Echinacozidul inversează remodelarea miocardică și îmbunătățește funcția inimii

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yajuan Ni1|Jie Deng1|Xin Liu1|Qing Li1|Juanli Zhang1|Hongyuan Bai1|Jingwen Zhang2

Abstract

Remodelarea miocardică este o bază patologică importantă a IC, stresul oxidativ mitocondrial este un promotor al hipertrofiei miocardice, fibrozei și apoptozei. ECH este componenta activă majoră a medicamentului tradițional chinezesc Cistanches Herba, multe studii indică că posedă o capacitate antioxidantă puternică în celulele nervoase și tumori, inhibă stresul oxidativ mitocondrial, protejează funcția mitocondrială, dar mecanismul specific este neclar. SIRT1/FOXO3a/MnSOD este o axă antioxidantă importantă, studiul constată că ECH se leagă covalent de SIRT1 ca ligand și reglează în sus expresia SIRT1 în celulele creierului. Emitem ipoteza că ECH poate inversa remodelarea miocardică și poate îmbunătăți funcția cardiacă a HF prin reglarea axei de semnalizare SIRT1/FOXO3a/MnSOD și inhibarea stresului oxidativ mitocondrial în cardiomiocite. Aici, în primul rând, inducem un model celular de stres oxidativ de către ISO cu celule AC-16 și pre-tratăm cu ECH, nivelul de ROS mitocondrial, leziunea oxidativă a ADNmt, MMP, proteina carbonilată, peroxidarea lipidelor, ROS intracelular și apoptoza sunt detectate, confirmă efectul ECH în stresul oxidativ mitocondrial și funcția in vitro. Apoi, stabilim un model de șobolan HF indus de ISO și pre-tratăm cu ECH. Sunt măsurați indicii funcției cardiace, remodelarea miocardică, stresul oxidativ mitocondrial și funcția, expresia axei de semnalizare SIRT1/FOXO3a/MnSOD, datele indică faptul că ECH îmbunătățește funcția inimii, inhibă hipertrofia miocardică, fibroza și apoptoza crește expresia SIRT1/FOXO3a/ Axa de semnalizare MnSOD, reduce daunele oxidative mitocondriale, protejează funcția mitocondrială. Concluzionăm că ECH inversează remodelarea miocardică și îmbunătățește funcția cardiacă prin reglarea în sus a axei SIRT1/FOXO3a/MnSOD și inhibarea stresului oxidativ mitocondrial la șobolanii HF.

CUVINTE CHEIESechinacozidă, insuficiență cardiacă, stres oxidativ mitocondrial, remodelare miocardică

ierburi proaspete cistanchelastresul oxidativ mitocondrial

1|INTRODUCERE

Insuficiența cardiacă (IC) este rezultatul final al majorității bolilor cardiovasculare cu prevalență ridicată și prognostic prost, iar odată cu tendința de agravare a unei populații îmbătrânite, spitalizarea și mortalitatea datorată insuficienței cardiace cronice (ICC) au crescut brusc în întreaga lume.1 În ultimii 20 de ani, tratamentele medicamentoase pentru IC au făcut progrese mari, dar efectul este foarte limitat, așa că este nevoie urgentă de noi medicamente. Remodelarea miocardică este o bază patologică importantă a IC și se caracterizează prin hipertrofie miocardică, apoptoză, fibroză interstițială, celulele miocardice sunt dezorganizate și duc la reducerea fracției de ejecție (FEVS), creșterea dimensiunilor telediastolice și sistolice ale ventriculului stâng. (LVIDd și LVID) și scăderea scurtării fracționale a ventriculului stâng (LVFS).2 Dar mecanismele care stau la baza nu au fost încă pe deplin înțelese. În ultimii ani, numeroase studii au confirmat că stresul oxidativ este un promotor important al remodelării miocardice.3-7

Stresul oxidativ este o afecțiune în care speciile reactive de oxigen (ROS) sau radicalii liberi sunt generate în mod excesiv și conduc la deteriorarea oxidativă a componentelor celulare, aceasta, la rândul său, provoacă disfuncții celulare.8 Mitocondriile sunt principala sursă de ROS intracelular, ca urmare a scurgerile din lanțul de transport de electroni respiratori și mitocondriile sunt poziția cea mai sensibilă la efectele ROS.9 Studiile în HF au identificat o generare crescută de ROS din complexul I al lanțului respirator.8 Producția crescută de ROS atacă componentele mitocondriale în primul rând și are ca rezultat stres oxidativ în exces. , se manifestă prin carbonilarea proteinelor, peroxidarea lipidelor și deteriorarea ADN-ului10 și disfuncția mitocondriilor, care, în consecință, duce la formarea excesivă a ROS,8 formează un cerc vicios. S-a demonstrat că stresul oxidativ susținut poate provoca hipertrofie miocardică și fibroză miocardică și poate provoca apoptoza celulelor miocardice prin activarea apoptozei dependente de mitocondrii ca urmare a carbonilării proteinelor membranei mitocondriale și a pierderii potențialului membranei mitocondriale.14 , se consideră că inhibarea stresului oxidativ mitocondrial poate fi o nouă strategie de prevenire a remodelării miocardice și chiar a IC.15-17

