost în continuare incubate într-un incubator umidificat cu 5% CO2 la 37 °C timp de 1 oră. După aceea, celulele au fost spălate energic cu PBS de cinci ori și au fost fotografiate la microscop cu lumină cu contrast de fază inversat Nikon Eclipse Ti-S. Numărul de cristale COM rămase aderate pe suprafața celulei tubulare renale a fost numărat din cel puțin 15 câmpuri aleatorii per godeu.
Cistanche pentru funcția rinichilor
2.7. Testul de internalizare a cristalelor COM
Cristalele COM marcate cu fluorescență au fost generate așa cum s-a descris anterior [36,37]. Compozițiile/concentrațiile de substanțe chimice utilizate pentru cristalizare au fost aceleași ca cele menționate mai sus pentru cristalele simple (nemarcate), dar 0,1 µg/ml izotiocianat de fluoresceină (FITC) (Thermo Scientific Pierce; Rockford, IL) a fost adăugat la soluția de CaCl2⋅2H2O înainte de amestecare cu Na2C2O4. Etapele ulterioare (cristalizarea și recoltarea) au fost efectuate așa cum sa menționat mai sus, dar în întuneric.
Pentru a evalua interiorizarea cristalului în celulele epiteliale tubulare renale, celulele MDCK (la o densitate de 2 × 105 celule/godeu) au fost însămânțate și crescute în fiecare godeu al plăcii de godeuri 6-(Corning Inc.) timp de 48 de ore pentru a obține monostrat confluent. Monostratul celular a fost incubat cu cristale COM marcate cu FITC (1000 ug cristal/ml mediu) într-un incubator umidificat cu 5% CO2 la 37 °C timp de 1 oră. După aceea, celulele au fost spălate cu PBS și incubate cu soluție de tripsină-EDTA pentru a elimina cristalele neinternalizate (atât aderente, cât și neaderente). Procentul de celule cu cristale interiorizate a fost cuantificat dintr-un total de 10.000 de evenimente dobândite folosind un citometru de flux (BD Accuri C6) (BD Biosciences; San Jose, CA). Celulele incubate cu cristale COM simple (nemarcate) au fost utilizate pentru presetarea zgomotului și a pragului pentru semnalul de fluorescență pozitiv. Celulele cu semnale de fluorescență pozitive au fost apoi numărate și utilizate pentru un astfel de calcul procentual.
2.8. Invazia cristalelor COM prin testul ECM
Cristalele COM au fost preparate așa cum s-a descris mai sus pentru agregarea cristalelor și testele de aderență cristal-celulă. Testul de invazie cu cristale a fost efectuat conform protocolului stabilit anterior [38,39]. Pe scurt, un total de 20 µg cristale COM acoperite cu tampon de cristalizare (martor martor), DMSO (control negativ), albumină (Sigma-Aldrich) (control pozitiv) saudiosmină(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 sau 160 nM) au fost adăugate în 200 ul MEM. Ulterior, 200 ul de 0,3 pM Lys-plasminogen (Fitzgerald Industries international; Acton, MA) în PBS au fost amestecați și incubați cu complexul cristal-proteină la 37 ◦ C timp de 1 oră. Plasminogenul nelegat a fost aruncat prin centrifugare la 2000 g timp de 5 minute și peletul a fost spălat cu PBS o dată. După aceea, 100 ul de activator de plasminogen urokinază (uPA) 0,15 pM (Fitzgerald Industries International) în PBS au fost amestecați cu complexul cristal-proteină-plasminogen/plasmină. Amestecul a fost apoi adăugat deasupra gelului de matrice în interiorul camerei de migrare ECM și incubat la 37 °C. După 24-h de incubare, soluția rămasă pe partea superioară a camerei de migrare a fost îndepărtată folosind un tifon sau hârtie de țesut. Cristalele COM invadate din gelul matricei au fost apoi fotografiate folosind un microscop cu lumină cu modul de contrast de interferență diferenţial (DIC) (Nikon H600L). Distanța de invazie a cristalelor a fost măsurată și mediată din cel puțin 15 câmpuri de putere redusă (LPF) din aceeași cameră folosind software-ul NIS Element D versiunea 4.11 (Nikon).
2.9. analize statistice
Toate experimentele de mai sus au fost făcute în trei exemplare (trei experimente independente) și datele cantitative sunt raportate ca medie ± SEM. Au fost efectuate comparații multiple folosind analiza unidirecțională a varianței (ANOVA) cu testul post-hoc al lui Tukey. Testul de corelație Pearson a fost efectuat pentru a determina relația dintre variabile. Toate analizele statistice au fost efectuate folosind software-ul SPSS (versiunea 18) (IBM SPSS; Armonk, NY). Valoarea p mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă statistic.
3. Rezultate
3.1. Efectul diosminei asupra cristalizării COM
Cristalizarea este unul dintre pașii timpurii esențiali airinichiprocese de formare a pietrelor de toate tipurile. După 1-h cristalizare cu sau fărădiosminăla diferite concentrații (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 sau 160 nM), s-au măsurat mărimea și numărul cristalului COM și s-a calculat masa cristalului. Tamponul de cristalizare și diluantul DMSO au servit drept martor și, respectiv, negativ. Datele au arătat că toate dozele (2,5-160 nM) de disomină au redus semnificativ dimensiunea cristalului, dar au crescut numărul de cristale într-o manieră dependentă de doză în comparație cu martorii martor și negativ (Fig. 1A-1C). În concordanță cu numărul de cristale, masa de cristal a crescut în funcție de doză (Fig. 1D). În general, aceste date indică faptul că diosmina promovează cristalizarea COM (neocristale).
