Echinacozidul protejează împotriva 6-disfuncției mitocondriale induse de hidroxidopamină și a răspunsurilor inflamatorii în celulele PC12 prin reducerea producției de ROS

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yue-Hua Wang,1,2 Zhao-Hong Xuan,3 Shuo Tian,1 și Guan-Hua Du1,2

Boala Parkinson (PD) este o afecțiune neurodegenerativă caracterizată prin pierderea progresivă a neuronilor dopaminergici (DA) la nivelul substanței negre. Disfuncția mitocondrială și răspunsurile inflamatorii sunt implicate în mecanismul de deteriorare a celulelor în PD. 6-Hidroxidopamina (6-OHDA), un analog al dopaminei, dăunează în special neuronilor dopaminergici.Echinacozidul(ECH) este o glicozidă feniletanoidă izolată din tulpinileCistanche salsa, arătând o varietate de efecte neuroprotectoare în studiile anterioare. Studiul de față a fost de a investiga efectul său împotriva neurotoxicității induse de 6-OHDA și a posibilelor mecanisme în celulele PC12. Rezultatele au arătat că 6-OHDA a redus viabilitatea celulară, a scăzut activitatea de oxidare-reducere, a scăzut potențialul membranei mitocondriale și a indus apoptoza mediată de mitocondrii în comparație cu celulele PC12 netratate. In orice caz,echinacozidtratamentul a atenuat semnificativ aceste modificări induse de 6-OHDA. În plus,echinacozidde asemenea, ar putea atenua în mod semnificativ răspunsurile inflamatorii induse de 6-OHDA. Cercetările ulterioare au arătat căechinacozidar putea reduce 6-producția de ROS indusă de OHDA în celulele PC12. Aceste rezultate sugerează că mecanismul de bază alechinacozidîmpotriva 6-neurotoxicității induse de OHDA poate implica atenuarea disfuncției mitocondriale și a răspunsurilor inflamatorii prin reducerea producției de ROS.

1. Introducere

boala Parkinson (PD)este o afecțiune neurodegenerativă caracterizată prin degenerarea lent progresivă a neuronilor dopaminergici din substanța nigra pars compacta [1]. Deși semnele distinctive neuropatologice ale PD sunt bine descrise, etiologia rămâne încă nedefinită. În special, mai multe observații sugerează că disfuncția mitocondrială este implicată în patogeneza PD și degenerarea neuronilor dopaminergici [2, 3]. Mitocondriile conțin multe enzime redox, iar ineficiențele de fosforilare oxidativă care apar în mod natural generează specii reactive de oxigen (ROS) [4]. Recent, dovezi tot mai mari din studiile pe oameni și pe animale au sugerat că neuroinflamația este, de asemenea, un contributor important la pierderea neuronală în PD [5].

6-Hidroxidopamina (6-OHDA) este specifică neuronilor dopaminergici în modelele de rozătoare intrastriatale și în unele celule [6-11]. Celula PC12 a devenit un model popular de celule pentru cercetarea PD, deoarece această linie celulară posedă multe caracteristici ale neuronilor DAergici. A fost folosit ca model in vitro pentru studiul PD și pentru a determina efectul agenților protectori și terapeutici. Echinacozidul (Figura 1) este un glicozid feniletanoid izolat și purificat din tulpinileCistanche salsa[12], o plantă parazită originară din nord-vestul Chinei, care este folosită ca mecanism de încercare a echinacozidei împotriva 6-daunelor induse de OHDA în celulele PC12.

2. Materiale și metode

2.1. Materiale. Echinacozidul a fost obținut de la National Institutes for Food and Drug Control (Beijing, China). RPMI-1640 și serul fetal bovin au fost obținute de la Gibco

(Grand Island, NY, SUA). 6-OHDA, MTT, 2,7-diacetat de diclorodihidrofluoresceină, iodură de propidiu (PI) și resazurina au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Trusa de analiză bioluminiscentă ATP a fost obținută de la Promega (Madison, SUA). Trusa de analiză 5,5,6,6 -Tetracloro{-1,1,3,3 -tetraetil benzimidazolil carbocianina iodură (JC{-1) a fost obținută de la Institutul de Biotehnologie Beyotime (Haimen, Jiangsu, China). Kitul ELISA citocrom C și substratul fluorogenic Ac-DVD-AMC au fost obținute de la Invitrogen (Carlsbad, CA, SUA). Trusele EL-1 și IL-6 ELISA au fost obținute de la Boster Bio-engineer limited company (Wuhan, China). Cititorul de microplăci Spectramax M5 a fost achiziționat de la compania Molecular Devices (Sunnyvale, CA, SUA).