Echinacozidul (ECH), o glicozidă feniletanoid naturală, este componenta activă majoră a Cistanches Herba, care este medicina tradițională chineză. În ultimii ani, ECH a fost studiat pe larg în sistemul nervos și tumori și s-a raportat că posedă o varietate de efecte farmacologice, cum ar fi proprietăți antioxidante, antiinflamatorii, anti-apoptoză și antitumorale.18,19 celulele nervoase, ECH îmbunătățește semnificativ capacitatea antioxidantă, reduce producția de ROS, îmbunătățește potențialul membranei mitocondriale (MMP) și crește viabilitatea celulelor,20 prezintă efecte protectoare asupra funcției mitocondriale și inhibă stresul oxidativ mitocondrial, protejează împotriva leziunilor oxidative și îmbunătățește memoria, eventual previne neurodegenerarea.21,22 ECH crește, de asemenea, activitatea SOD și joacă un rol protector în țesutul cerebral și țesutul retinei,19,23, dar mecanismul specific pentru efectul său antioxidant este neclar.

SIRT1 este strâns legat de stresul oxidativ, iar axa de semnalizare SIRT1/FOXO3a/MnSOD este cea mai importantă axă antioxidantă și este responsabilă pentru suprimarea stresului oxidativ mitocondrial, MnSOD se distribuie pe scară largă în mitocondrii și este în primul rând responsabil pentru curățarea ROS mitocondriale, astfel inhibarea stresului oxidativ, compușii care activează această axă antioxidantă pot inhiba stresul oxidativ.24,25 Studii recente au arătat că ECH își exercită efectele farmacologice prin reglarea căilor multiple de semnalizare, cum ar fi p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-beta 1/Smads. , și calea de semnalizare SIRT1.26-29 un nou studiu constată că ECH se leagă covalent de SIRT1 ca ligand și reglează în sus expresia SIRT1 în celulele creierului.26Sugerează că ECH poate inhiba stresul oxidativ mitocondrial în cardiomiocite și inversează miocardicul. remodelare. Cu toate acestea, cercetările asupra efectelor ECH s-au concentrat asupra sistemului nervos sau tumorii, efectele și mecanismele ECH asupra stresului oxidativ mitocondrial în cardiomiocite și remodelarea miocardică rămân necunoscute. Aici, în primul rând, inducem un model celular de stres oxidativ prin ISO și confirmăm efectul ECH asupra stresului oxidativ mitocondrial și a funcției in vitro. Apoi, stabilim un model de șobolan HF indus de ISO și demonstrăm că ECH inversează remodelarea miocardică și îmbunătățește funcția cardiacă prin reglarea în sus a axei de semnalizare SIRT1/FOXO3a/MnSOD și inhibarea stresului oxidativ mitocondrial la șobolanii HF. Rezultatele sunt menite să ofere dovezi experimentale pentru dezvoltarea de noi medicamente pentru prevenirea insuficienței cardiace.

2|MATERIALE ȘI METODE

2.1|Cultură și tratament celular

Celulele AC16 sunt achiziționate de la Bena Culture Collection. Celulele sunt menținute în supliment în mediu Eagle modificat de Dulbecco (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, SUA) cu 10% ser fetal bovin sunt (10% FBS; Gibco) în baloane T-75 (Corning Glassworks, Corning, NY, SUA). Condițiile sunt menținute la 37 de grade într-o atmosferă umidificată care conține 5% CO2. Odată ce celulele ating 70% -80 procente de confluență, celulele grupului ISO (Sigma, SUA) sunt incubate cu un mediu care conține 10 uM ISO (Sigma, SUA) timp de 24 de ore, celulele grupului ECH sunt pre-tratate cu 50 uM ECH (MCE). , SUA) timp de 30 de minute înainte de expunerea ISO. Celulele de control (Ctrl) nu sunt tratate nimic.

cistanche de vanzareextrage

2.2|Detectarea nivelului ROS mitocondrial folosind chemiluminiscența luminolului

Mitocondriile sunt izolate și purificate din celulele AC-16 folosind Mitocondria Isolation Kit (Sigma, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Concentrațiile de proteine ​​sunt determinate de trusa de analiză a proteinei BCA (Biotech). Nivelul ROS mitocondrial este detectat de luminal (3-hidrazidă aminoftalică 5-amino{-2,3-dihidro{-1,4-ftalazindionă) folosind un kit Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, SUA), reacționează cu ROS și provoacă emisia de fotoni, care este un spectru de bandă care are un vârf la aproximativ 460 nm, iar Unitatea de lumină relativă (RLU) este detectată de instrumentul de măsurare prin chemiluminiscență și convertită în RLU/ug. proteine ​​mitocondriale.