3.2. Efectul diosminei asupra creșterii cristalelor COM
Efectul modulator aldiosminăpe COM creșterea cristalelor a fost evaluată prin măsurarea modificării mărimii cristalului (Δ dimensiunea cristalului) după 60-min de incubare ulterioară după finalizarea etapei inițiale de cristalizare, când neocristalele au lipsit. Rezultatele au demonstrat că toate dozele (2,5–160 nM) de disomină au redus semnificativ dimensiunea cristalului Δ într-o manieră dependentă de doză în comparație cu martorul și martorii negativi (Fig. 2). Aceste descoperiri indică faptul că diosmina inhibă creșterea cristalelor COM.
3.3. Efectul diosminei asupra agregării cristalelor COM
Pe lângă creșterea cristalelor, agregarea cristalelor individuale care aderă strâns împreună este un alt pas important în timpulrinichipatogeneza pietrei. Gradul ridicat de agregare a cristalelor poate duce în cele din urmă la mărirea calculilor și la obstrucția micului lumen tubular renal. Comparând cu controalele goale și negative,diosminăla 10–160 nM, numărul crescut în funcție de doză de agregate de cristal COM (Fig. 3). Aceste rezultate indică faptul că diosmina promovează agregarea cristalelor COM.
Cistanche pentru funcția rinichilor
3.4. Efectul diosminei asupra aderenței celulelor cristaline COM
Reținerea cristalelor cauzatoare este unul dintre pașii cruciali pentrurinichiformarea de pietre și poate fi indusă de adeziunea cristalo-celulă care împiedică expulzarea cristalelor împreună cu scurgerea urinei. Am evaluat astfel activitatea modulatoare adiosminăasupra aderenței cristal-celule COM. Datele au arătat că diosmina la 5-160 nM a redus semnificativ capacitatea de aderență a cristalelor COM pe celulele tubulare renale într-o manieră dependentă de doză în comparație cu martorii martor și negativ (Fig. 4). Aceste date indică faptul că diosmina inhibă aderența celulelor cristaline COM.
3.5. Efectul diosminei asupra internalizării cristalelor COM în celulele tubulare renale
După aderență, unele cristale COM pot fi internalizate în celulele tubulare renale și pot provoca mai multe răspunsuri celulare ulterioare [37,40]. Interiorizarea cristalelor a fost evaluată prin utilizarea cristalelor COM marcate cu FITC și cuantificată prin citometrie în flux. Cristale COM simple (fără etichetare) au fost folosite pentru a scădea zgomotul tehnic și pentru a se asigura că intensitatea fluorescenței este din semnalul FITC. În comparație cu martorii martor și negativ, procentul de celule cu cristale interiorizate a fost semnificativ scăzut cudiosminăla 10–160 nM într-o manieră dependentă de doză (Fig. 5). Descoperirile indică faptul că disomina inhibă internalizarea cristalelor COM în celulele tubulare renale.
3.6. Efectul diosminei asupra invaziei cristalelor COM prin ECM
Invazia cristalelor prin ECM este un proces patogen/distructiv în timpulrinichipatogeneza pietrelor care poate declanșa diverse răspunsuri inflamatorii și cascade, agravând astfel mecanismele bolii. Am examinat acest fenomen utilizând un protocol stabilit bazat pe activitatea plasminogen-plasmină a complexului cristal-protein [38,39]. Rezultatele au arătat că toate dozele de disomină (2,5–160 nM) au îmbunătățit semnificativ invazia cristalelor COM prin ECM într-o manieră dependentă de doză (Fig. 6). Interesant,diosminăla 160 nM ar putea promova invazia cristalelor COM comparabilă cu albumina, care este promotorul puternic cunoscut pentru invazia cristalelor COM [41] (Fig. 6). Aceste rezultate indică faptul că diosmina promovează puternic invazia cristalelor COM prin ECM.
Fig. 1. Efectuldiosminăpe cristalizarea COM. Testul de cristalizare a fost efectuat cu un volum egal (4ul) de tampon de cristalizare (martor martor), DMSO (control negativ) sau diosmină (2,5-160 nM). (A): Morfologia cristalului în fiecare stare după cristalizare 1-h. Mărirea originală a fost de 400× pentru toate panourile. (B): Dimensiunea cristalului. (C): Numărul de cristal. (D): Masa de cristal (vezi Formula 1 în „Materiale și metode”) a fost analizată din cel puțin 100 de cristale în 15 HPF. Fiecare bară reprezintă media ± SEM a datelor derivate din 3 experimente independente. *=p< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" dmso.="">
Fig. 2. Efectuldiosminăpe creșterea cristalelor COM. Testul de creștere a cristalelor a fost efectuat după ce cristalizarea a fost completă (pentru a preveni neocristalizarea) cu un volum egal (4ul) de tampon de cristalizare (martor martor), DMSO (control negativ) sau diosmină (2,5–160nM). (A): Morfologia cristalului în fiecare condiție la T0 și T60. Mărirea originală a fost de 400 × pentru toate panourile. (B)-(J): Histograme ale dimensiunilor cristalelor măsurate din cristale individuale la T0 și T60 în fiecare grup. (K): Δ Dimensiunea cristalului (vezi Formula 2 în „Materiale și metode”) a fost analizată din cel puțin 100 de cristale în 15 HPF. Fiecare bară reprezintă media ± SEM a datelor derivate din 3 experimente independente. *= p < 0,05="" față="" de="" controlul="" gol;="" #="p">< 0,05="" față="" de="">
Fig. 3. Efectuldiosminăpe agregarea cristalelor COM. Testul de agregare a cristalelor a fost efectuat cu un volum egal (4 ul) de tampon de cristalizare (martor martor), DMSO (control negativ) sau diosmină (2,5-160 nM). (A): Micrografii ale cristalelor COM agregate (etichetate cu cercuri punctate). Mărirea inițială a fost de 400 × pentru toate panourile. (B): Numărul de agregate de cristal a fost numărat de la cel puțin 15 HPF aleatorii în fiecare godeu. Fiecare bară reprezintă media ± SEM a datelor derivate din 3 experimente independente. *=p< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="" dmso.="">
