Cistanche:Echinacozidul suprimă creșterea celulelor adenocarcinomului pancreatic prin inducerea apoptozei prin calea protein kinazei activată de mitogen

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG și XINFENG LI

Abstract.

Aplicarea clinică a produselor naturale derivate din medicina tradițională chineză a câștigat atenția în chimioterapie împotriva cancerului.Echinacozidul(ECH), unul dintre feniletanoizi, izolat din tulpinileCistanche(un medicament din plante chinezești) are efecte de protecție a țesuturilor și anti-apoptotice asupra sistemului nervos central. Cu toate acestea, rămâne în mare măsură evaziv dacă ECH posedă activitate de supresie tumorală. În studiul de față, s-a demonstrat că ECH poate inhiba în mod semnificativ proliferarea celulelor de adenocarcinom pancreatic prin inducerea producerii de specii reactive de oxigen și perturbarea potențialului membranei mitocondriale și astfel declanșând apoptoza. Mai mult, a fost elucidat că ECH(Echinacozidul)reprimă creșterea celulelor tumorale prin modularea activității MAPK. În concluzie, acest studiu dezvăluie o funcție nouă a ECH(Echinacozidul) în prevenirea dezvoltării cancerului și implică faptul că utilizarea ECH ar putea fi o potențială strategie chimioterapeutică pentru cancer.

Introducere

Calea supresoarelor tumorale p53 prin inducerea supresoarelor tumorale, ARF atenuează degradarea p53 mediată de E3-ligază de șoarece dublu minute (MDM)2-oncogenă (3). Acesta este un mecanism auto-reglat, de autoprotecție, care previne transformarea malignă a celulelor. În special, p53 poate reprima activitatea Myc prin activarea transcripțională, de exemplu, miR-145 care vizeazăC-ul meuARNm pentru silenciarea translației (4, 5), formând astfel o buclă de reglare cu feedback negativ.

Cea mai simplă și eficientă strategie de tratare a cancerului este uciderea celulelor canceroase. Medicamentele anticancer utilizate în mod obișnuit, cum ar fi cisplatin (6), actinomicina D (7) și adriamicină (8) inhibă creșterea tumorii prin promovarea apoptozei. Recent, dovezi tot mai mari au demonstrat că o serie de produse naturale și derivați din plante, în special din plante medicinale utilizate în medicina tradițională chineză (MTC), prezintă o funcție de supresie tumorală prin inducerea apoptozei celulelor canceroase și au potențialul de aplicare clinică. în terapia cancerului (9). De exemplu, emodina antrachinonă naturală este izolată din numeroase tipuri de celule canceroase (10,11). Camptothecin, derivat din „arborele fericit” chinezesc,Camptotheca acuminat, este un produs natural valoros care inhibă legarea ADN-ului în urma rupturii catenei mediate de topo I (12). Într-un alt studiu de cohortă retrospectiv bazat pe populație, pe un total de 729 de pacienți cu cancer de sân avansat, s-a sugerat că terapia TCM poate contribui la tratamentul cancerului. Din această cohortă, 115 pacienți au fost utilizatori de TCM, în timp ce 614 pacienți nu au utilizat TCM. Analiza multivariată a demonstrat că, în comparație cu non-utilizatorii, utilizarea TCM a fost asociată cu un risc semnificativ scăzut de mortalitate de orice cauză (13). Toate constatările menționate mai sus au indicat că TCM este o medicină complementară și alternativă importantă care poate fi utilizată în tratamentul cancerului.

șoareci cu leziuni pulmonare acute (16,17). De asemenea, ECH(Echinacozidul)s-a demonstrat că are efecte protectoare asupra țesutului nervos și îmbunătățește tulburările de comportament în modelele murine ale bolii Parkinson (18). În special, s-a descoperit că ECH promovează proliferarea celulară și inhibă apoptoza în celulele epiteliale intestinale MODE-K de șoarece (19). Până acum, însă, s-a acordat mai puțină atenție rolului potențial al ECH în prevenirea cancerului.