2.3|8-OHdG este utilizat pentru a evalua deteriorarea oxidativă a ADN-ului mitocondrial

Daunele oxidative ale ADN-ului mitocondrial sunt evaluate prin detectarea conținutului de 8-hidroxi-2-deoxiguanozină (8-OHG). Mitocondriile purificate din celule sunt izolate folosind un kit de izolare a mitocondriilor ca mai sus (Sigma). Concentrațiile de proteine ​​sunt determinate de trusa de analiză a proteinei BCA (Biotech). Apoi, acestea sunt disociate pentru a determina nivelul de 8-OHdG folosind un kit Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Absorbanța schimbării culorii este măsurată într-un spectrofotometru la lungimea de undă de 450 nm. Concentrația de 8-OHdG din probe este apoi determinată prin compararea OD a probelor cu curba standard și convertită în ng/ml.

2.4|Măsurarea MMP de către JC-1

Mitocondriile sunt izolate și purificate de AC-16, iar concentrația de proteine ​​este determinată așa cum sa menționat mai sus. Apoi mitocondriile sunt resuspendate la o concentrație de 1 mg/ml, MMP este măsurat folosind un kit de testare JC-1 conform instrucțiunilor producătorului. Intensitatea fluorescenței este măsurată la lungimea de undă de excitație: 490 nm, fantă 5 nm, lungime de undă de emisie: 590 nm, fantă 5 nm cu un instrument spectrofotometru30, rezultatele sunt reprezentate ca FLU/ugP.

2,5|Detectarea celulelor apoptotice prin citometrie în flux în celulele AC-16

Citometria în flux este utilizată pentru a evalua apoptoza celulară. Un kit de detectare a apoptozei Annexin V-FITC/PI (CWBIO, China) este utilizat pentru a detecta celulele apoptotice și necrotice conform instrucțiunilor furnizorului. Apoptoza în stadiu incipient, apoptoza sau necroza în stadiu avansat, resturile celulare și celulele viabile sunt identificate ca anexină V ( plus )/PI (-), anexină V ( plus )/PI ( plus), anexină V (-)/PI ( plus ) și respectiv anexina V (−)/PI (−). Intensitățile fluorescenței sunt analizate utilizând un citometru în flux (BD FACSVerse™ Flow Cytometer, BD Biosciences, San Jose, CA, SUA). Fiecare experiment se repetă de 3 ori.

2,6|S-a evaluat ROS intracelular prin citometru în flux

După tratament, celulele sunt tripsinizate, spălate de două ori cu PBS. Celulele sunt apoi resuspendate în PBS, colorate cu DCFH-DA (Beyotime, China) la concentrația finală de 1 μM și incubate timp de 1 oră la 37 de grade într-un incubator cu CO2 și apoi testate într-un citometru de flux la excitație de 488 nm. . Intensitatea fluorescenței reprezintă nivelul ROS intracelular.

2,7|Testați conținutul de proteine ​​carbonil în mitocondriile celulelor AC-16

După tratament, mitocondriile purificate sunt izolate și sonicate pe gheață și sunt tratate cu sulfat de streptomicină 1% pentru a precipita acizii nucleici mitocondriali, se determină concentrația de proteine. Conținutul de proteine ​​carbonil este testat folosind un kit Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, SUA) bazat pe derivatizarea grupării carbonil cu dinitrofenilhidrazină (DNPH), conform instrucțiunilor trusei, OD este măsurată cu un cititor de microplăci și convertită în nmol/ mg proteină prin compararea cu curba standard.

2,8|Determinarea nivelului de peroxidare a lipidelor în mitocondriile celulelor AC-16

După tratament, celulele sunt colectate și lizate, mitocondriile sunt izolate și purificate și crăpate prin ultrasunete, concentrația proteinei este determinată de kitul de analiză a proteinei BCA (Biotech), peroxidarea lipidelor este determinată de nivelul de malondialdehidă (MDA) prin testul TBARS. , folosind un kit (Nan jing Jian cheng, China) și nivelul MDA este măsurat urmând protocolul producătorului. OD este detectată la 586 nm de un cititor de microplăci și convertită în proteină μmol/g prin compararea cu curba standard.

2,9|Animale și tratament

Tinerii șobolani Sprague-Dawley masculi care cântăresc 120-140g sunt achiziționați de la Centrul pentru animale de laborator al Universității Xi'an Jiao Tong (Shaanxi, China). Investigația este conformă cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator, publicat de National Institutes of Health din SUA (publicația NIH nr.85-23, revizuită în 1996), iar protocoalele experimentale au fost aprobate de autoritățile locale ( Comitetul de etică biomedicală al Departamentului medical al Universității Xi 'a Jiao Tong). Modelul de HF la șobolan este stabilit așa cum este descris anterior de noi.31 Pe scurt, izoproterenol (10 mg/kg) se administrează o dată pe zi prin injecție intraperitoneală timp de 2 săptămâni (definit ca grup HF), ECH se administrează cu 20 ug/g o dată pe zi prin injectare intraperitoneală la 30 min înainte ca ISO să fie tratat (definit ca grup ECH), iar administrarea durează 2 săptămâni. Animalele de control sunt administrate cu 0,9% NaCI (definit ca grup Ctrl). Măsurătorile ecocardiografice sunt efectuate pentru a evalua funcția cardiacă.