Fig. 4. Efectuldiosminăasupra aderenței cristal-celule COM. Testul de aderență a celulelor cristaline a fost efectuat cu un volum egal (4 ul) de tampon de cristalizare (martor martor), DMSO (control negativ) sau diosmină (2,5-160 nM). (A): Micrografii ale cristalelor rămase care au aderat strâns pe monostratul celular după îndepărtarea cristalelor nelegate prin spălări viguroase cu PBS. Mărirea originală a fost de 200 × pentru toate panourile. (B): Numărul de cristale aderate a fost numărat din cel puțin 15 câmpuri aleatorii în fiecare godeu. Fiecare bară reprezintă media ± SEM a datelor derivate din 3 experimente independente. *= p<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p"><0.05 vs.="">
Fig. 5. Efectuldiosminăasupra internalizării cristalelor COM în celulele tubulare renale. Testul de internalizare a cristalelor a fost efectuat folosind cristale COM marcate cu FITC (FITC-COM), în timp ce cristalele COM simple (nemarcate) au fost utilizate pentru scăderea de fond/zgomot. Testul a fost efectuat cu un volum egal (4 ul) de tampon de cristalizare (martor martor), DMSO (control negativ) sau diosmină (2,5–160nM). (A): Analiza citometrică în flux a mărimii (axa y) și intensității fluorescenței FITC (axa x) a celulelor după îndepărtarea cristalelor neinternalizate cu 0,1% tripsină/2,5mM EDTA. (B): Procentul de celule cu cristale COM marcate cu FITC interiorizate. Fiecare bară reprezintă media ± SEM a datelor derivate din 3 experimente independente. *= p<0.05 vs.="" fitc-com="" +="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" fitc-com="" +="" dmso.="">
Fig. 6. Efectuldiosminăprivind invazia cristalelor COM prin ECM. Invazia cristalelor prin testul ECM a fost efectuată utilizând cristale COM acoperite cu tampon de cristalizare (control martor), DMSO (control negativ), albumină (control pozitiv) sau diosmină (2,5-160 nM). (A): Micrografii ale cristalelor COM invadate sau migrate prin camera de migrare ECM. Mărirea originală a fost de 100 × pentru toate panourile. (B): Distanța de invazie a cristalelor a fost măsurată de la cel puțin 15 LPF aleatorii în fiecare cameră. Fiecare bară reprezintă media ± SEM a datelor derivate din 3 experimente independente. *= p<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="">
4. Discutie
Boala de pietre la rinichi este cauzată de formarea de calculi în interiorulrinichiși sistemul pelvocaliceal. Procesele obișnuite de formare a pietrelor la rinichi includ cristalizarea COM, creșterea, agregarea, retenția prin aderența celulelor cristaline și invazia prin interstițiul renal bogat în ECM [21,22]. Există mai multe încercări de a preveni această boală folosind o varietate de medicamente și/sau suplimente nutritive. Multe linii de dovezi recente au raportat că flavonoidele, glicozidele de flavone și alți compuși extrași din fructele citrice pot avea efecte preventive asupra bolii pietrelor la rinichi și a altor tulburări [23–25]. Printre acestea,diosmină, o flavonă glicozidă naturală și un derivat de hesperidină găsit în principal în citrice [1,2], s-a sugerat că joacă un rol preventiv împotriva rănilor și deteriorariirinichițesut [13,42]. Mai mult, rolul său anti-urolitiază a fost raportat în câteva studii anterioare folosind modele animale [26,27]. Cu toate acestea, efectele benefice și mecanismele de bază ale diosminei în prevenirea pietrelor la rinichi au rămas neclare. Astfel, am examinat activitatea modulatoare a diosminei pe cristalele COM. Analizele sistematice au fost efectuate pe diferite etape ale COMrinichiformarea pietrelor, inclusiv cristalizarea, creșterea cristalelor, agregarea, aderența celulelor cristaline, internalizarea în celulele tubulare renale și invazia prin ECM.
După administrarea orală dediosmină, nivelul său plasmatic la om variază de la {{0}},5 la 200ng/ml (sau 0,8–300nM) [43,44]. Concentrația plasmatică maximă (Cmax) este de aproximativ 50ng/ml (sau 85nM) [43,44]. Prin urmare, dozele de diosmină utilizate în studiul nostru de față (2,5–160 nM) au fost în intervalul relevant din punct de vedere farmacologic pentru farmacocinetica sa. Deoarece DMSO a fost folosit ca diluant pentru a dizolva complet diosmina conform recomandarii, DMSO a fost folosit ca control negativ în acest studiu, în plus față de controlul martor, pentru a se asigura că nu au existat efecte ale diluantului în sine care ar putea interfera cu interpretarea datelor. În toate testele, datele au arătat că nu au fost observate efecte semnificative ale DMSO și toate datele cantitative derivate din controlul negativ au fost comparabile cu cele ale martorului.
Testul de cristalizare COM a arătat că toate concentrațiile dediosmină(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 și 160 nM) ar putea reduce dimensiunea cristalului COM, dar, pe de altă parte, a crescut numărul de cristale. Deoarece masa cristalului este produsul final atât al mărimii cât și al numărului cristalului și este mai relevantă pentru a reflecta gradul de cristalizare COM, am evaluat apoi dacă diosmina a afectat acest indice de cristal. Datele au arătat că toate concentrațiile de diosmină au avut efect de promovare asupra masei cristalului COM, în concordanță cu datele privind numărul de cristale. După cristalizare, cristalele COM pot crește în continuare la dimensiunea mai mare pentru următoarea etapărinichiformatiune de piatra.
