Echinacozidul stimulează proliferarea celulară și previne apoptoza celulară în celulele epiteliale MODE-K intestinale prin reglarea în creștere a expresiei factorului de creștere- 1 transformator

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yamin Jia, Qiunong Guan, Yuhai Guo și Caigan Du

Abstract

Cistanche deserticola MA(C. deserticola) a fost utilizat pe scară largă ca laxativ pe bază de plante în medicina pe bază de plante pentru tratamentul sindromului colonului iritabil sau al constipației șiechinacoside din cistanche(ECH) este unul dintre ingredientele bioactive majore din această plantă. Scopul nostru a fost să investigăm efectul ECH asupra creșterii și morții celulelor epiteliale intestinale. MODE-K, o linie celulară epitelială intestinală, a fost utilizată ca model in vitro al intestinului. Proliferarea celulară a fost măsurată prin testul de metil tiazol tetrazoliu (MTT). Apoptoza celulară a fost determinată cu colorare cu anexină-V. Aici am arătat că în celulele MODE-K cultivate, ECH a stimulat în mod semnificativ proliferarea celulară și a îmbunătățit supraviețuirea celulară prin reducerea apoptozei celulare în prezența H2O2 sau a amestecului de citokine proinflamatorii, transformând în același timp factorul de creștere (TGF)- 1 expresia a fost reglată în sus într-o manieră dependentă de doză. Reducerea expresiei TGF- 1 a perturbat atât activitățile proliferative, cât și cele citoprotectoare ale ECH, ceea ce a fost confirmat în continuare prin neutralizarea activității TGF- 1 folosind anticorpul anti-TGF- 1. Aceste date sugerează că ECH, ca unul dintre ingredientele bioactive din plantele C. deserticola și altele, poate îmbunătăți repararea țesutului mucoasei prin stimularea proliferării celulelor epiteliale intestinale și prevenirea morții celulare prin reglarea în sus a TGF-.

Cuvinte cheie: Cistanche deserticola, epiteliu intestinal, proliferare celulară, apoptoză celulară, factor transformator de creștere (TGF)-

Introducere

Cistanche deserticola MA(C. deserticola) este cunoscut în mod obișnuit ca Rou Cong Rong în medicina chineză pe bază de plante și a devenit o cultură nouă în China datorită utilizării sale medicale (1). Beneficiul său clinic a fost raportat în tratamentul multor probleme de sănătate, inclusiv constipația cronică (2, 3), iar efectele sale benefice sunt asociate cu activitatea sa laxativă în intestin; îmbunătățește umezirea scaunului, promovând mișcarea intestinală la pacienți (4, 5), precum și la modelele animale (6, 7). Studiul nostru recent demonstrează că administrarea orală a unui extract apos de C. deserticola reduce semnificativ numărul de hiperplazie inflamatorie din intestinul șoarecilor predispuși la cancer colorectal (8).

Echinacoside din cistanche (ECH) is a major component of phenylethanoid glycosides (PhG) (>50 la sută din PhG total) izolat din C. deserticola (9) și a fost utilizat ca biomarker pentru controlul calității medicamentului laxativ care conține C. deserticola Ronggui Tongbian Capsule (10) sau pentru controlul calității producției de C. deserticola cultivat (11). S-a demonstrat că ECH este citoprotector atât într-un model animal al bolii Parkinson (12, 13) cât și într-un model de leziune pulmonară (14) și în celulele feocromocitom cultivate (PC12) (15, 16); și s-a demonstrat că îmbunătățește diviziunea celulară a celulelor fibroblastice umane (MRC-5) (17). În acest studiu, a fost examinat efectul ECH ca ingredient bioactiv major al C. deserticola asupra proliferării și supraviețuirii celulelor în celulele epiteliale intestinale cultivate pentru a înțelege acțiunea farmacologică a medicamentului pe bază de plante care conține C. deserticola în tratamentul tulburărilor intestinale. .

Materiale și metode

Cultură de celule

MODE-K este o linie celulară epitelială intestinală derivată de la șoareci C3H/HeJ (18) care au fost furnizate cu amabilitate de Dr. Theodore Steiner (Institutul de Cercetare în Sănătate de Coastă din Vancouver, Vancouver, Canada). Celulele MODE-K au fost cultivate în mediu Eagle modificat de Dulbecco (DMEM), suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS) la 37 de grade sub o atmosferă de 5% CO2 în aer.

echinacozid din cistanche (ECH) pregătire

ECH (echinacoside din cistanche) a fost purificat în continuare din extractul comercial de C. tubulosa (conținând ECH mai mare sau egal cu 70 la sută, Tianlife TLCT-E70; Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, China) prin extracție repetată cu etanol, urmată de aer- uscare într-o hotă chimică. Substanța rămasă a fost uscată în continuare prin liofilizare. ECH în produsul final a fost confirmat prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (Fig. 1).