2.2. Cultură și tratament celular. Celulele PC12 au fost crescute în RPMI-1640 suplimentat cu 10% ser de cal și 5% ser fetal bovin. Condițiile au fost menținute la 37∘C într-o atmosferă umidificată care conține 5% CO2 [19]. Celulele au fost placate în 96-plăci de godeuri la o densitate de 2 × 105 celule/mL. După o confluență de 80%, celulele au fost preincubate cu diferite concentrații de echinacozidă într-un mediu RPMI-1640 fără ser timp de 1 oră. Apoi, 6-OHDA a fost adăugată în godeuri la o concentrație finală de 100 M și incubată pentru încă o dată După tratament, modificările morfologice au fost observate la microscop. Viabilitatea celulară a fost evaluată prin test MTT [19]. Pe scurt, după tratament, MTT la concentrația finală de 0,5 mg/mL a fost adăugat în fiecare godeu și incubat timp de 4 ore la 37°C.

2.3.Modificări morfologice și analiza viabilității celulelor PC12. După tratament, modificările morfologice au fost observate la microscop. Viabilitatea celulară a fost evaluată prin test MTT [19]. Pe scurt, după tratament, MTT la concentrația finală de 0,5 mg/mL a fost adăugat în fiecare godeu și incubat timp de 4 ore la 37°C. Apoi, supernatantul a fost îndepărtat și produsul formazan a fost dizolvat în 100 L dimetil sulfoxid cu agitare timp de 15 min pe un agitator cu plăci de microtitrare și absorbanța a fost citită la 570 nm folosind un cititor de microplăci Spectramax M5. Medicina complementară și alternativă bazată pe dovezi

2.4. Analiza nivelului ATP intracelular. Nivelul ATP celular a fost măsurat cu un kit de testare bioluminiscent ATP conform instrucțiunilor producătorului. Luminescența a fost monitorizată pe un cititor de microplăci în modul de luminescență după adăugarea a 100 L de luciferină și luciferază [20].

2.5. Măsurarea activității de oxidare-reducere a mitocondriilor prin resazurin. După tratament, s-a adăugat resazurină la concentrația finală de 5 M în godeuri și intensitatea fluorescenței a fost examinată la o excitație de 530 nm și o emisie de 590 nm [21].

2.6. Măsurarea potențialului membranei mitocondriale de către JC-1. Potențialul membranei mitocondriale a fost măsurat folosind kitul de testare JC-1 conform instrucțiunilor producătorului. După tratament, mediul de cultură a fost îndepărtat și încărcat cu soluție JC-1 timp de 15 minute la 37°C în întuneric. Intensitatea fluorescenței raportului roșu/verde a fost determinată la o excitație de 490 nm și o emisie de 530 nm (monomeri fluorescenți verzi) și respectiv 590 nm (agregate fluorescente roșii), [22].

2.7. Cuantificarea eliberării citocromului C. Nivelurile de citocrom C citosolic au fost măsurate folosind un kit ELISA conform instrucțiunilor producătorului [23]. Pe scurt, după tratament, celulele au fost lizate și centrifugate la 1000 g timp de 15 minute, iar apoi supernatantul a fost colectat ca o fracțiune citoplasmatică și utilizat pentru măsurătorile eliberării citocromului C.

2.8. Determinarea activității caspazei-3. Activitatea caspazei-3 a fost efectuată conform referințelor cu modificare [24]. Pe scurt, după tratament, tamponul de liză a fost adăugat în fiecare godeu și urmat de centrifugare la 12 000 g timp de 10 minute. Activitatea caspazei-3 a fost testată în supernatanții rezultați prin măsurarea clivajului proteolitic al substratului fluorogenic Ac-DVD-AMC cu o lungime de undă de excitație de 380 nm și o lungime de undă de emisie de 460 nm.

2.9. Test de citometrie în flux în celule PC12. După tratament, celulele au fost tripsinizate, spălate de două ori cu PBS, centrifugate la 1000 r/min timp de 5 minute și apoi fixate cu 70% etanol peste noapte la 4°C. Celulele au fost centrifugate și spălate de două ori cu PBS, resuspendate în PBS (conținând 50 g/mL RNaseA), colorate cu PI la concentrația finală de 10 M timp de 30 de minute la temperatura camerei în întuneric și citite într-un citometru de flux la 488°C. excitație nm [10].