Spre deosebire de cristalizare, diosmina la toate concentrațiile a prezentat efectul inhibitor asupra creșterii cristalelor COM în mod dependent de doză. Unele studii anterioare au raportat că solubilitatea cristalelor de CaOx poate fi crescută de derivații de hidroxiantrachinone cu glicozilare [45]. În plus, prezența zaharurilor în astfel de compuși bioactivi se poate lega cu ionul de calciu liber, posibil datorită grupărilor hidroxil din structura moleculară, inhibând astfel formarea cristalelor de CaOx [45,46]. Diosmina ar putea afecta, de asemenea, tranziția ionilor de calciu și oxalat solubilizați în particulele cristaline COM din fluidul tubular renal în procesul de cristalizare COM bazat pe acest mecanism.
Cu toate acestea, agregarea cristalelor COM a fost promovată cu 10-160 nMdiosmină, implicând capacitatea diosminei de a acționa ca un linker sau moleculă adezivă pentru recrutarea cristalelor individuale pentru a se lega împreună pentru a forma agregatele de cristale. Această legare are ca rezultat, de asemenea, progresia punților adezive între cristalele individuale și poate induce formarea structurii mari a cristalelor COM, care contribuie cu ușurință la depunerea nidurilor de piatră în interiorulrinichi[32].
Retenția cristalelor COM prin aderența cristalelor pe suprafețele celulelor tubulare renale a fost stabilită ca un alt pas important pentru formarea pietrelor la rinichi [47]. Datele noastre au arătat că diosmina ar putea reduce capacitatea de aderență a cristalelor COM de a se lega de suprafețele apicale ale celulelor tubulare renale MDCK. Unele studii anterioare au arătat că glicozaminoglicanii (compuși polizaharidici) acoperiți pe cristale de CaOx sau exprimați pe celulele tubulare renale pot interfera cu capacitatea de aderență a cristalelor de CaOx pe celulele tubulare renale [48]. În plus, expresia receptorilor de cristal pe celulele tubulare renale este unul dintre mecanismele cruciale care determină adeziunea cristal-celulă [21]. În timp ce cristalele de CaOx induc leziuni ale membranelor apicale, în special ale microvilozităților, unii polifenoli, cum ar fi galatul de epigalocatechină (EGCG) pot preveni adeziunea celulelor cristaline și leziunile celulare [49]. Mai mult, s-a raportat anterior că substanța flavonoidă din diferite extracte de plante crește nivelul pH-ului urinar, ceea ce duce la inhibarea aderenței celulelor cristaline [50,51]. Poate,diosminăar putea, de asemenea, atenua astfel de leziuni celulare induse de COM, reducând astfel aderența celulelor cristaline.
S-a demonstrat că internalizarea cristalelor COM apare în principal prin endocitoză prin calea de macropinocitoză mediată de citoscheletul de actină [40]. S-a raportat că flavonoidele precum quercetina afectează citoscheletul de actină necesar pentru macropinocitoză [52,53]. Descoperirile noastre au arătat că diosmina a redus semnificativ capacitatea celulelor MDCK de a internaliza cristalele COM. Un astfel de efect inhibitor al diosminei ar putea fi asociat cu asamblarea sau organizarea citoscheletului de actină în interiorul celulelor care afectează direct calea macropinocitozei [54,55].
După internalizare, cristalele COM au fost degradate de endolizozomi, ducând la creșterea ionilor liberi de calciu și oxalat în interstițiul renal [37]. Astfel de creșteri ale ionilor de calciu și oxalat pot duce la neocristalizarea COM în interstițiul renal [56,57]. În plus, prezența cristalelor COM interstițiale poate fi din defecte ale joncțiunii strânse și ale barierelor de aderență paracelulare, ceea ce duce la creșterea permeabilității paracelulare și a translocației cristalelor [58–60]. Aceste cristale pot invada apoi interstițiul renal prin ECM și, ulterior, pot declanșa mai multe răspunsuri inflamatorii și leziuni tisulare [58-60]. În acest studiu, am observat că invazia cristalelor COM prin camera de migrare a ECM a fost indusă de toate concentrațiile de diosmină. Diosmina s-ar putea lega de suprafețele cristalului COM și a interacționat cu sistemul plasminogen-plasmină care a condus migrarea cristalelor în camera de migrare a ECM [38,39].
Cistanche pentru rinichi
pentru cădiosminăa indus atât efecte de inhibare, cât și de promovare asupra diferitelor procese diferite de formare a pietrei COM, prin urmare am determinat relația lor folosind testul de corelație Pearson. Analiza corelației a arătat că numărul de cristale a corelat invers atât cu dimensiunea cristalului, cât și cu creșterea cristalului (Δ dimensiunea cristalului) (Fig. 7A și B). Dimensiunea cristalului s-a corelat puternic cu creșterea cristalului (Fig. 7C), dar a corelat invers cu masa cristalului (Fig. 7D). În cele din urmă, masa de cristal s-a corelat puternic atât cu numărul de cristale, cât și cu agregarea cristalelor (Fig. 7E și F). Din analiza corelației, datele indică faptul că numărul cristalului și masa cristalului sunt mai relevante pentru a reflecta cristalizarea decât dimensiunea cristalului (Fig. 7A, D și E). În plus, dimensiunea neocristalelor în timpul cristalizării este legată de creșterea cristalelor preformate (Fig. 7C), în timp ce gradul de cristalizare (așa cum se reflectă prin numărul de cristale și masa cristalului) este strâns legat de gradul de agregare a cristalelor (Fig. 7E și F). Cu toate acestea, aceste corelații sunt cel mai probabil specifice efectelor diosminei, în timp ce efectele altor modulatori pot avea sau nu aceleași corelații. De exemplu, fibronectina scade masa cristalului și inhibă creșterea cristalelor, dar promovează agregarea cristalelor [31]. În plus, Escherichia coli viabilă intactă crește dimensiunea și masa cristalului, dar nu are efecte asupra numărului de cristale [33]. Aceste date indică faptul că corelațiile dintre diferitele teste de cristale COM nu sunt universale pentru toți modulatorii.