Reducerea expresiei factorului de creștere transformator (TGF)- 1

Expresia TGF- 1 în celulele MODE-K a fost eliminată prin expresia stabilă a ARNsh în mod specific împotriva transcriptului TGF- 1 (19). Pe scurt, secvențe de oligonucleotide pentru generarea de ARNsh care vizează ARNm de TGF- 1 de șoarece (5′-AAC CAA GGA GAC GGA ATA CAG{-3′) și control nespecific (cotolit) (5′-AAT CGC) ATA GCG TAT GCC GTT-3′) au fost descrise anterior (19, 20) și au fost sintetizate de Integrated DNA Technologies Inc. (Coralville, IA, SUA). Fiecare secvență a fost legată într-un vector pHEX-siARN (21). Vectorii au fost transfectați în celule MODE-K utilizând Lipofectamine2000 (Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, SUA) urmând protocolul producătorului. Atât celulele transfectate cu shRNA anti–TGF- 1 (MODE-Ktgfb) cât și celulele transfectate cu shRNA (MODE-Kscr) au fost crescute în prezența zeocinei (până la 500 ug/mL) (Invitrogen-Gibco) și selectate prin sortarea celulelor utilizând citometria în flux pentru proteina fluorescentă verde (GFP). Mai mult de 95 la sută din celulele transfectate au prezentat fluorescență verde puternică în citometrie în flux sau microscopie.

Test de metiltiazol tetrazoliu (MTT).

Testul MTT a fost utilizat pentru a măsura proliferarea celulară sau viabilitatea în culturi. Celulele au fost însămânțate la 2500 pe godeu în microplăci cu 96-godeuri și fiecare stare a fost testată cel puțin în patru exemplare. Pe scurt, 10 μL de 0,5 mg/mL de 3-(4,5-dimetiltiazol{-2-il){-2,5-bromură de difeniltetrazoliu (MTT; Sigma- Aldrich Canada, Oakville, ON, Canada) au fost adăugate în fiecare godeu și incubate la 37 de grade timp de 4 ore. Cristalele de formazan din celulele viabile au fost apoi dizolvate în 100 μL/godeu de dimetil sulfoxid (DMSO, Sigma-Aldrich Canada). Absorbanța culorii în fiecare godeu a fost cuantificată ca unități de absorbanță (AU) la o lungime de undă de 560 nm folosind un cititor de microplăci ELx808 Ultra (BioTek, Winooski, VT, SUA). Procentul de modificare a proliferării celulare în culturile tratate cu medicament față de controlul netratat cu medicament a fost calculat după cum urmează: procent=(tratat cu medicament - Control) / Control × 100 la sută . Rata de creștere a fost calculată după cum urmează: Rata de creștere (AU/zi)=(AUend − AUbegin) / timp (zi), unde timpul a reprezentat perioada examinării, AUend a reprezentat unitățile de absorbanță la sfârșitul examinării , iar AU începe reprezentat unitățile de absorbanță la începutul examinării.

Analiza de sortare a celulelor activate prin fluorescență (FACS) a apoptozei

Analiza FACS cu anexin-V-ficoeritrină (Anexin-V-PE) și colorație cu 7-amino-actinomicină D ({7-AAD) a fost utilizată pentru determinarea apoptozei celulare (pozitiv pentru anexină-V: apoptoză timpurie). ; 7-AAD: apoptoză tardivă/necrotică) conform protocolului producătorului (BD Biosciences, San Jose, CA, SUA). Astfel, în graficul FACS, celulele viabile se aflau în cadranul din stânga jos, celulele apoptotice târzii în cadranul din stânga sus (7-numai AAD pozitiv), celulele apoptotice în cadranul din dreapta sus (atât Annexin-V, cât și {{ 10}}AAD pozitiv) și celule apoptotice timpurii din cadranul din dreapta jos (numai anexin-V pozitiv). Pe scurt, după tratament, celulele au fost eliberate prin incubare scurtă cu soluție de tripsină-EDTA (Sigma Aldrich Canada) și apoi incubate cu Annexin-V-PE în tampon de legare 1 x timp de 15 minute. După ce au fost spălate cu PBS, celulele au fost colorate cu 7-AAD. Intensitatea fluorescenței celulelor apoptotice a fost măsurată utilizând citometria în flux și analizată în comparație cu controalele de fond folosind software-ul CELLQUEST (BD Biosciences) sau FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR, SUA).

Reacția în lanț a polimerazei de transcripție inversă semicantitativă (RT-PCR)

Nivelurile de ARNm de TGF{{0}} au fost determinate semicantitativ în comparație cu cele ale gliceraldehide-3- fosfat dehidrogenazei (GAPDH) ca control intern folosind kituri RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). ) așa cum este descris anterior (19). Atât transcrierile TGF- 1, cât și GAPDH din același preparat de ADNc au fost amplificate prin PCR cu 35 de cicluri de 94 de grade timp de 1 min, 57 de grade timp de 1 min și 15 s și 72 de grade timp de 1 min și 30 s după inițial etapa de denaturare la 94 de grade timp de 1 min. A fost adăugată o etapă finală de extensie la 72 de grade timp de 10 minute. Perechile de primeri specifice pentru TGF- 1 și GAPDH au fost derivate dintr-un raport anterior (19) (mTGF{- 1: sens, 5′-TAC TAT GCT AAA GAG GTC ACC CGC și anti-sens, 5 ′- CTG TAT TCC GTC TCC TTG GTT CAG; mGAPDH: sens, 5′-ATC ACT GCC ACC CAG AAG ACT G și anti-sens, 5′-CCC TGT TGC TGT AGC CGT ATT C). Produsul PCR rezultat (25 μL) a fost supus electroforezei pe un gel de agaroză 1% în tampon Tris-acetat-EDTA (TAE) care conține 0,5 ug/mL de bromură de etidio și vizualizat sub lumină UV. Nivelurile de expresie ale TGF- 1 au fost comparate semicantitativ cu cele ale GAPDH.