2.10|Măsurători ecocardiografice

Animalele sunt anesteziate printr-o injecție intraperitoneală de 300 mg/kg de hidrat de cloral. Sistemul de ecografie SONOS-2500 cu un traductor de ultrasunete de 7,5 MHz (HP, SUA) este utilizat pentru efectuarea examinărilor ecocardiografice. Fracția de ejecție a ventriculului stâng (LVEF), scurtarea fracțională a ventriculului stâng (LVFS), dimensiunile end-diastolice ale ventriculului stâng (LVIDd), dimensiunile end-sistolice ale ventriculului stâng (LVIDs), frecvența cardiacă (HR), grosimea septului interventricular în diastolă (IVSTd) ), grosimea peretelui posterior al ventriculului stâng în diastolă (LVPWTd) sunt măsurate așa cum a fost descris anterior de noi.32

FIGURA 1 50μmol ECH inhibă eficient stresul oxidativ mitocondrial al celulelor AC-16 indus de 10μmol/L ISO și protejează funcția mitocondrială și reduce apoptoza.

2.11|Se măsoară raportul dintre greutatea inimii și greutatea corporală (HW/BW).

Șobolanul este cântărit înainte de anestezie, inima proaspătă este izolată și spăla sângele cu 0.1mol/L PBS, tăiați vasele și alte țesuturi redundante și inima este cântărită, apoi HW/BW(mg/100g) calculat.

2.12|Colorarea histologică

Inimile șobolanilor sunt disecate și fixate în paraformaldehidă 4%, încorporate în parafină și secționate în felii groase de 5 μm. Colorația cu hematoxilină-eozină (HE) este utilizată pentru a observa modificările patologice, iar tricromul Masson este utilizat pentru a evalua fibrele de colagen ale țesutului miocardului de șobolan. Fracția de volum de colagen cardiac (CVF) și aria secțiunii transversale a cardiomiocitelor este măsurată cu Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, SUA).

2.13|Colorarea TUNEL

Țesutul miocardic din ventriculul stâng este colectat și testul TUNEL este efectuat așa cum a fost descris anterior de noi32

2.14|Microscop pentru transmisie de electroni

Țesutul proaspăt al inimii este fixat în 2,5% glutaraldehidă la 4 grade, țesutul este apoi tăiat în 1 mm3 în volum și fixat din nou în 2,5% glutaraldehidă la 4 grade timp de 2 ore, apoi este spălat cu 0,1mol/L PBS, fixat. în acid osmic 1%, deshidratat cu acetonă, încorporat cu rășină epoxidice, se fac felii ultrasubțiri care se subțiază aproximativ 800nm, colorate cu acetat de uranil și citrat de plumb și apoi sunt observate la microscop electronic cu transmisie (H{ {13}}, Hitachi Limited, Japonia). Pentru a cuantifica efectul protector al ECH în morfologia mitocondrială, circumferința mitocondrială medie, aria secțiunii transversale mitocondriale medie, procentul de degenerare și procentul de vacuolizare în mitocondrii sunt analizate statistic cu Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, SUA).

2.15|PCR cantitativ

ARN total este preparat din țesutul ventricular stâng cu reactiv Trizol (Invitrogen, Carlsbad, SUA). cADN-ul este sintetizat folosind kitul de sinteză TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Japonia). Secvențele de primer specifice de colagen pe care le-am folosit pentru PCR în timp real sunt următoarele: înainte: 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3′, invers: 5′-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3′. GAPDH înainte 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', invers 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'. PCR cantitativă în timp real (qPCR) este efectuată cu SYBRPremix Ex Taq (Perfect Real Time) (Takara, Japonia). Nivelul relativ de ARNm este calculat prin normalizarea la GAPDH, conform metodei 2-ΔΔCT.

2.16|Analiza Western blot a expresiei proteinei SIRT1, FOXO3a, MnSOD

Proteina totală a țesutului ventricular stâng este extrasă pe gheață folosind tampon RIPA rece (BioRad, SUA) cu cocktail de inhibitor de protează (Sigma-Aldrich). Concentrația este determinată prin metoda BCA. Procedurile de Western blot sunt descrise anterior.33 Pe scurt, proba de proteină este fracţionată pe geluri de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă 15%, transferată pe membrane PVDF (BioRad, SUA), blocată cu lapte degresat 5% şi incubată cu anticorp MYH de la şoarece. (diluat 1:200, Santa Cruz, SUA). Apoi, incubați cu un anticorp de șoarece de capră conjugat cu peroxidază de hrean (diluat 1:2,000, Santa Cruz, SUA). Nivelul relativ de proteine ​​este calculat prin normalizarea valorii medii a razelor la -actină. Benzile de proteine ​​sunt detectate de un sistem de chemiluminiscență (ChemiDoc XRS, BioRad).