În sfârșit, am rezumat rezultatele obținute din diverse teste și le-am integrat cu mecanismele patogene alerinichiboala de calcul (vezi schema din Fig. 8). Din analiza corelației, diosmina promovează cristalizarea (Fig. 8A). Între cristalizare și creșterea cristalelor,diosminămenține un echilibru bine prin promovarea cristalizării dar, pe de altă parte, inhibă creșterea cristalelor (Fig. 8B). În ceea ce privește toate efectele numai asupra cristalelor COM (fără a lua în considerare celulele și ECM care intervin și ele), activitatea de promovare a diosminei este mai proeminentă decât activitatea sa de inhibare asupra cristalelor COM, deoarece promovează atât cristalizarea, cât și agregarea cristalelor, dar inhibă doar creșterea cristalelor ( Fig. 8C). Deși cristalizarea crește, dimensiunea cristalului scade și este asociată cu inhibarea creșterii (Fig. 7C). Aceste date sunt în concordanță cu rezultatele raportate de Kavanagh și colab. [61–63], demonstrând că creșterea cristalizării duce la scăderea suprasaturației ionilor de calciu și oxalat în soluție, scăzând astfel creșterea. Cu toate acestea, creșterea cristalelor nu este singurul factor care determinărinichipatogeneza pietrei [64], în special atunci când masa cristalină copleșește și este asociată cu creșterea agregării cristalelor (Fig. 7F), care poate crește șansa ca materialele cristaline să se blocheze în segmente tubulare mici (în ipoteza intratubulară), crescând astfel șansa formării pietrelor. Mai mult, un studiu anterior a arătat datele în concordanță cu constatările noastre, indicând că creșterea numărului de cristale este asociată cu creșterea agregării cristalelor și mărirea pietrei [63].
Fig. 7. Analiza corelaţiilor. (A)–(F): Corelațiile dintre numărul de cristal COM, dimensiunea cristalului, Δ dimensiunea cristalului, masa cristalului și un număr de agregate de cristal au fost analizate prin testul de corelație Pearson.
Fig. 8. Scheme care rezumă efectele modulatorii alediosminăpe COMrinichiprocesele de formare a pietrei. (A): Efectele diosminei asupra cristalizării COM. (B): Efectele diosminei asupra cristalizării COM și creșterii cristalelor. (C): Efectele diosminei asupra cristalizării, creșterii și agregării COM. (D): Efectele diosminei asupra întregului proces de formare a pietrelor la rinichi COM.
Când sunt luate în considerare interacțiunile cu celulele tubulare renale și ECM, imaginea globală a efectelor duale alediosminăpe COM formarea pietrelor la rinichi devine mult mai clară (Fig. 8D). Diosmina inhibă aderența celulelor cristaline, reducând astfel internalizarea cristalului în celule. Acest lucru poate fi explicat că dimensiunea mai mică a cristalelor COM are o capacitate de aderență mai mică de a lega celulele tubulare renale în comparație cu cele mai mari, așa cum sa raportat în studiul nostru recent [34] și în studiul anterior al unui alt grup [65]. Capacitatea de aderență mai mică a cristalelor COM mai mici se datorează forței lor mai puțin adezive la suprafața celulei și numărului mai mic de receptori de cristal COM legați de ele, așa cum este determinat de microscopia cu forță atomică și, respectiv, analiza proteomului [34]. Diosmina inhibă, de asemenea, interiorizarea cristalelor. Rețineți că procesul de internalizare este o sabie cu două tăișuri care necesită o interpretare atentă. Interiorizarea sau endocitoza într-unul dintre mecanismele de apărare pe care celulele le foloseau pentru eliminarea cristalelor de către endolizozomi. Cu toate acestea, degradarea cristalelor intacte generează ioni liberi de calciu și oxalat care se pot muta din compartimentul intracelular în interstițiul renal, unde pot genera neocristale [56,57]. Pe de altă parte, diosmina promovează invazia cristalelor prin ECM, care este unul dintre mecanismele importante pentru patogenia pietrelor la rinichi (în special în modelul plăcii lui Randall) [58–60]. În general, Fig. 8D rezumă toate efectele modulatorii duale ale diosminei asupra COMrinichiprocesele de formare a pietrei. Trebuie remarcat faptul că echilibrul acestor efecte de promovare și inhibare nu poate fi calculat cu precizie (spre deosebire de o ecuație matematică). Mai mult, există câțiva alți factori endogeni și exogeni care pot interveni și în procesele de formare a pietrelor. În cele din urmă, diosmina prezintă, de asemenea, câteva efecte indirecte asupra formării pietrelor la rinichi, inclusiv proprietățile sale antioxidante și antiinflamatorii [5,6] care ar trebui luate în considerare. Prin urmare, rezultatul final al acestor efecte modulatorii duale dediosminăpe COMrinichiformarea pietrelor necesită investigații suplimentare in vivo și un studiu prospectiv pe o cohortă mare.
5. Concluzii
În rezumat, raportăm aici efectele duale ale diosminei asupra modulării cristalelor COM într-o manieră dependentă de doză. În timp ce inhibă creșterea cristalelor COM, aderența celulelor cristaline și internalizarea în celulele tubulare renale,diosminăpromovează cristalizarea COM, agregarea și invazia prin ECM. Prin urmare, rolul său anti-urolitiază este îndoielnic și trebuie luate precauții pentru utilizarea sa în bolile de pietre la rinichi.
Declarație de contribuție a autorului CRedit
Supaporn Khamchun: Conceptualizare, Metodologie, Software, Validare, Analiză formală, Investigație, Curare datelor, Scriere – schiță originală, Vizualizare, Sunisa Yoodee: Conceptualizare, Metodologie, Software, Validare, Analiză formală, Investigare, Curare date, Scriere – schiță originală, Vizualizare, Vizitați Thongboonkerd: Conceptualizare, Metodologie, Software, Validare, Resurse, Scriere – revizuire și editare, Supraveghere, Administrare proiecte, Achiziție de finanțare.