2.10. Măsurarea nivelului IL-1 și IL-6 prin test ELISA. Mediul de celule PC12 cultivat a fost colectat după tratament, iar concentrațiile de IL-1 și IL{-6 au fost măsurate prin truse ELISA disponibile comercial, conform protocolului producătorului de om.

2.11. Determinarea nivelului speciilor de oxigen reactiv intracelular. După incubarea cu 6-OHDA, celulele au fost încărcate cu 10M H2DCFH-DA timp de 30 de minute la 37°C în întuneric. Intensitatea fluorescenței DCF a fost măsurată la o excitație

Medicina complementară și alternativă bazată pe dovezi cu lungime de undă de 495 nm și lungime de undă de emisie de 530 nm pe un cititor de microplăci [25].

2.12. Analize statistice. Toate datele sunt exprimate ca medie ± SD. Analiza statistică a rezultatelor a fost efectuată prin analiza unidirecțională a varianței (ANOVA), urmată de -test. Semnificația statistică a fost acceptată la <>

3. Rezultate

3.1. Efectul echinacosidei morfologiei și viabilității celulare în celulele PC12 deteriorate de 6-OHDA. După cum se arată în Figura 2(A), viabilitatea celulelor PC12 nu a avut nicio diferență semnificativă la concentrația de 0.1~10 M de tratament cu echinacozidă pentru

24 h. După cum se arată în Figura 2(B), în 24 de ore de la tratamentul cu 6-OHDA singur, majoritatea celulelor PC12 au suferit modificări morfologice, cum ar fi sângerarea membranei și contracția celulară. Cotratamentul cu echinacozid a protejat celulele de deteriorarea 6-OHDA. Testul MTT a arătat că tratamentul celulelor PC12 cu 6-OHDA singur a dus la o reducere de aproximativ 25% a supraviețuirii celulelor în 24 de ore, în timp ce cotratamentul cu {{10}}, 1 M, 1 M, și echinacozidul 10 M a arătat o reducere a citotoxicității mediate de 6-OHDA (toate < 0,01,="" figura="">

3.2. Efectul echinacozidei asupra disfuncției mitocondriilor indusă de 6-OHDA în celulele PC12. Nivelurile celulare de ATP au scăzut semnificativ după incubarea de 24 de ore cu 100M 6-OHDA, în timp ce cotratamentul cu 1 Mand 10 M de echinacozidă a atenuat 6-ATP mediat de OHDA scădea modificările anabolice în celulele PC12 . Rezultatele au arătat că cotratamentul cu 1 Mand 10 M de echinacozidă ar putea atenua semnificativ afectarea activității de oxidare-reducere a mitocondriilor indusă de 6-OHDA (atât < 0,05,="" cât="" și="" figura="">

După cum se arată în Figura 3(c), tratamentul cu 100 M de 6- OHDA timp de 24 de ore a dus la o scădere semnificativă a potențialului membranei mitocondriale în comparație cu grupul netratat ( < {="" {11}}.01).="" cu="" toate="" acestea,="" scăderea="" potențialului="" membranei="" mitocondriale="" indusă="" de="" 6-ohda="" a="" fost="" atenuată="" semnificativ="" prin="" cotratament="" cu="" 0,1="" m,="" 1="" m="" și="" 10="" m="" de="" echinacozidă="" (toate=""><>

3.3. Apoptoza mediată de anti-mitocondrii a echinacozidei în celulele PC12 împotriva neurotoxicității 6-OHDA. Rezultatele au arătat că expunerea la 6-OHDA a dus la o creștere a citocromului C citosolic cu 167 la sută față de grupul netratat ( < 0.{{10}}1).="" echinacozidul="" în="" doza="" de="" 0,1="" m,="" 1="" m="" și="" 10m="" ar="" putea="" reduce="" semnificativ="" eliberarea="" de="" citocrom="" c="" în="" citosol="" indusă="" de="" 6-ohda="" (="">< 0,05,="">< 0,01="" și="">< 0,01,="" resp.;="" figura="">