Western blot

Nivelurile celulare de TGF- 1 au fost examinate prin western blot așa cum s-a descris anterior (19). Benzile de proteine ​​TGF- 1 din pete au fost identificate cu anti-TGF- 1 (A75-3) monoclonal (BD Biosciences). Aceeași pată a fost sondată din nou utilizând IgG anti-actină (Sigma-Aldrich Canada) pentru confirmarea proteinei încărcate în fiecare probă.

Testul imunosorbent legat de enzime (ELISA) Nivelurile de TGF- 1 secretat în supernatanții de cultură au fost determinate prin ELISA. Celulele MODE-K (1,8 × 105 celule/godeu în 0,5 ml de mediu DMEM) în plăci de godeuri 24-în trei exemplare au fost crescute peste noapte, urmată de incubare în absența sau prezența ECH(echinacoside din cistanche). Supernatanții de cultură au fost colectați după 24 de ore de tratament și cantitatea de eliberare de TGF- 1 a fost determinată utilizând sistemul TGF 1 Emax® ImmunoAssay System urmând protocolul producătorului (Promega, Madison, WI, SUA).

analize statistice

Analiza varianței unidirecționale sau bidirecționale (ANOVA) a fost utilizată după caz ​​pentru comparații între grupuri. Datele au fost colectate de la 3 până la 4 experimente individuale în fiecare studiu pentru analiză statistică. O valoare P mai mică sau egală cu 0,05 a fost considerată semnificativă.

Rezultate

Stimularea proliferării celulare în culturi de celule MODE-K

Proliferarea celulară este esențială pentru repararea țesuturilor. Efectul ECH(echinacoside din cistanche)asupra proliferării celulare a fost examinată în celule MODE-K cultivate. După cum se arată în Fig. 2A, adăugarea de ECH a stimulat proliferarea celulară, măsurată prin creșterea viabilității celulare folosind testul MTT, într-o manieră dependentă de doză. Comparativ cu numărul de celule din culturile netratate cu medicamente, numărul de celule din culturile tratate cu ECH a crescut cu 25,6% ± 14,82% în culturile cu 6,26 ug/mL de ECH, 33,6% ± 14.0% cu 25. ug/mL de ECH, 64,4 la sută ± 9,0 la sută cu 5{0 ug/mL de ECH și 99,4 la sută ± 11,7 la sută cu 1{00 ug/ mL de ECH după incubare de 48-h (P < 0.0{{50}}01).="" pentru="" a="" confirma="" în="" continuare="" această="" observație,="" a="" fost="" examinat="" efectul="" ech="" asupra="" curbei="" de="" creștere="" a="" celulelor="" mode-k="" într-o="" perioadă="" de="" timp="" de="" {{3{0}}zile.="" după="" cum="" se="" arată="" în="" fig.="" 2b,="" adăugarea="" de="" 10="" ug/ml="" optimizat="" de="" ech="" a="" crescut="" semnificativ="" numărul="" de="" celule="" viabile="" după="" timpul="" de="" incubare="" în="" comparație="" cu="" cele="" din="" culturile="" netratate="" cu="" medicamente="" (un="" control="" bazal),="" indicat="" de="" creșterea="" au="" pentru="" culturile="" cu="" ech="" de="" la="" 0,3{{70}}="" ±="" 0,02="" la="" începutul="" tratamentului="" cu="" ech="" (0-punct="" de="" timp)="" la="" 1,49="" ±="" 0,08="" după="" 2="" zile="" de="" incubare="" și="" 2,20="" ±="" 0,11="" după="" 4="" zile="" de="" incubare,="" în="" timp="" ce="" pentru="" culturile="" netratate="" cu="" medicamente="" (numai="" medii)="" creșterea="" a="" fost="" de="" la="" 0,24="" ±="" 0,01="" la="" început="" la="" 1,22="" ±="" 0,12="" după="" 2="" zile="" și="" 1,0,61="" ±="" 1,0,08="" după="" 4="" zile="" (mediu="" vs.="" ech,="" p="">< 0,0001).="" ratele="" de="" creștere="" în="" aceste="" două="" culturi,="" calculate="" pe="" baza="" curbei="" de="" creștere="" (fig.="" 2b),="" au="" indicat="" că="" ech="" a="" îmbunătățit="" semnificativ="" ratele="" de="" creștere="" în="" culturi="" atât="" în="" ​​ziua="" 2="" (0,56="" în="" culturile="" tratate="" cu="" ech="" față="" de="" 0,35="" în="" martorii="" netratați="" cu="" medicamente)="" și="" ziua="" 3="" (0,43="" în="" culturile="" tratate="" cu="" ech="" față="" de="" 0,22="" în="" martorii="" netratați="" cu="" medicamente)="" (fig.="" 2c).="" luate="" împreună,="" aceste="" date="" indică="" faptul="" că="" ech="" stimulează="" proliferarea="" celulară="" în="" celulele="" epiteliale="" intestinale="">