Declarație de conflict de interese
Autorii declară NU conflict de interese.
Mulțumiri
Suntem recunoscători pentru asistența tehnică a lui Kittiya Suwannakud. Această lucrare a fost susținută de Biroul Național al Învățământului Superior, Consiliul Politicii de Cercetare și Inovare (NXPO) prin PMU-B și Fondul de Cercetare din Thailanda (IRN60W0004). VT este susținută și de Grantul „Chalermphrakiat”, Facultatea de Medicină Spitalul Siriraj.
Referințe
[1] A. Bogucka-Kocka, M. Wozniak, M. Feldo, J. Kockic, K. Szewczyk,Diosmin– tehnici de izolare, determinare în material vegetal și formulări farmaceutice și utilizare clinică, Nat. Prod. comun. 8 (2013) 545–550.
[2] Y. Zheng, R. Zhang, W. Shi, L. Li, H. Liu, Z. Chen, L. Wu, Metabolismul și activitățile farmacologice ale compusului natural benefic pentru sănătate diosmin, Food Funct. 11 (2020) 8472–8492.
[3] MR Cesarone, G. Belcaro, L. Pellegrini, A. Ledda, G. Vinciguerra, A. Ricci, A. Di Renzo, I. Ruffini, G. Gizzi, E. Ippolito, F. Fano, M. Dugall , G. Acerbi, U. Cornelli, M. Hosoi, M. Cacchio, Venoruton vs Daflon: evaluarea efectelor asupra calității vieții în insuficiența venoasă cronică, Angiology 57 (2006) 131–138.
[4] KA Lyseng-Williamson, CM Perry, Fracția de flavonoid purificată micronizat: o revizuire a utilizării sale în insuficiența venoasă cronică, ulcere venoase și hemoroizi, Drugs 63 (2003) 71-100.
[5] AS Shalkami, M. Hassan, AG Bakr, Antiinflamator, activitatea antioxidantă și anti-apoptotică a diosminei în colita ulcerativă indusă de acid acetic, Hum. Exp. Toxicol. 37 (2018) 78–86.
[6] M. Berkoz, Diosmin suprimă mediatorii proinflamatori în macrofagele RAW264.7 induse de lipopolizaharide prin căile de semnal NF-kappaB și MAPK, Gen. Physiol. Biophys. 38 (2019) 315–324.
[7] M. Rajasekar, K. Suresh, K. Sivakumar, Diosmin induc apoptoza prin modularea semnalizării STAT-3 în carcinogeneza pungii bucale de harmster indusă de 7,12 dimetilbenz(a)antracen, Biomed. Farmacia. 83 (2016) 1064–1070.
[8] A. Lewinska, J. Adamczyk-Grochala, E. Kwasniewicz, A. Deregowska, M. Wnuk, senescența indusă de Diosmină, apoptoza și autofagia în celulele cancerului de sân cu diferite stări p53 și activitate ERK, Toxicol. Lett. 265 (2017) 117–130.
[9] AC Pushkaran, V. Vinod, M. Vanuopadath, SS Nair, SV Nair, AK Vasudevan, R. Biswas, CG Mohan, Combinația de medicament reutilizat diosmin cu amoxicilină-acid clavulanic provoacă inhibarea sinergică a creșterii micobacteriene, Sci. Rep. 9 (2019) 6800.
[10] CC Hsu, MH Lin, JT Cheng, MC Wu, Acțiunea antihiperglicemică a diosminei, un flavonoid din citrice, este indusă prin beta-endorfină endogene la șobolanii diabetici de tip I, Clin. Exp. Farmacia. Physiol. 44 (2017) 549–555.
[11] O. Senthamizhselvan, J. Manivannan, T. Silambarasan, B. Raja,Diosminpretratamentul îmbunătățește funcția cardiacă și suprimă stresul oxidativ în inima de șobolan după ischemie/reperfuzie, Eur. J. Pharm. 736 (2014) 131–137.
[12] N. Tong, Z. Zhang, Y. Gong, L. Yin, X. Wu, Diosmin protejează retina șobolanului de leziuni de ischemie/reperfuzie, J. Ocul. Farmacia. Acolo. 28 (2012) 459–466.
[13] AE Elhelaly, G. AlBasher, S. Alfarraj, R. Almeer, EI Bahbah, MMA Fouda, SG Bungau, L. Aleya, MM Abdel-Daim, Efecte protectoare ale hesperidinei și diosminei împotriva ficatului, rinichiului indus de acrilamidă, și leziuni oxidative ale creierului la șobolani, Environ. Sci. Poluarea. Res. Int. 26 (2019) 35151–35162.
[14] C. Thongprayoon, AE Krambeck, AD Rule, Determinarea adevăratei sarcini arinichiboala de pietre, Nat. Rev. Nephrol. 16 (2020) 736–746.
[15] K. Bishop, T. Momah, J. Ricks, Nefrolitiaza, Prim. Care 47 (2020) 661–671.
[16] A. Viljoen, R. Chaudhry, J. Bycroft, Pietre renale, Ann. Clin. Biochem 56 (2019) 15–27.
[17] PM Ferraro, R. Marano, A. Primiano, J. Gervasoni, M. Bargagli, G. Rovere, PF Bassi, G. Gambaro, Stone composition and vascular calcifications in patients with nefrolithiase, J. Nephrol. 32 (2019) 589–594.
[18] G. Schubert, Stone analysis, Urol. Res. 34 (2006) 146–150.
[19] A. Vinaiphat, S. Aluksanasuwan, J. Manissorn, S. Sutthimethakorn, V. Thongboonkerd, Răspunsul celulelor tubulare renale la tipuri și doze diferențiale de cristale de oxalat de calciu: analiză integrativă a rețelei de proteome și investigații funcționale, Proteomics 17 (2017). ), 1700192.