În acest studiu, s-a explorat dacă tratamentul cu ECH afectează creșterea și proliferarea celulelor tumorale și dacă ECH(Echinacozidul)induce apoptoza, crește producția de specii reactive de oxigen (ROS) și reduce potențialul membranei mitocondriale (MMP) și, în consecință, suprimă creșterea celulelor tumorale. În plus, prezentul studiu și-a propus să identifice mecanismele moleculare responsabile pentru inhibarea creșterii celulare mediată de ECH.

Materiale și metode

Celulă linia, reactiv, și anticorpi.Celulele de adenocarcinom pancreatic SW1990 (ATCC, Manassas, VA, SUA) au fost cultivate în mediu Eagle modificat de Dulbecco suplimentat cu 10% ser fetal bovin, 50 U/ml penicilină și 0,1 mg/ml streptomicina la 37°C într-un Atmosferă umidificată cu 5% CO2. ECH(Echinacozidul)a fost achiziționat de la Jrdun Biotechnology Corp. (Shanghai, China). Anticorpii împotriva AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 și GAPDH au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SUA); anti-Bax și anti-Bcl-2 au fost achiziționate de la Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, SUA); și anti-Caspase-3 a fost achiziționat de la Abcam (Shanghai, China).

Celulă viabilitatetest. Pentru a evalua rata de creștere a celulelor tumorale, a fost utilizat trusa de numărare a celulelor{{0}} (CCK{-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Suspensiile de celule au fost însămânțate la 5,000 celule per godeu cu tratament ECH timp de 0, 12, 24, 48 sau 72 de ore în plăci de cultură cu 96 -godeuri. Inhibarea creșterii celulare a fost determinată prin adăugarea reactivului WST-8 din trusa CCK-8 la o concentrație finală de 10% în fiecare godeu, iar absorbanța probelor a fost măsurată la 450 nm folosind un cititor de microplăci (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, SUA).

Hoechst 33342 colorarea.Celulele (60 la sută confluență) au fost tratate cu Hoechst 33342 (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China) la o concentrație finală de 1µg/ml, incubat în incubator la 37°C timp de 15 minute, spălat cu soluție salină tamponată cu fosfat de două ori, fixat în paraformaldehidă 4% timp de 30 de minute la temperatura camerei și montat pe lame. Modificările morfologice ale nucleelor ​​celulare au fost observate la microscop cu fluorescență (Olympus BX51, Melville, NY, SUA). Nucleele normale au fost rotunde și colorate cu albastru deschis, în timp ce nucleele apoptotice au fost micșorate și colorate cu albastru strălucitor.

Activat prin fluorescență celulă triere (FACS) analize.Pentru evaluarea apoptozei, a fost utilizat trusa de detectare a apoptozei de fluoresceină izotiocianat (FITC)-Annexin V (BD Biosciences, Shanghai, China), conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, 5x104 celule au fost spălate cu PBS rece cu gheață, resuspendate în 0,1 ml tampon de legare (Beyotime Institute of Biotechnology) și colorate cu 10 ml de anexină V conjugată cu FITC (10 mg/ml) și 10 ml iodură de propidiu (PI) (50 mg/ml). După incubarea timp de 15 minute la temperatura camerei în întuneric și adăugarea a 400 ml tampon de legare, celulele au fost analizate cu un citometru de flux (C6; BD Biosciences, Shanghai, China).

Măsurare de reactiv oxigen specii (ROS).Pentru a evalua producția de ROS, a fost utilizat trusa de testare a speciilor reactive de oxigen (Vigorous Biotechnology, Beijing, China) conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, celulele (80 la sută confluență) au fost recoltate și spălate cu PBS înainte de colorare cu soluție de dihidroetidiu (DHE) (Beyotime Institute of Biotechnology). Celulele au fost apoi analizate prin analize citometrice în flux.

Măsurare de mitocondriale membrană potenţial (MMP).

Un kit de testare tetrametilrodamină metil ester (TMRM) (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, SUA) a fost utilizat pentru a detecta modificările MMP. Pe scurt, celulele (80 la sută confluență) au fost recoltate, spălate cu PBS și colorate cu TMRM timp de 15-20 de minute într-un incubator la 37 °C. Celulele au fost apoi spălate o dată cu PBS și supuse analizelor citometrice în flux.