Activitatea caspazei{{0}} a fost crescută de aproximativ 3.3-ori în comparație cu grupul netratat după 6-expunerea la OHDA ( < 0.01="" ).="" în="" schimb,="" cotratamentul="" cu="" 1="" m="" și="" 10="" m="" de="" echinacozid="" a="" arătat="" o="" scădere="" semnificativă="" a="" activității="" caspazei-3="" în="" comparație="" cu="" celulele="" tratate="" cu="" 6-ohda,="" respectiv="" (atât="">< 0,05,="" cât="" și="" figura="" 4(="" b)).pi="" este="" permeabilitatea="" membranei="" și="" este="" în="" general="" exclus="" din="" celulele="" viabile.="" deci,="" este="" folosit="" în="" mod="" obișnuit="" pentru="" identificarea="" celulelor="" moarte="" dintr-o="" populație.="" rezultatele="" au="" arătat="" că="" rata="" apoptozei="" a="" crescut="" semnificativ="" după="" incubarea="" de="" 24="" de="" ore="" cu="" 100="" m="" 6-ohda,="" în="" timp="" ce="" cotratamentul="" cu="" echinacozidă="" 1="" și="" 10="" m="" a="" redus="" semnificativ="" apoptoza="" indusă="" de="" 6-ohda="">< 0,05,="">< 0,01,="" resp.,="" figura="">

3.4. Efectul antiinflamator al echinacozidei în celulele PC12 indus de 6-OHDA. Rezultatele au arătat că nivelul de 6-expunerea la OHDA rezultă din creșterea în IL-1 în comparație cu grupul netratat ( < 0.{05;="" figura="" 4(a)).="" cu="" toate="" acestea,="" 10="" m="" de="" echinacozidă="" ar="" putea="" reduce="" semnificativ="" eliberarea="" il-1="" indusă="" de="" 6-ohda="">< 0,05;="" figura="">

Nivelul IL{{{0}} a fost de asemenea semnificativ crescut în comparație cu grupul netratat (<0.01). cu="" toate="" acestea,="" cotratamentul="" cu="" 0,1,="" 1="" și="" 10="" m="" de="" echinacozidă="" au="" scăzut="" semnificativ="" eliberarea="" il-6="" în="" comparație="" cu="" celulele="" tratate="" cu="" 6-ohda="" (atât="">< 0,05,="" cât="" și="" figura="">

3.5. Efectul ECH asupra producției de ROS indus de 6-OHDA în celulele PC12. Celulele tratate cu 6-OHDA au prezentat o creștere semnificativă (de aproximativ 1,4-ori) a ROS intracelular în comparație cu celulele netratate (<0.01). această="" creștere="" a="" fost="" atenuată="" semnificativ="" prin="" coincubarea="" cu="" 0.1,="" 1="" și="" 10="" mechinacozidă="">< 0.05,="">< 0.01="" și="">< 0.01,="" resp.;="" figura="" 6)="">

4. Discutie

Echinacozidul este unul dintre constituenții principali ai glicozidelor feniletanoide extrase dintr-o echinacozidă tradițională cunoscută, care are proprietăți anti-apoptotice și neuroprotectoare în bolile neurodegenerative [18]. Studiul in vivo a raportat că echinacozidul a avut efecte neuroprotectoare și îmbunătățirea comportamentului în modelul de șoarece de leziuni neuronale dopaminergice induse de MPTP, în timp ce investigațiile ulterioare au arătat că echinacozidul a indus reglarea în jos a activării caspazei-3 și caspazei{-8 în MPP plus -apoptoza indusă a neuronilor granulare cerebeloase [16]. Un alt studiu in vivo a raportat efectele neuroprotective ale echinacozidei asupra neuronilor dopaminergici striatali răniți de 6-OHDA [17]. Cu toate acestea, mecanismele celulare și moleculare care stau la baza acestor acțiuni nu sunt pe deplin înțelese, în special pentru influența lor asupra funcției mitocondriale și a răspunsurilor la inflamație. Așadar, studiul nostru actual a investigat efectele echinacozidei asupra funcției mitocondriale și a răspunsurilor la inflamație pentru a elucida mecanismul său împotriva PD. Rezultatele au arătat în primul rând că echinacozidul a atenuat în mod semnificativ neurotoxicitatea indusă de 6-OHDA în celulele PC12 prin protejarea funcției mitocondriale și antiinflamație.

Disfuncția mitocondrială a fost mult timp implicată în moartea neuronilor dopaminergici nigrostriatali în boala Parkinson și modelele sale experimentale [26]. Mitocondriile sunt profund implicate în producerea de specii reactive de oxigen (ROS) prin purtătorii de electroni ai lanțului respirator în bolile neurodegenerative [27]. O mare varietate de ROS sunt produse în cursul metabolismului normal în sistemele biologice, dar acumularea lor dincolo de

cantitatea necesară poate deteriora lipidele, proteinele și acizii nucleici.

6-OHDA, un analog de catecolamine, provoacă degenerarea specifică a neuronilor substanței negre. Neurotoxicitatea indusă de 6-OHDA se datorează, în parte, producției de ROS [28–32].