Fig. 2. Stimularea creșterii celulare în celulele epiteliale intestinale cultivate prin ECH. Celulele MODE-K (2,500 celule/godeu) au fost însămânțate în plăci cu 96-godeuri peste noapte, urmată de incubare în prezența sau absența ECH. Numărul de celule viabile din culturi a fost măsurat prin test MTT. A) Culturile au fost tratate cu diferite concentrații de ECH timp de 48 de ore. Creșterea (procentul) a numărului de celule în culturile tratate cu ECH a fost calculată pe baza culturilor netratate cu medicamente ca referință de bază. P < 0,0001="" (anova="" unidirecțional).="" b)="" culturile="" au="" fost="" tratate="" cu="" 10="" ug/ml="" de="" ech="" timp="" de="" 4="" zile.="" curbele="" de="" creștere="" ale="" culturilor="" tratate="" cu="" ech="" față="" de="" culturile="" netratate="" cu="" medicamente="" (numai="" mediu)="" au="" fost="" determinate="" de="" unitățile="" de="" absorbanță="" (au)="" la="" 560="" nm="" în="" testul="" mtt.="" p="">< 0,0001="" (mediu="" vs.="" ech,="" anova="" bidirecțional).="" datele="" sunt="" prezentate="" ca="" medie="" ±="" derivația="" standard="" (sd)="" a="" experimentelor="" independente.="" c)="" rata="" de="" creștere="" (modificare="" au/zi)="" a="" fost="" calculată="" pe="" baza="" creșterii="">e, numărul mediu din fiecare zi.

Protecția celulelor MODE-K de apoptoză

Protejarea celulelor de apoptoză este un mecanism de prevenire a leziunilor tisulare ulterioare. Activitatea citoprotectoare a ECH(echinacoside din cistanche)a fost examinat în celule MODE-K cultivate stimulate cu peroxid de hidrogen (H2O2) sau amestec de citokine proinflamatorii (TNF- și IFN-). H2O2 este o specie reactivă de oxigen generată de metabolismul oxidativ și reprezintă un scenariu de stres oxidativ, în timp ce TNF- și IFN- sunt citokine proeminente produse de celulele imune activate care au reflectat situația sub inflamația mediată imun. După cum se arată în Fig. 3, adăugarea de ECH (50 ug/mL) a redus semnificativ apoptoza, inclusiv nivelul său bazal în culturile tratate cu H2O2, evidențiată de o scădere a apoptozei de la nivelurile bazale de 5,3{{47 }} la sută ± 1,24 la sută în culturi netratate cu medicamente la 3,76 la sută ± 1.01 la sută în culturile tratate cu ECH, de la 26,93 la sută ± 1.86 la sută în culturile netratate cu medicamente la 14,08 la sută ± 1,30 la sută în culturile tratate cu ECH în prezența a 0,3 μM de H2O2 și de la 38,90 la sută ± 1,76 la sută în culturile netratate cu medicamente la 19,88 la sută ± 1,02 la sută în culturile tratate cu ECH în prezența a 0,6 μM de H2O0001 ( , mediu/netratat cu medicamente vs. tratat cu ECH). Un efect citoprotector similar al ECH a fost observat în culturile stimulate cu amestec de citokine (Fig. 4); apoptoza (51,5 la sută ± 6,30 la sută) în culturile fără adăugarea de ECH (martori medii/netratați cu medicamente) a fost semnificativ mai mare decât cea (38,50 la sută ± 5,60 la sută) în culturile tratate cu ECH (P=0.0204, mediu/netratat cu medicamente vs. tratat cu ECH), sugerând că ECH a protejat celulele MODE-K de apoptoza indusă de citokine proinflamatorii. Luate împreună, ECH are activitate citoprotectoare împotriva apoptozei celulare indusă de oxidarea H2O2, precum și citotoxicitatea citokinelor proinflamatorii.

Reglarea în sus a expresiei TGF- în celulele MODE-K cultivate

Dovezile din literatură sugerează că TGF- 1 joacă un rol important în leziunile și repararea țesuturilor (22, 23) și în recuperarea tractului gastrointestinal din colită sau boli inflamatorii intestinale (24). Pentru a examina dacă TGF- 1 joacă un rol în proliferarea celulară indusă de ECH și citoprotecția în celulele epiteliale intestinale cultivate, așa cum s-a demonstrat mai sus, efectul ECH(echinacoside din cistanche)a fost examinată expresia TGF{{0}} în celule MODE-K cultivate. Nivelurile de transcriere ale TGF- 1 au fost examinate prin RT-PCR semicantitativă, în timp ce nivelurile de proteine ​​ale acestuia au fost determinate prin western blot (niveluri celulare totale) sau prin ELISA (niveluri de proteine ​​secrete). După cum se arată în Fig. 5A, reglarea în creștere dependentă de doză a nivelurilor de ARNm de TGF- 1 a fost observată în culturile tratate cu ECH atât la 24, cât și la 48 de ore după adăugarea de ECH. O tendință similară de creștere a nivelurilor de proteină TGF{{10}} în interiorul celulelor a fost demonstrată prin analiza Western blotting (Fig. 5B). După incubare de 24-h în 0,5 ml de mediu de cultură care conține diferite concentrații de ECH, nivelurile secretate de TGF- 1 au fost, de asemenea, crescute într-o manieră independentă de doză; de la 186,4 ± 18,39 pg/mL în culturi netratate cu medicamente (niveluri bazale) la 186,4 ± 18,39 pg/mL în culturi cu 25 ug/mL de ECH, 263,4 ± 14,14 pg/mL cu 50 ug/mL de 56 ug/mL, și 26 ug/mL de ECH. 15,56 pg/mL cu 100 ug/mL de ECH (P < 0,0001).="" toate="" aceste="" date="" indică="" în="" mod="" clar="" că="" ech="" crește="" producția="" de="" tgf-="" 1="" în="" celulele="" epiteliale="" intestinale="" din="">