[20] P. Peerapen, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Analiza rețelei de proteine și studii funcționale ale citotoxicității induse de cristale de oxalat de calciu în celulele epiteliale tubulare renale, Proteomics 18 (2018), 1800008.
[21] KP Aggarwal, S. Narula, M. Kakkar, C. Tandon, Nefrolitiaza: mecanism molecular de formare a calculilor renali și rolul critic jucat de modulatori, Biomed. Res. Int. 2013 (2013), 292953.
[22] VN Ratkalkar, JG Kleinman, Mecanisme de formare a pietrei, Clin. Rev. Miner de oase. Metab. 9 (2011) 187–197.
[23] X. Zeng, Y. Xi, W. Jiang, Rolurile protectoare ale flavonoidelor și extractelor de plante bogate în flavonoide împotriva urolitiază: o revizuire, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 59 (2019) 2125–2135.
[24] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi, MH Farzaei, S. Zingue, SM Nabavi, A. Bishayee, Plante dietetice pentru prevenirea și managementulrinichipietre: dovezi preclinice și clinice și mecanisme moleculare, Int. J. Mol. Sci. 19 (2018) 765.
[25] S. Ahmed, MM Hasan, H. Khan, ZA Mahmood, S. Patel, The mechanistic insight of polyphenols in calcium oxalate urolithiazis mitigation, Biomed. Farmacia. 106 (2018) 1292–1299.
[26] VV Prabhu, D. Sathyamurthy, A. Ramasamy, S. Das, M. Anuradha, S. Pachiappan, Evaluarea efectelor protectoare ale diosminei (un flavonoid din citrice) în urolitiaza indusă de substanțe chimice la șobolani experimentali, Pharm. Biol. 54 (2016) 1513–1521.
[27] A. Noorafshan, S. Karbalay-Doust, F. Karimi,Diosminreduce depunerea de oxalat de calciu și degenerarea țesuturilor în nefrolitiaza la șobolani: un studiu stereologic, coreean J. Urol. 54 (2013) 252–257.
[28] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Chutipongtanate, Factori care determină tipurile și morfologiile cristalelor de oxalat de calciu: concentrații molare, tamponare, pH, agitare și temperatură, Clin. Chim. Acta 367 (2006) 120–131.
[29] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Sinchaikul, ST Chen, Analiza proteomică a citotoxicității induse de cristale de oxalat de calciu monohidrat în celulele tubulare renale distale, J. Proteome Res. 7 (2008) 4689–4700.
[30] P. Amimanan, R. Tavichakorntrakool, K. Fong-ngern, P. Sribenjalux, A. Lulitanond, V. Prasongwatana, C. Wongkham, P. Boonsiri, WJ Umka, V. Thongboonkerd, Elongation factor Tu on Escherichia coli izolat din urina pacienților cu pietre la rinichi promovează creșterea și agregarea cristalelor de oxalat de calciu, Sci. Rep. 7 (2017) 2953.
[31] S. Khamchun, K. Sueksakit, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Efectele modulatoare ale fibronectinei asupra cristalizării oxalatului de calciu, creșterea, agregarea, aderența celulelor tubulare renale și invazia prin matricea extracelulară, J. Biol. Inorg. Chim. 24 (2019) 235–246.
[32] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Definirea și analiza sistematică a indicilor de agregare pentru a evalua gradul de agregare a cristalelor de oxalat de calciu, Front. Chim. 5 (2017) 113.
[33] R. Kanlaya, O. Naruepantawart, V. Thongboonkerd, Flagellum este responsabil pentru promovarea efectelor viabile ale Escherichia coli asupra cristalizării oxalatului de calciu, creșterii cristalelor și agregării cristalelor, Front. Microbiol 10 (2019) 2507.
[34] P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Differential bound proteins and adhesive capabilities of calcium oxalate monohydrate crystals with different sizes, Int. J. Biol. Macromol. 163 (2020) 2210–2223.
[35] K. Fong-ngern, K. Sueksakit, V. Thongboonkerd, Proteina de șoc termic de suprafață 90 servește ca un receptor potențial pentru cristalul de oxalat de calciu pe membrana apicală a celulelor epiteliale tubulare renale, J. Biol. Inorg. Chim. 21 (2016) 463–474.
[36] S. Chaiyarit, S. Mungdee, V. Thongboonkerd, Etichetarea non-radioactivă a cristalelor de oxalat de calciu pentru investigațiile interacțiunii cristal-celulă și internalizării, Anal. Metode 2 (2010) 1536–1541.
[37] S. Chaiyarit, N. Singhto, V. Thongboonkerd, Cristalele de oxalat de calciu monohidrat interiorizate în celulele tubulare renale sunt degradate și dizolvate de endolizozomi, Chem. Biol. Interacționa. 246 (2016) 30–35.
[38] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Un nou test pentru a evalua efectele de promovare ale proteinelor asupra invaziei cristalelor de oxalat de calciu prin matricea extracelulară bazată pe activitatea plasminogenului/plasminei, Talanta 101 (2012) 240–245.
[39] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Cristalele de oxalat de calciu au crescut secreția de enolază-1 din celulele tubulare renale care au sporit ulterior invazia cristalelor și a monocitelor prin interstițiul renal, Sci. Rep. 6 (2016) 24064.
[40] R. Kanlaya, K. Sintiprungrat, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Macropinocitoza este mecanismul major de endocitoză a cristalelor de oxalat de calciu în celulele tubulare renale, Cell Biochem. Biophys. 67 (2013) 1171–1179.
[41] S. Sassanarakkit, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, StoneMod: o bază de date pentrurinichiproteine modulatoare de calcul cu dovezi experimentale, Sci. Rep. 10 (2020) 15109.