2.17|Măsurarea stresului oxidativ mitocondrial în miocardul șobolanului

Mitocondriile purificate ale miocardului de șobolan sunt izolate folosind Mitochondria Isolation Kit (Sigma, SUA) conform instrucțiunilor producătorului, ROS mitocondrial, MMP, deteriorarea oxidativă a mtDNA, conținutul de proteine ​​carbonilate și nivelul de peroxidare a lipidelor din mitocondrii sunt toate detectate folosind aceleași metode ca și experimentele celulare descrise mai sus. De notat, ROS în țesutul miocardic este detectat cu sonde fluorescente DCFH-DA, intensitatea fluorescenței este detectată cu instrumentul de măsurare de marcare a enzimelor, rezultatele sunt reprezentate ca RLU/ug proteină mitocondrială.

2.18|analize statistice

Toate datele sunt prezentate ca medii ± SEM. ANOVA unidirecțională este utilizată pentru a compara diferențele dintre mai multe grupuri, urmată de testul post-hoc Tukey pentru semnificație. Toate statisticile sunt determinate folosind software-ul SPSS15.0 (SPSS Inc, IL, SUA). O valoare a probabilității de P < .05="" este="" considerată="">

3|REZULTATE

3.1|50 μM ECH inhibă eficient deteriorarea oxidativă mitocondrială și apoptoza în celulele AC-16

Celulele netratate sunt setate ca grup Ctrl. În primul rând, așa cum arată Figura 1A, ECH inhibă ROS mitocondrial indus de ISO. Celulele tratate ISO prezintă o creștere semnificativă a ROS mitocondriale în comparație cu Ctrl și această creștere este atenuată semnificativ prin pre-tratament cu 50 μM ECH. În al doilea rând, ECH poate inhiba deteriorarea oxidativă a mtDNA indusă de ISO. 8-OHdG este considerat a fi una dintre cele mai abundente leziuni ADN rezultate din stresul oxidativ și este un biomarker al deteriorării și reparării ADN-ului oxidativ. După cum arată figura 1B, conținutul de 8-OHdG din mitocondriile purificate din celulele AC-16 este detectat, rezultatele arată că nivelul de 8-OHdG din mitocondriile din celulele tratate ISO a crescut dramatic, dar modificarea a fost inversată cu 50 μM ECH. În al treilea rând, ECH este eficient pentru a proteja MMP, care este afectat de ISO. Intensitatea fluorescenței este scăzută semnificativ în celulele tratate cu ISO în comparație cu celulele Ctrl, în timp ce pretratarea cu 50 μM ECH atenuează în mod remarcabil reducerea MMP, așa cum arată Figura 1C. În al patrulea rând, ECH protejează împotriva daunelor oxidative ale proteinei mitocondriale din celulele AC-16. După cum arată figura 1D, conținutul de proteină carbonil din mitocondriile celulelor de tratament ISO este semnificativ crescut și ECH atenuează efectul. În al cincilea rând, ECH inhibă, de asemenea, peroxidarea lipidelor mitocondriale în celulele AC-16 induse de ISO. După cum arată Figura 1E, nivelul peroxizilor lipidici din mitocondriile celulelor ISO este evident mai mare decât cel al celulelor Ctrl, în timp ce această creștere este redusă semnificativ prin pretratamentul ECH de 50 μM. În cele din urmă, ECH inhibă acumularea de ROS intracelular. După cum arată Figura 1F, nivelul de ROS intracelular în celulele ISO este semnificativ crescut și este redus în mod vizibil în celulele pre-tratate cu ECH. Figura 1G arată că rata de apoptoză a celulelor AC-16 este semnificativ crescută în urma incubațiilor de 24 de ore cu 10 μM ISO, în comparație cu celulele Ctrl, în timp ce celulele de pre-tratament cu 50 μM ECH reduc semnificativ apoptoza indusă de ISO.

FIGURA 2 Hipertrofia cardiacă a șobolanilor HF indusă de ISO este ameliorată și funcția cardiacă este îmbunătățită semnificativ prin tratamentul ECH.