OHDA duce la moarte neuronală prin afectarea funcției mitocondriilor, inclusiv reducerea producției de ATP, perturbarea metabolismului ROS și inducerea apoptozei [10, 33, 34]. În studiul de față, rezultatele noastre au demonstrat, de asemenea, că 6-OHDA a deteriorat funcția de reducere oxidativă mitocondrială, a scăzut potențialul membranei mitocondriale, a indus apoptoza mediată de mitocondrie și a crescut producția de ROS în celulele PC12.

Resazurina este un indicator fluorescent care este intermediar doar între reducerile finale ale oxigenului molecular și ale citocrom oxidazei. Prin urmare, potențialul de oxidare-reducere al resazurinei permite lanțului respirator să funcționeze aproape de finalizare, ceea ce va oferi o indicație mai precisă și mai sensibilă a funcției mitocondriale. JC-1 este o sondă sensibilă la potențial de membrană care se localizează în membrana mitocondrială interioară, unde formează fie monomeri (verde) fie agregate (roșu) pe baza potențialului membranei mitocondriale. Astfel, resazurina și JC-1 sunt instrumente analitice valoroase pentru examinarea funcției mitocondriale [35]. Studiul de față a indicat că scăderea activității mitocondriale de reducere oxidativă și a potențialului membranei mitocondriale pot juca roluri importante în neurotoxicitatea dopaminergică indusă de 6-OHDA. Rezultatul nostru a arătat, de asemenea, activitate de oxidare-reducere mitocondrială și potențialul membranei mitocondriale. Aceste rezultate arată că îmbunătățirea disfuncției mitocondriale poate fi o modalitate mai bună de a încetini neurodegenerarea dopaminergică progresivă asociată în mod obișnuit cu PD.

Este în general acceptat că apoptoza celulară indusă de 6- OHDA este mediată de disfuncția mitocondrială, caracterizată prin eliberarea citocromului C și activarea caspazei-3 [36]. Un stimul apoptotic declanșează eliberarea citocromului C din mitocondrii în citosol unde apoi activează caspaza-3 și alte caspaze din aval. În studiul de față, rezultatele au arătat că celulele PC12 expuse la 100 M de 6-OHDA au îmbunătățit eliberarea citocromului C și în mod dependent de caspază au inhibat eliberarea citocromului C și activările caspazei- 3. Aceste rezultate sugerează că echinacozidul ar putea inhiba apoptoza mediată de mitocondrii prin reducerea eliberării citocromului C din mitocondrie la citosol și activarea caspazei-3.

Inflamația este o caracteristică neuropatologică a creierului parkinsonian și, de asemenea, în modelele experimentale ale bolii. Strategiile terapeutice orientate spre reducerea inflamației și inhibarea producerii acestor factori inflamatori pot fi o strategie neuroprotectoare promițătoare pentru tratamentul bolii Parkinson și a afecțiunilor asociate [37]. Mai multe studii efectuate, de asemenea, în lichidul cefalorahidian și în timpul analizei post-mortem la pacienții cu Parkinson au evidențiat niveluri crescute de citokine, cum ar fi interleukina-1 (IL{-1) și interleukina{-6 (IL{{{4}). }), sugerând activarea răspunsului aproinflamator[38, 39]. În studiul de față, rezultatele au arătat că expunerea la 100 Mof6-OHDA indusă de IL-1 și IL-6 eliberarea în celulele PC12. Cu toate acestea, tratamentul cu echinacozidă ar putea inhiba în funcție de doză eliberarea de IL-1 și IL-6 indusă de 6-OHDA. Rezultatele sugerează că reducerea răspunsurilor inflamatorii este implicată și în mecanismele echinacozidei împotriva neurotoxicității induse de 6-OHDA.

În concluzie, rezultatele acestei cercetări au arătat că echinacozidul a fost capabil să blocheze neurotoxicitatea indusă de 6-OHDA în celulele PC12, iar mecanismele pot fi legate de protecția mitocondrială și antiinflamație prin reducerea producției de ROS. Informațiile furnizate de această lucrare vor fi utile pentru a elucida mecanismul echinacozidei pentru anti-PD. S-a ajuns la concluzia că echinacozidul poate fi o opțiune terapeutică promițătoare pentru prevenirea și tratamentul PD.

Conflict de interese

Autorii nu au declarat niciun conflict de interese

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de Granturi de la Fundația Națională pentru Științe Naturale din China (81473383) și Proiectul major pentru Știință și Tehnologie (2012ZX09103101-078; 2013ZX09103-001-008; și 2013ZX09102106).