Imunoblottinganalize. Celulele (80 procente de confluență) au fost recoltate și lizate în tampon RIPA (Jrdun Biotechnology) constând din 50 mM Tris-HCI, pH 7,4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1% acid deoxicolic de sodiu și 0,1% SDS și inhibitori de proteazom proaspăt adăugați. Au fost utilizate cantități egale de lizat de celule clare pentru analiza imunoblotării așa cum s-a descris anterior (20).

Statistic analiză.Datele cantitative sunt exprimate ca medie ± abaterea standard. Diferențele statistice au fost evaluate prin testul t Student nepereche folosind software-ul statistic SPSS 15.0. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Rezultate

ECH (Echinacozidul)suprimă tumora celulăcreştere. Deși s-a raportat că ECH(Echinacozidul)prezintă un rol protector prin inhibarea apoptozei și a semnalelor inflamatorii în celulele somatice, cum ar fi celulele epiteliale neuronale și intestinale (16-19), rămâne evaziv dacă ECH controlează creșterea și proliferarea celulelor canceroase. Pentru a testa acest lucru, a fost efectuat un test de supraviețuire celulară prin tratarea celulelor SW1990, derivate dintr-un adenocarcinom pancreatic de gradul II, cu doze titrate de ECH, așa cum se arată în Fig. 1. În mod deosebit, s-a demonstrat că ECH întârzie semnificativ proliferarea celulelor tumorale într-o doză. -mod dependent în timpul unei perioade de cultură de 5-zi (Fig. 1).ECH declanșatoareapoptoza. Deoarece pierderea apoptozei este unul dintre mecanismele cauzale majore care stau la baza proliferării necontrolate a celulelor canceroase pancreatice (21), prezentul studiu a efectuat un set de experimente pentru a determina dacă ECH declanșează apoptoza. În primul rând, prin colorarea nucleilor celulelor tumorale cu Hoechst 33342, s-a demonstrat că ECH are ca rezultat apoptoză într-o manieră dependentă de doză (Fig. 2A). În plus, analizele FACS au fost efectuate folosind colorarea cu anexină V/PI pentru a confirma în continuare efectul apoptotic al ty ECH (Fig. 2B). Procentul mediu de celule apoptotice a fost de 1,1% în condiții normale de cultură, în timp ce acest procent a crescut semnificativ la 10,6, 21,4 și 51,3% ca răspuns la tratamentul cu ECH într-o manieră dependentă de doză (Fig. 2C). Aceste rezultate, împreună cu analiza de viabilitate celulară prezentată în Fig. 1, demonstrează că tratamentul cu ECH suprimă proliferarea celulelor tumorale prin declanșarea apoptozei.

generează etidio care se intercalează cu ADN, a fost folosit în acest studiu pentru a evalua producția de ROS. S-a descoperit că, la fel ca și alte medicamente anticancer, ECH stimulează, de asemenea, producția de ROS într-o manieră dependentă de doză, așa cum se arată prin intensitatea crescută a fluorescenței la tratamentul cu ECH (Fig. 3).