[42] G. Eraslan, ZS Sarica, LC Bayram, MY Tekeli, M. Kanbur, M. Karabacak, Efectele diosminei asupra leziunilor hepatice și renale induse de aflatoxină, Environ. Sci. Poluarea. Res. Int. 24 (2017) 27931–27941.
[43] R. Russo, D. Chandradhara, N. De Tommasi, Comparative bioavailability of twodiosminăformulări după administrarea orală la voluntari sănătoși, Molecules 23 (2018) 2174.
[44] JQ Silveira, TB Cesar, JA Manthey, EA Baldwin, J. Bai, S. Raithore, Farmacocinetica glicozidelor de flavanonă după ingestia de doze unice de suc de portocale proaspăt stors versus suc de portocale procesat comercial la oameni sănătoși, J. Agric . Food Chim. 62 (2014) 12576–12584.
[45] A. Frackowiak, P. Skibinski, W. Gawel, E. Zaczynska, A. Czarny, R. Gancarz, Sinteza derivaților glicozidici ai hidroxiantrachinonei cu capacitatea de a dizolva și de a inhiba formarea de cristale de oxalat de calciu. Compuși potențiali în terapia pietrelor la rinichi, Eur. J. Med. Chim. 45 (2010) 1001–1007.
[46] F. Grases, J. Perello, B. Isern, RM Prieto, Study of a myo-inozitol hexaphosphate-based cream to prevent dystrophic calcinosis cutis, Br. J. Dermatol. 152 (2005) 1022–1025.
[47] V. Thongboonkerd, Proteomics of crystal-cell interactions: a model for kidney stone research, Cells 8 (2019) 1076.
[48] CF Verkoelen, Retenția de cristale în boala de calcul renal: un rol crucial pentru glicozaminoglicanul hialuronan? J. Am. Soc. Nefrol. 17 (2006) 1673–1687.
[49] K. Fong-ngern, A. Vinaiphat, V. Thongboonkerd, Microvillar injury in renal tubular epithelial cells induced by calcium oxalate crystal and the protective role of epigallocatechin-3-gallate, FASEB J. 31 (2017) 120 –131.
[50] J. Zhou, J. Jin, X. Li, Z. Zhao, L. Zhang, Q. Wang, J. Li, Q. Zhang, S. Xiang, Total flavonoids of Desmodium styracifolium atenuează formarea hidroxi- Urolitiază de oxalat de calciu indusă de L-prolină la șobolani, Urolithiasis 46 (2018) 231–241.
[51] J. Manissorn, K. Fong-ngern, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Evaluare sistematică pentru efectele pH-ului urinei asupra cristalizării oxalatului de calciu, adeziunii celulelor cristaline și internalizării în celulele tubulare renale, Sci. Rep. 7 (2017) 1798.
[52] S. Cui, J. Qian, P. Bo, Efectul inhibitor asupra fagocitozei Candida albicans indus de pretratamentul cu quercetină prin interferența citoscheletului cu actină, J. Tradit. Bărbie. Med. 33 (2013) 804–809.
[53] S. Cui, Q. Wu, J. Wang, M. Li, J. Qian, S. Li, Quercetin inhibă migrarea macrofagelor indusă de LPS prin suprimarea căii iNOS/FAK/paxilină și modularea citoscheletului, Cell Adhes. . Migr. 13 (2019) 1–12.
[54] Y. Li, WG Gonzalez, A. Andreev, W. Tang, S. Gandhi, A. Cunha, D. Prober, C. Lois, ME Bronner, reciclarea membranei mediată de macropinocitoză determină migrarea crestei neurale prin furnizarea de F- actină la lamelipodiu, Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 117 (2020) 27400–27411.
[55] H. Inaba, K. Yoda, H. Adachi, RapGEF GflB de legare la F-actin este necesar pentru macropinocitoza eficientă în Dictyostelium, J. Cell Sci. 130 (2017) 3158–3172.
[56] A. Khan, Prevalența, mecanismele patofiziologice și factorii care afectează urolitiaza, Int. Urol. Nefrol. 50 (2018) 799–806.
[57] AP Evan, EM Worcester, FL Coe, J. Williams Jr., JE Lingeman, Mecanisme de formare a pietrelor la rinichi umani, Urolithiasis 43 (Suppl 1) (2015) 19–32.
[58] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Disfuncția mitocondrială șirinichiboala de pietre, Front. Physiol. 11 (2020), 566506.
[59] SR Khan, Aspecte histologice ale modelului „fixed-particule” de formare a pietrei: studii pe animale, Urolithiasis 45 (2017) 75–87.
[60] VY Bird, SR Khan, Cum se formează pietrele? Este posibilă unificarea teoriilor privind formarea pietrei? Arc. Esp. Urol. 70 (2017) 12–27.
[61] JP Kavanagh, Metode pentru studiul cristalizării oxalatului de calciu și aplicarea lor la cercetarea urolitiazelor, Scanning Microsc. 6 (1992) 685–704, discuţie 704-5.
[62] JP Kavanagh, L. Jones, PN Rao, Cinetica de cristalizare a oxalatului de calciu la diferite concentrații de urină umană și artificială, cu un raport constant de calciu la oxalat, Urol. Res. 27 (1999) 231–237.
[63] NK Saw, PN Rao, JP Kavanagh, A. nidus, cristalurie și agregare: ingrediente cheie pentru mărirea pietrei, Urol. Res. 36 (2008) 11–15.
[64] A. Borissova, GE Goltz, JP Kavanagh, TA Wilkins, Reverse engineering the kidney: modeling calcium oxalate monohydrate crystallization in the nephron, Med. Biol. ing. Calculator. 48 (2010) 649–659.
[65] LA Thurgood, ES Sorensen, RL Ryall, Efectul osteopontinei intracristaline și legate de suprafață asupra atașării cristalelor de oxalat de calciu dihidrat la celulele de rinichi canin Madin-Darby (MDCK) în urina umană ultrafiltrată, BJU Int. 109 (2012) 1100–1109.