Pierderea stimulării creșterii și a citoprotecției echinacozidei prin distrugerea genetică a expresiei TGF- 1

Pentru a clarifica dacă TGF- 1 a contribuit la stimularea creșterii și reducerea apoptozei în ECH(echinacoside din cistanche)celulele tratate, expresia TGF- 1 în celulele MODE-K a fost eliminată prin exprimarea stabilă a ARNsh anti-TGF{- 1, prin care a fost generată o nouă linie celulară MODE-Ktgfb. Expresia proteinei TGF- 1 a fost redusă în mare măsură în celulele MODE-Ktgfb în comparație cu cea din celulele MODE-Kscr care exprimau stabil shRNA amestecat (Fig. 6A). După cum se arată în Fig. 6B, stimularea proliferativă a ECH a fost afectată semnificativ în celulele MODE-Ktgfb; similar cu răspunsul proliferativ la ECH în celulele parentale MODE-K (Fig. 2), numărul de celule viabile a fost crescut în celulele MODE-Kscr după stimularea ECH, creștere cu 28,3% ± 12,4% în culturi cu 25 ug/mL de ECH, Creștere cu 54,2% ± 6,8% cu 5{{3{0}} ug/mL de ECH și 122,7% ± 2{0},8% creștere în culturi cu 100 ug/mL de ECH. În contrast, numărul de celule a fost scăzut în prezența ECH în culturile de celule MODE Ktgfb, scădere cu 12,0% ± 5,0% în culturi cu 25 ug/mL de ECH, 18,3% ± 4,1% scădere cu 50 ug/mL de ECH și 30,4 la sută ± 3,3 la sută a scăzut cu 100 ug/mL de ECH. Analiza statistică cu ANOVA bidirecțională a indicat diferența semnificativă a răspunsului proliferativ la ECH între aceste două grupuri (P < 0,0001).="" aceste="" date="" sugerează="" că="" pierderea="" expresiei="" tgf-="" 1="" în="" celulele="" epiteliale="" intestinale="" afectează="" stimularea="" creșterii="">

Pentru a examina în continuare dacă expresia TGF- 1 reglată în sus în ECH(echinacoside din cistanche)celulele tratate au dus la reducerea apoptozei, activitatea anti-apoptotică a ECH a fost examinată în celulele MODE-Ktgfb față de celulele MODE-Kscr. După cum se arată în Fig. 6C, în comparație cu culturile de celule MODE-Kscr, nivelurile de apoptoză au fost mai mari în culturile de celule MODE-Ktgfb în absența citokinelor (11,2% ± 0,42% în MODE-Ktgfb vs. .9,6% ± 0,99% în MODE-Kscr) și în prezența citokinelor (20,95% ± 0.07% în MODE- Ktgfb vs. 15,4 la sută ± 1,56 la sută în MODE-Kscr) (P=0.{0{{60}}13), sugerând că TGF{- 1 este un anti -factor apoptotic în celulele MODE K. Adăugarea de ECH (50 ug/mL) la culturile de celule MODE-Kscr a redus semnificativ nivelurile bazale de apoptoză (9,6 la sută ± 0,99 la sută în cazul netratate cu medicamente față de 8,3 la sută ± 0,43 la sută la tratate cu ECH) și 30,2 la sută din reducerea apoptozei a fost găsită în culturile stimulate cu citokine (15,4 la sută ± 1,56 la sută la tratate nemedicament vs. 10,75 la sută ± 1,05 la sută la tratate cu ECH). Cu toate acestea, în culturile de celule MODE-Ktgfb, ECH nu a redus nivelurile bazale de apoptoză (11,2 la sută ± 0,42 la sută la non-medicament tratate față de 12,0 la sută ± 0,43 la sută la tratate cu ECH) și doar 16,71 la sută din reducerea apoptozei, comparativ cu 30,2 la sută în culturile de celule MODE-Kscr, a fost observată în culturile stimulate cu citokine (20,95 la sută ± 0,07 la sută în non-medicament tratate față de 17,45 la sută ± 0,35 la sută în tratate cu ECH). Aceste date indică faptul că reducerea expresiei TGF- 1 în celulele epiteliale intestinale agravează apoptoza și scade activitatea citoprotectoare a ECH.