ECH (Echinacozidul)reduce MMP.S-a demonstrat că disfuncția mitocondrială este implicată în inducerea apoptozei. S-a demonstrat că deschiderea porului de tranziție a permeabilității mitocondriale induce depolarizarea potențialului transmembranar și eliberarea de factori pro-apoptotici (23). Prin urmare, a fost testat dacă ECH ar putea induce pierderea MMP în celulele tumorale prin efectuarea unui test TMRM, care este o abordare bine stabilită, deoarece intensitatea fluorescenței TMRM este proporțională cu potențialul membranei. Sa demonstrat că tratamentul cu ECH reduce semnificativ MMP într-o manieră dependentă de doză (Fig. 4).ECH controale tumora celulă creştere prin intermediul proteină activată de mitogenia fost examinată baza moleculară a morții celulelor tumorale mediată de ECH, activitatea mai multor căi de semnalizare vitale, cum ar fi MAPK și AKT (24, 25), care controlează supraviețuirea și moartea celulelor. MAPK-urile sunt proteine ​​kinaze Ser/Thr, direcționate de prolină, conservate evolutiv, inclusiv kinaze reglate de semnal extracelular (ERK), kinaze terminale c-Jun NH2-(JNK) și membrii familiei p38 care sunt activați prin trei- cascade de semnalizare a nivelului kinazei (26,27). În acest studiu, a fost evaluată expresia MAPK-urilor și AKT, precum și a formelor fosforilate activate ale acestora și s-a dezvăluit că ECH suprimă semnificativ activitatea JNK și ERK1/2, dar îmbunătățește activitatea p38 (Fig. 5). În special, sa demonstrat că activitatea AKT, care este, de asemenea, extrem de importantă pentru proliferarea celulară, nu este afectată de tratamentul ECH (Fig. 5). În plus, s-a arătat că tratamentul cu ECH crește expresia Bax și Caspaze-3 în timp ce reduce expresia Bcl{-2 (Fig. 5), ceea ce este în concordanță cu Fig. 2. Astfel, rezultatele indică faptul că ECH declanșează apoptoza celulelor tumorale prin calea MAPK.

Discuţie

Din câte știm, acesta este primul studiu care arată că ECH are o funcție de supresie tumorală prin declanșarea apoptozei (Fig. 2), promovarea producției de ROS (Fig. 3) și inducerea depolarizării potențialului membranei mitocondriale (Fig. 4). , conducând în consecință la inhibarea creșterii celulelor tumorale (Fig. 1). În plus, s-a demonstrat că baza moleculară a morții celulelor tumorale mediată de ECH are loc prin reglarea căilor de semnalizare MAPK (Fig. 5). Aceste descoperiri demonstrează o funcție nouă a ECH în prevenirea tumorigenezei și sugerează astfel că poate fi un agent candidat pentru terapia cancerului.

Majoritatea medicamentelor anticancer pot induce apoptoza celulelor tumorale, senescența și/sau oprirea ciclului celular, ceea ce duce la inhibarea creșterii și proliferării celulelor tumorale. Oprirea ciclului celular este un răspuns celular la semnale ușoare de stres care permit celulelor să repare ADN-ul deteriorat înainte de a iniția sinteza sau mitoza ADN-ului replicativ, în timp ce apoptoza și senescența (oprirea permanentă a ciclului celular) apar ca răspuns la semnalele de stres care elimină celulele ireparabile sau maligne ( 28,29). Prin urmare, în acest studiu a fost evaluat doar efectul apoptotic al ECH asupra celulelor tumorale, deoarece uciderea celulelor canceroase este un criteriu major pentru evaluarea potenței unui agent anticancer. În special, s-a demonstrat că ECH induce expresia luiBax(Fig. 5), o genă pro-apoptotică, activată transcripțional de supresorul tumoral p53 (30). Astfel, merită să se testeze dacă ECH poate activa calea de semnalizare p53. Dacă da, ECH poate, de asemenea, să provoace oprirea ciclului celular dependent de p53-, senescență, apoptoză sau autofagie. În acest studiu, a fost elucidată funcția de supresie tumorală a ECH în linia celulară de adenocarcinom pancreatic SW1990. Cu toate acestea, sunt necesare studii suplimentare care observă mai multe linii celulare de cancer pancreatic. S-a demonstrat că mutațiile în proteina oncogenă RAS și supresorul tumoral p53 sunt asociate cu dezvoltarea cancerului pancreatic (31); cu toate acestea, linia celulară SW1990 nu găzduiește nicio mutație p53, conform bazei de date p53 IARC (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx). Prin urmare, este important să se investigheze dacă ECH poate afecta creșterea și proliferarea altor linii celulare de cancer pancreatic cu diferite mutații p53. În plus, ar fi interesant să se determine dacă ECH este capabil să promoveze apoptoza și să inhibe creșterea altor tipuri de tumori.