3.2|ECH inversează remodelarea miocardică și îmbunătățește funcția cardiacă a șobolanilor HF indus de ISO

După cum se arată în Figura 2A, inimile la șobolanii HF sunt hipertrofie evidentă și sunt inversate prin tratament cu ECH. După cum arată figurile 2B-D și L, ECH reduce HW/BW. Rezultatele ecocardiografiei arată că LVEF și LVFS sunt semnificativ reduse în grupul IC, LVIDd, LVIDs și IVSTd sunt semnificativ crescute în grupul IC. Cu toate acestea, ECH scade semnificativ LVIDd, LVIDs, IVSTd și îmbunătățește LVEF și LVFS, nu există o diferență semnificativă în HR între cele trei grupuri, LVPWTd este crescută în HF, dar nicio diferență între ECH și Ctrl, sau între ECH și HF, toate ca Figura 2E-K arată. Rezultatele colorării HE indică faptul că hipertrofia miocardică, tulburarea aranjată sau necroza degenerativă, infiltrarea celulelor inflamatorii și hiperemia interstițială și edemul la șobolanii IC, iar ECH ameliorează semnificativ aceste daune, hipertrofia miocardică și tulburarea aranjată sunt ameliorate, necroza degenerativă și infiltratul inflamator sunt reduse, așa cum se arată în Figura 3A. Se măsoară aria secțiunii transversale a cardiomiocitelor, este crescută semnificativ după ISO și este scăzută în grupul tratat cu ECH, așa cum arată Figura 3E. Evaluările depunerii de colagen prin colorația Masson arată că conținutul de colagen din ventricul stâng la șobolanii HF este crescut în mod evident și aparent scăzut după tratamentul cu ECH, care scade în mod evident CVF. Analiza PCR în timp real dezvăluie că transcrierile de tip procolagen Ⅰ sunt reglate în sus la șobolanii ISO și reglate în jos la șobolanii ECH, aceste rezultate sunt în concordanță între ele, așa cum arată figurile 3B și FG, datele indică faptul că ECH reduce eficient depunerea de colagen. . Numărul de celule TUNEL pozitive din cardiomiocite este crescut semnificativ la șobolanii HF în comparație cu Ctrl, ECH reduce semnificativ apoptoza celulelor miocardice, iar Figura 3C-D prezintă imaginea reprezentativă a celulelor TUNEL-pozitive în câmpurile de putere mică și mare, respectiv, și Figura 3C-D. 3H arată rata de apoptoză a celulelor miocardice. Aceste rezultate indică faptul că ECH inversează eficient hipertrofia miocardică, fibroza interstițială miocardică și apoptoza și îmbunătățește funcția inimii la șobolanii HF indusă de ISO.

FIGURA 3 Rezultatele colorării histologice demonstrează că ECH inversează remodelarea ventriculară stângă a șobolanilor HF indusă de ISO.

3.3|ECH protejează ultrastructura miocardică la șobolanii HF

Rezultatele micrografiilor electronice de transmisie arată că deteriorarea ultrastructurii miocardice ar putea fi atenuată de ECH, așa cum arată Figura 4A-B. Miofibrilele sunt aranjate pe verticală, structura sarcomerului este evidentă, miofilamentele sunt ordonate, iar linia Z este clară. Mitocondriile sunt ordonate și structura este clară la șobolanii Ctrl. Cu toate acestea, miofibrilele sunt dezorganizate, rupte și dizolvate, structura sarcomerului este neclară, absența liniei Z, zona de contracție a miocardului este vizibilă, numărul și volumul mitocondriilor sunt crescute, mitocondriile au forme și dimensiuni diferite, dispuse în dezordine, structura este neclară, se umflă și se fragmentează crista, se prăbușește sau se adună și se dizolvă în vacuole la șobolanii HF. ECH atenuează în mod evident aceste modificări, majoritatea fibrelor musculare cardiace sunt ordonate, iar filamentele miocardice sunt clare, linia Z există, deși o oarecare dizolvare a filamentelor este evidentă, structura sarcomerului este clară, densitatea mitocondriale este scăzută, formele. iar dimensiunile sunt ușurate, aranjate mai ordonat, umflarea mitocondriilor și fragmentarea cristei, colapsul sau aglomerarea și vacuolizarea sunt în mod evident reduse de ECH comparativ cu HF. Umflarea mitocondriilor și fragmentarea cristei, colapsul sau aglomerarea și vacuolizarea parțială sunt identificate ca degenerare mitocondrială. Rezultatele demonstrează că ECH protejează în mod eficient ultrastructura miocardică și în special protejează morfologia mitocondrială la șobolanii HF, așa cum arată Figura 4C-F.

FIGURA 4 ECH protejează ultrastructura cardiomiocitelor și morfologia mitocondrială a șobolanilor HF induse de ISO.

3.4|ECH reglează expresia proteinei SIRT1, FOXO3a și MnSOD

Analiza Western Blot demonstrează că nivelul de expresie a proteinei SIRT1, FOXO3a și MnSOD este reglat în mod semnificativ în jos la șobolanii HF, cu toate acestea, ECH reglează în mod evident expresia scăzută a proteinei. Benzile de proteine ​​reprezentative ale imunoblotării și rezultatele analizei statistice sunt prezentate în Figura 5. O parte a datelor indică faptul că ECH crește expresia proteinei SIRT1, FOXO3a și MnSOD.