Pierderea stimulării creșterii și citoprotecției ECH(echinacoside din cistanche)prin neutralizarea activității TGF- 1 folosind anticorpi

Pentru a confirma în continuare că TGF- 1 ar putea fi necesar pentru stimularea creșterii și citoprotecția ECH(echinacoside din cistanche)în celulele epiteliale intestinale, așa cum este descris mai sus (Fig. 6), efectul neutralizării anticorpului anti-TGF- 1 (Clona 9016; R&D Systems Inc. Minneapolis, MN, SUA) asupra ECH-mediat proliferarea și supraviețuirea celulelor au fost examinate în culturi de celule MODE-K. După cum se arată în Fig. 7A, adăugarea de ECH (25 ug/mL) a stimulat o creștere cu 44,3% ± 8,2% a numărului de celule la martorii netratați cu anticorpi, dar în prezența anticorpului anti-TGF- 1 , 11,3% ± 9,10% pierdere a numărului de celule a fost observată în aceleași culturi tratate cu ECH, ceea ce sugerează că activitatea de neutralizare a TGF{- 1 a diminuat stimularea creșterii ECH în celulele epiteliale intestinale. Experimentele ulterioare au demonstrat că anticorpul anti-TGF- 1 a neutralizat și activitatea citoprotectoare a ECH în culturile de celule MODE-K; adăugarea de ECH a scăzut apoptoza de la 4,37% ± 1,19% în culturile netratate cu medicamente la 1,72% ± {{5{0}},01% în culturile tratate cu ECH după 24 de ore de incubație și de la 11,13% ± 1,12 la sută în culturile netratate cu medicamente până la 9,13 la sută ± 0,02 la sută în culturile tratate cu ECH după 48 de ore de incubare (nemedicament/mediu vs. ECH, ANOVA bidirecțional, P=0.0001). Cu toate acestea, în prezența anticorpului anti-TGF- 1 apoptoza în culturile tratate cu ECH (2,88 la sută ± 0,01 la sută după 24-h incubare; 12,58 la sută ± 0,02 la sută după 48-h incubare ) nu au fost semnificativ diferite de cele din culturile martor (netratate cu medicamente) (ANOVA bidirecțional, P=0.9427), ceea ce implică faptul că anticorpul anti-TGF{- 1 interferează cu supraviețuirea mediată de ECH în intestin. celule epiteliale.

Discuţie

ECH(echinacoside din cistanche)nu este doar un PhG major în extractul de plante Cistanche spp. dar se găsește și în multe alte plante medicinale precum Echinacea spp. (25, 26). S-a raportat că acest compus natural are activitate antioxidantă in vitro și in vivo (13, 27, 28). Cu toate acestea, mecanismul (mecanismul) acțiunii sale rămâne necunoscut. Rezultatele noastre din studiul de față demonstrează pentru prima dată într-un model in vitro că ECH stimulează proliferarea și supraviețuirea celulelor epiteliale intestinale, care este dependentă de TGF- 1.

Adăugarea de ECH(echinacoside din cistanche)reduce apoptoza celulară în celulele MODE-K tratate cu H2O2- sau cu amestecuri de citokine proinflamatorii (TNF- și IFN-) (Figurile 3 și 4) și, de asemenea, în alte tipuri de celule (16, 29) și distrugerea exprimării TGF- 1 sau blocarea activității sale are ca rezultat abolirea activității sale anti-apoptotice (Fig. 6 și 7), indicând faptul că citoprotecția ECH depinde de producția de TGF{- 1 (Fig. 5). Studiul nostru anterior a arătat că TGF- 1 induce expresia Bcl-2 anti-apoptotică și previne apoptoza mediată de TNF în celulele epiteliale tubulare renale (19). Descoperiri similare au fost raportate în alte tipuri de celule; adăugarea de TGF- 1 în celulele endoteliale ale arterei pulmonare cultivate reglează în sus nivelul inițial al Bcl-2 și previne apoptoza indusă de privarea serică și blocarea receptorului factorului de creștere endotelial vascular (VEGF) (30); iar în celulele progenitoare neuronale (NPC) cultivate, îmbunătățește (cu aproximativ 76 la sută) supraviețuirea celulară împotriva tratamentului cu H2O2, care este corelat cu reglarea în sus a expresiei Bcl-2 (31). Deși efectul ECH asupra expresiei Bcl-2 în celulele MODE-K nu este examinat în acest studiu, corelația reglării Bcl{-2 cu activitatea anti-apoptotică a ECH a fost raportată în TNF - celule neuronale SHSY5Y tratate (29) sau celule PC12 tratate cu H2O2-(15). Luate împreună, aceste date sugerează că activitatea anti-apoptotică a ECH poate fi mediată de TGF- 1 printr-o cale Bcl-2.

Este posibil ca citoprotecția ECH(echinacoside din cistanche)ar putea contribui la o ușoară creștere a numărului de celule viabile prin scăderea morții celulare spontane la sfârșitul incubației, dar adăugarea de ECH (100 ug/mL) aproape dublează celulele viabile după 48-h tratament (Fig. 2A) , sugerând că ECH stimulează într-adevăr proliferarea celulară, ceea ce este confirmat în continuare de datele din Fig. 2, B și C. Un efect similar al ECH a fost raportat în celulele fibroblastice umane, MRC-5 (17): în MRC{ {6}} culturi celulare, ECH ar putea întârzia senescența celulară prin inducerea ciclului celular din faza G1 la faza S și faza G2. La fel ca activitatea anti-apoptotică a ECH, activitatea proliferativă a ECH este dependentă de TGF- 1 (Figurile 6 și 7) care a fost bine documentat a fi o citokină multifuncțională (32, 33). TGF- poate stimula proliferarea celulară sau poate induce oprirea creșterii în funcție de tipul celular sau de micromediul extracelular; activează mai multe căi de semnalizare, inclusiv Smads și non-Smads (de exemplu, protein kinazele activate de mitogen) (34, 35), dar care cale mediază proliferarea celulară stimulată ECH/TGF în celulele MODE-K necesită investigații suplimentare.