Creșterea ROS și reducerea MMP, care au fost cauzate de tratamentul cu ECH, s-au dovedit a fi esențiale în inducerea apoptozei (22). În plus, s-a descoperit că ROS poate induce oxidarea porilor mitocondriali contribuind la eliberarea citocromului.c, un intermediar în apoptoză, din cauza perturbării MMP (22). Astfel, rămâne de determinat dacă ECH perturbă MMP indirect prin inducerea ROS. În plus, stresul oxidativ provocat de ROS s-a dovedit, de asemenea, implicat în modularea unei multitudini de semnale de control al creșterii celulare, inclusiv p53, NF-kB, HIF și PI3K (32). Rămâne de stabilit dacă și, dacă da, cum reglementează ECH aceste căi importante de semnalizare. În special, stresul oxidativ provoacă diverse boli neurodegenerative din cauza consumului mare de oxigen, a sistemelor antioxidante slabe și a caracteristicilor terminale de diferențiere ale sistemului nervos central (33). Cu toate acestea, mai multe studii au arătat că ECH are efecte protectoare și anti-apoptotice asupra țesutului nervos. În acest sens, este rezonabil să presupunem că ECH poate reduce producția de ROS în celulele neuronale diferențiate terminal. Prin urmare, rămâne, de asemenea, de determinat dacă reglarea producției de ROS de către ECH depinde de starea de diferențiere a celulelor. Prin urmare, rezultatele prezente împreună cu alte studii arată că ECH, TCM utilizat pe scară largă, poate fi o strategie chimioterapeutică importantă nu numai pentru tratamentul bolilor neurodegenerative, ci și a carcinoamelor maligne.

Recent, utilizarea TCM în terapia cancerului a câștigat din ce în ce mai multă atenție. Potențialul produselor naturale din plante medicinale utilizate în MTC a fost recunoscut de comunitatea științifică chiar și în lumea occidentală (9). Sunt necesare eforturi pentru elucidarea mecanismelor de acțiune care stau la baza acestor produse naturale, care pot duce în cele din urmă la dezvoltarea unor medicamente eficiente și sigure pentru terapia cancerului.

În concluzie, prezentul studiu a demonstrat funcția inhibitoare a tumorii a ECH și, de asemenea, elaborează baza moleculară a suprimării tumorii mediate de ECH, sugerând astfel potențiala aplicare clinică a ECH în terapia cancerului.

Mulțumiri

Acest studiu a fost finanțat și susținut de Programul cheie de cercetare științifică al UMF (grant nr. 09ZD014). Autorii ar dori să mulțumească Biomedworld (Shanghai, China) pentru ajutor la editarea manuscrisului.

Referințe

1. Hanahan D și Weinberg RA: Semnele distinctive ale cancerului: următoarea generație. Celula 144: 646-674, 2011.

2. Alderton GK: Transcriere: Efectele transcripționale ale MYC. Nat Rev Cancer 14: 513, 2014.

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ și Roussel MF: semnalizarea Myc prin supresorul tumorii ARF reglează apoptoza și imortalizarea dependente de p53-. Genes Dev 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K și Mo YY: p53 reprimă c-Myc prin inducerea supresorului tumoral miR-145. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212, 2009.

5. Liao JM, Cao B, Zhou X și Lu H: Noi perspective asupra funcțiilor p53 prin microARN-urile țintă. J Mol Cell Biol 6: 206-213, 2014.

6. Zamble DB și Lippard SJ: Cisplatină și repararea ADN-ului în chimioterapia cancerului. Trends Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H și Korc M: Actinomicina D induce apoptoza și inhibă creșterea celulelor canceroase pancreatice. Int J Cancer 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P și Dass CR: Doxorubicin: O actualizare asupra acțiunii moleculare anticancer, toxicitate și sisteme noi de administrare a medicamentelor. J Pharm Pharmacol 65: 157-170, 2013.

9. Efferth T, Li PC, Konkimalla VS și Kaina B: De la medicina tradițională chineză la terapia rațională a cancerului. Trends Mol Med 13: 353-361, 2007.