3,5|ECH inhibă stresul oxidativ mitocondrial în țesutul miocardic al ventriculului stâng

În această parte, sunt măsurate ROS mitocondrial, MMP, deteriorarea oxidativă a ADN-ului mitocondrial, conținutul de proteine ​​carbonil și nivelul de peroxidare a lipidelor în mitocondriile din țesutul miocardic ventricular stâng al șobolanilor, iar rezultatele sunt în concordanță cu experimentele cu celule, adică, ECH scade ROS mitocondrial, protejează MMP, ameliorează gradul de deteriorare al ADNmt, reduce conținutul de proteine ​​carbonil și peroxidarea lipidică în mitocondrie, așa cum arată Figura 6.

FIGURA 5 ECH reglează în sus nivelul de expresie a proteinei SIRT1, FOXO3a și MnSOD care este reglat în jos la șobolanii HF.

4|DISCUŢIE

Acest studiu demonstrează că ECH exercită roluri eficiente în prevenirea remodelării miocardice și îmbunătățirea funcției inimii prin reglarea în sus a axei de semnalizare SIRT1/FOXO3a/MnSOD și inhibarea stresului oxidativ mitocondrial.

Mitocondriile sunt locul principal de generare a ROS ca produs secundar al fosforilării oxidative, prin apropierea lor de ROS, proteinele mitocondriale, lipidele și ADNmt sunt considerate a fi ținte primare ale daunelor oxidative după emisia excesivă de ROS mitocondrial,34,35. această deteriorare stimulează producția în continuare de ROS, cercul vicios continuă, ROS și stresul oxidativ ar putea duce la hipertrofie miocardică, apoptoză, fibroză interstițială și IC prin activarea căilor multiple de semnalizare.35 Deci, se pare că medicamentele care au vizat inhibarea oxidative mitocondriale. stresul sunt eficiente pentru prevenirea remodelării miocardice. ECH este o glicozidă feniletanoid naturală, o componentă a plantei tradiționale chinezești Cistanche tubulosa. este studiat pe scară largă și s-a dovedit că posedă tipuri de activități farmacologice în ultimii ani, cum ar fi anti-tumoral, anti-apoptoză, anti-îmbătrânire, acțiune neuroprotectoare și așa mai departe. Studiile au demonstrat că acțiunile farmacologice ale ECH depind în principal de proprietatea sa de activitate antioxidantă și antiinflamatoare,18,21 și ECH scade ROS mitocondrial și protejează funcția mitocondrială împotriva daunelor oxidative în celulele nervoase.20,22 Aici, în primul rând, am demonstrat că ECH scade ROS mitocondrial al cardiomiocitelor, prin urmare, îmbunătățește MMP, reducând daunele oxidative ale ADNmt, proteinelor și lipidelor, inhibând eficient deteriorarea oxidativă mitocondrială și reducând apoptoza in vitro și in vivo, astfel încât inversează remodelarea miocardică și îmbunătățește funcția inimii. Înseamnă că ECH este un potențial medicament nou pentru prevenirea remodelării miocardice și a IC.

În condiții normale, ROS mitocondrial este eliminat în principal de MnSOD care se distribuie în mitocondrii și protejează împotriva daunelor oxidative mitocondriale. Ang II scade semnificativ expresia MnSOD a cardiomiocitelor și induce hipertrofia miocardică, cu toate acestea, resveratrolul ar putea crește expresia MnSOD și inhiba hipertrofia miocardică indusă de Ang II.36 În IC, activitatea MnSOD este semnificativ scăzută și generarea de ROS mitocondriale este crescută. .37,38 La șoarecii knockout genei MnSOD specifice cardiace, ROS mitocondrial nu a putut fi curățat și ROS este crescut în cardiomiocite, acest lucru a dus la disfuncție mitocondrială și creșterea progresivă a inimii, ducând în cele din urmă la insuficiență cardiacă.39 În studiul de față, confirmăm. că expresia MnSOD este redusă semnificativ, ceea ce este atenuat prin tratamentul cu ECH și, astfel, ROS mitocondrial este redus și stresul oxidativ mitocondrial este inhibat. Înseamnă că ECH protejează cardiomiocitele împotriva daunelor oxidative prin reglarea în sus a expresiei MnSOD, explorăm în continuare mecanismele moleculare care stau la baza acestor efecte.