Până în prezent, se știe puțin despre proteina (proteinele) țintă a ECH(echinacoside din cistanche)sau căile de semnal pe care le reglează. Un studiu arată că tratamentul cu ECH crește nivelurile celulare de guanozin monofosfat ciclic (cGMP) în celulele endoteliale (36), iar adăugarea de 8-Bromo-cGMP crește modest expresia TGF- 1 în fibroblastele cardiace (37) ). Cu toate acestea, dacă tratamentul cu ECH crește cGMP și prin care ECH stimulează expresia TGF- 1 în celulele epiteliale intestinale cultivate, necesită investigații suplimentare.

În concluzie, studiul nostru demonstrează că ECH(echinacoside din cistanche)induce producția de TGF- 1 care mediază proliferarea celulară și supraviețuirea celulelor în celulele epiteliale intestinale cultivate. Semnalizarea TGF în epiteliul intestinal este necesară pentru repararea sau vindecarea leziunilor mucoasei la șoarecii cu colită indusă de sulfat de dextran sodiu (38), sugerând că ECH, probabil C. deserticola din plante care conține ECH sau altele, poate avea potențial terapeutic pentru promovarea leziunilor mucoasei. repararea la pacienti.

Confirmare

YJ a fost susținut de o bursă pentru studenți absolvenți de la China Scholarship Council, China.

Referințe

1 Xu R, Chen J, Chen SL, Liu TN, Zhu WC, Xu J. Cistanche deserticola Ma cultivat ca o nouă cultură în China. Genet Resour Crop Evol. 2009;56:137–142.

2 Jiang Y, Tu PF. Analiza constituenților chimici la speciile Cistanche. J Chromatogr A. 2009;1216:1970–1979.

3 Tu PF, Wang B, Deyama T, Zhang ZG, Lou ZC. [Analiza glicozidelor feniletanoide ale Herba Cistanchis prin RP-HPLC]. Yao Xue Xue Bao (Acta Pharm Sin). 1997;32:294–300. (text în chineză cu rezumat în engleză)

4 Huang X, Li Z. [Eficacitatea clinică a soluției care conține Cistanche în tratamentul constipației după accident vascular cerebral]. Zhongguo Zhang Xi Yi Jie He Za Zhi (Chin J Integrated Trad West Med). 2002;22:622–623. (in chineza)

5 Zhang B, Lu X, Zhang R, Li L, Li C. [Studiu asupra acțiunii laxative a Cistanche deserticola]. Zhong Yao Cai (J Chin Med Mater). 1992;15:33–35. (in chineza)

6 Tu P, Li S, Li Z, Wang C, Lou Z. [Comparație privind umezirea intestinelor și laxarea herba Cistanches]. Nat Prod Res Dev. 1997;11:48–51. (text în chineză cu rezumat în engleză)

7 Zhang B, Zhao X, Chen S, Liu L, Cheng H. [Acțiunea laxative a părților separate din herba Cistanche]. Zhongguo Zhongyiyao Xinxi Zazhi (Chin J Inform Trad Chin Med). 2003;10:31–32. (text în chineză cu rezumat în engleză)

8 Jia Y, Guan Q, Guo Y, Du C. Reducerea hiperplaziei inflamatorii în intestin la șoarecii predispuși la cancerul de colon prin extract de apă de Cistanche deserticola. Phytother Res. In presa.

9 Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. Activitatea antioboseală a extractului bogat în feniletanoizi din Cistanche deserticola. Phytother Res. 2010;24:313–315.

10 Jing M, Song S, Li J. [Studiu asupra procesului de extracție și purificare a capsulei Ronggui Tongbian]. Modern Chin Med. 2009;11: 18–20. (text în chineză cu rezumat în engleză)

11 Wu Y, Shi HM, Bao Z, Wang MY, Tu PF, Li XB. Aplicarea markerilor moleculari în estimarea calității producției de Cistanche deserticola cultivată. Biol Pharm Bull. 2010;33:334–339.

12 Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Efectele neuroprotective ale echinacozidei în modelul MPTP la șoarece al bolii Parkinson. Eur J Pharmacol. 2007;564:66–74.

13 Zhao Q, Gao J, Li W, Cai D. Efectele neurotrofice și neurorescue ale echinacozidei în modelul subacut de șoarece MPTP al bolii Parkinson. Brain Res. 2010;1346:224–236.

14 Zhang Y, Xing J, Ai T, Wen T, Guan L, Zhao J. Protecția echinacozidei împotriva leziunilor pulmonare acute cauzate de acid oleic la șobolani. Radic liber Res. 2007;41:798–805.

15 Kuang R, Sun Y, Yuan W, Lei L, Zheng X. Efectele protectoare ale echinacozidei, una dintre glicozidele feniletanoide, asupra citotoxicității induse de H2O2- în celulele PC12. Planta Med. 2009;75: 1499–1504.

16 Kuang R, Sun Y, Zheng X. Suprimarea oxidului nitric implicată în efectul protector al echinacozidei asupra leziunii celulelor PC12 induse de H2O2-. Nat Prod Commun. 2010;5:571–574.

17 Xie H, Zhu H, Cheng C, Liang Y, Wang Z. Echinacozidul retardează senescența celulară a celulelor fibroblastice umane MRC-5. Pharmazie. 2009;64:752–754.

18 Vidal K, Grosjean I, Evillard JP, Gespach C, Kaiserlian D. Imortalizarea celulelor epiteliale intestinale de șoarece de către gena T mare SV40-. Caracterizarea fenotipică și imună a liniei celulare MODE-K. J Immunol Methods. 1993;166:63–73.

19 Guan Q, Nguan CY, Du C. Expresia factorului de creștere transformator-beta1 limitează afectarea ischemiei-reperfuziei renale. Transplantul. 2010;89:1320–1327.

20 Hwang M, Kim HJ, Noh HJ, Chang YC, Chae YM, Kim KH și colab. TGF-beta1 siRNA suprimă fibroza tubulointerstițială în rinichiul obstrucției ureterale. Exp Mol Pathol. 2006;81: 48–54.

21 Du C, Wang S, Diao H, Guan Q, Zhong R, Jevnikar AM. Creșterea rezistenței celulelor epiteliale tubulare la apoptoză prin terapia shRNA ameliorează leziunea ischemiei-reperfuzie renală. Am J Transplant. 2006;6:2256–2267.

22 Douglas HE. TGF-ss în vindecarea rănilor: o revizuire. J Îngrijirea rănilor. 2010;19:403–406.

23 Grande JP. Rolul transformării factorului de creștere-beta în leziunile și repararea țesuturilor. Proc Soc Exp Biol Med. 1997;214:27–40.

24 Monteleone G, Boirivant M, Pallone F, MacDonald TT. TGF beta1 și Smad7 în reglementarea IBD. Imunol mucoase. 2008;1 Suppl 1:S50–S53.

25 Bauer R, Foster S. Analiza alcamidelor și a derivaților de acid cafeic din simularea Echinacea și rădăcina E. paradoxa. Planta Med. 1991;57:447–449.

26 Perry NB, Burgess EJ, Glennie VL. Standardizarea echinaceei: metode analitice pentru compuși fenolici și niveluri tipice la speciile medicinale. J Agric Food Chim. 2001;53:849–857.

27 Pellati F, Benvenuti S, Magro L, Melegari M, Soragni F. Analysis of phenolic compounds and radical scavenging activity of Echinacea spp. J Pharm Biomed Anal. 2004;35:289–301.

28 Wu Y, Li L, Wen T, Li YQ. Efectele protectoare ale echinacozidei asupra hepatotoxicității induse de tetraclorura de carbon la șobolani. Toxicologie. 2007;232:50–56.

29 Deng M, Zhao JY, Tu PF, Jiang Y, Li ZB, Wang YH. Echinacozidul salvează celulele neuronale SHSY5Y de apoptoza indusă de TNFalfa. Eur J Pharmacol. 2004;505:11–18.

30 Lu Q. Transforming growth factor-beta1 protejează împotriva apoptozei celulelor endoteliale ale arterei pulmonare prin ALK5. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2008;295:L123–L133.

31 Park SM, Jung JS, Jang MS, Kang KS, Kang SK. Transformarea factorului de creștere-beta1 reglează soarta celulelor progenitoare neuronale derivate din măduva spinării cultivate. Cell Prolif. 2008;41:248–264.

32 Massague J. Cum celulele citesc semnalele TGF-beta. Nat Rev Mol Cell Biol. 2000;1:169–178.

33 Rahimi RA, Leof EB. Semnalizarea TGF-beta: o poveste cu două răspunsuri. J Cell Biochim. 2007;102:593–608.

34 Moustakas A, Heldin CH. Semnale non-Smad TGF-beta. J Cell Sci. 2005;118:3573–3584.

35 Schmierer B, Hill CS. Transducția semnalului TGF beta-SMAD: specificitate moleculară și flexibilitate funcțională. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8:970–982.

36 He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ, Tu PF. Echinacozidul provoacă relaxare dependentă de endoteliu în inelele aortice de șobolan printr-o cale NO-cGMP. Planta Med. 2009;75:1400–1404.

37 Abdelaziz N, Colombo F, Mercier I, Calderone A. Oxidul nitric atenuează expresia ARNm a factorului de creștere transformator-beta3 în fibroblastele cardiace de șobolan prin destabilizare. Hipertensiune. 2001;38:261–266.

38 Beck PL, Rosenberg IM, Xavier RJ, Koh T, Wong JF, Podolsky DK. Transformarea factorului de creștere-beta mediază vindecarea intestinală și susceptibilitatea la leziuni in vitro și in vivo prin celulele epiteliale. Sunt J Pathol. 2003;162:597–608.