Expresia MnSOD este reglată de FOXO3a, care este un factor de transcripție și se leagă în regiunea promotoare a genei a MnSOD și duce la promovarea transcripției genei.40 SIRT1 este o moleculară în amonte de FOXO3a și poate activa FOXO3a prin deacetilare. Axa de semnalizare SIRT1/FOXO3a/MnSOD joacă roluri esențiale în protecția împotriva stresului oxidativ în tipuri de celule, activarea axei de semnalizare de către estradiol inhibă stresul oxidativ și exercită protecția cardiacă24; Activarea axei de semnalizare de către resveratrol inhibă moartea celulară indusă de stres oxidativ40; În caz contrar, angiotensina II inhibă calea SIRT1/FoxO3a/MnSOD și induce stresul oxidativ mitocondrial, deteriorarea ADNmt la osteoblaste41, adenilil ciclaza de tip 5 crește stresul oxidativ prin inhibarea exprimării MnSOD prin intermediul Sirt1/FoxO3a calea studiului prezent42. expresia SIRT1, FoxO3a și MnSOD sunt toate reduse semnificativ la șobolanii HF și ROS mitocondrial este crescut și stresul oxidativ este îmbunătățit, cu toate acestea, modificările sunt inversate de ECH. Noile cercetări indică faptul că ECH leagă direct SIRT1 ca ligand și formează un complex cu 9 legături covalente și reglează în sus expresia SIRT1 în celulele nervoase.26 În concordanță cu acest studiu, prezentul studiu demonstrează că ECH reglează, de asemenea, expresia lui. SIRT1 în cardiomiocite, apoi reglează expresia genică a MnSOD prin FoxO3a și inhibă ROS mitocondrial și stresul oxidativ.

Ischemia cronică pe termen lung poate provoca hibernarea miocardică, aceste celule miocardice hibernante prezintă în mod obișnuit o pierdere a filamentelor contractile, există exces de granule de glicogen în citosol, reticulul sarcoplasmatic și se pierd tubulii transversali43, de asemenea, există anomalii în dimensiunea și forma mitocondriale. , hipertrofia miocardică reactivă și fibroza interstițială, care sunt secundare pierderii miocitelor.44 Am observat, de asemenea, modificările de mai sus la șobolanii HF în studiul nostru, în timp ce ECH ameliorează semnificativ aceste modificări, deoarece cel mai recent studiu a raportat recuperarea funcției cardiace după stresul ischemic poate fi un caracteristică a hibernării miocardice45, se măsoară și nivelul glicogenului miocardic, rezultatele indică faptul că nu există o diferență semnificativă între cele trei grupuri, așa cum se arată în Figura 7J.

Studiul anterior a detectat, de asemenea, hibernarea miocardică într-un model de porc cu insuficiență cardiacă non-ischemică, prin stimularea peretelui liber VS cu frecvență înaltă,46 deoarece obstrucția microvasculară joacă un rol important în hibernarea miocardică și în disfuncția contractilă care rezultă, iar aceasta este semnificativ îmbunătățită atunci când obstrucția microvasculară este inversată de un medicament47. În prezent, unele studii concluzionează că terapia de revascularizare este eficientă în hibernarea miocardului43, prin utilizarea colorației HE și Masson, observăm că densitatea capilară și arteriolară a miocardului sunt reduse în mod evident la șobolanii IC și sunt ameliorate semnificativ. prin ECH, așa cum se arată în Figura 7A-H. Studiile anterioare au demonstrat că alți compuși naturali, cum ar fi beta-glucanul de orz, exercită efecte cardioprotectoare prin creșterea expresiei MnSOD,48,49, iar creșterea MnSOD este legată de creșterea densității capilare miocardice și a expresiei VEGF. Am efectuat RT-PCR pentru a detecta expresia VEGF, datele sunt în concordanță cu descoperirea colorației histologice, ceea ce înseamnă că ECH poate promova angiogeneza și poate crește densitatea capilară miocardică prin reglarea expresiei VEGF, așa cum se arată în Figura 7I. Prezentul studiu constată că ECH poate proteja și crește miocardul capilar și arteriolar prin intermediul căii SIRTI/FOXO3a/MnSOD de reglare în sus și a expresiei VEGF, suprimând astfel miocardul hibernant și contribuind la îmbunătățirea funcției inimii.

Cistanche contribuielaîmbunătățirea funcției inimii.

Pentru mai multe informații, vă rugăm să faceți clic aici.

De notat, apoptoza cardiomiocitelor este bine cunoscută a fi o schimbare patologică importantă în insuficiența cardiacă, iar studiul de față confirmă într-adevăr că o cantitate mare de celule apoptotice la șobolanii HF și ECH reduce semnificativ apoptoza prin reglarea căii SIRTI/FOXO3a/MnSOD și inhibarea stresul oxidativ mitocondrial, așa cum sa menționat mai sus.

Mai presus de toate, ECH inversează remodelarea miocardică și îmbunătățește funcția inimii prin reglarea în sus a axei de semnalizare SIRT1/FoxO3a/MnSOD, inhibând astfel stresul oxidativ mitocondrial și reducând miocardul hibernant. Astfel, se sugerează că ECH este un medicament potențial pentru prevenirea sau tratamentul remodelării miocardice și IC.