Efectul extractelor de Cistanche Tubulosa asupra funcției de reproducere masculină la șobolanii diabetici induși de streptozotocină-nicotinamidă

Cuvinte cheie:Diabet; infertilitate;Cistanche tubulosaextrage(CTE);echinacozid(ECH);antiinflamatoractivitate;antioxidantactivitate;steroidogenezaefecte

Pentru mai multe informații despre beneficiile extractului de cistanche

1. Introducere

Diabetul zaharat (DZ) este o afecțiune în care există o creștere a nivelului de glucoză din sânge datoratăla ineficiența pancreasului de a produce suficientă insulină sau la incapacitatea organismului de a o folosiîn mod eficient. Potrivit OMS, numărul persoanelor cu diabet a crescut de la 108 milioane în 1980la 422 milioane în 2014 [1]. Există patru categorii principale: pre-diabet (o etapă anterioară diabetului), tip 1(unde pancreasul nu reușește să producă insulină), tipul 2 (corpul nu reușește să folosească insulină) și gestaționaldiabet (care apare în timpul sarcinii). Stresul oxidativ apare din cauza dezechilibrului dintreproducerea de specii reactive de oxigen (ROS) și antioxidanți [2] duce în cele din urmă la afecțiunea diabetică.Complicațiile diabetului includ insuficiența rinichilor, afectarea nervilor, orbirea, accidentul vascular cerebral, inimaatac, moarte fetală și infertilitate. [1]. Studiile arată că nucleii spermatozoizilor, acidul dezoxiribonucleic (ADN),și mitocondriile au fost afectate semnificativ la pacienții cu diabet zaharat de sex masculin [3]. Stresul oxidativ în timpultransportul spermatozoizilor va altera procesul sistemului reproducător masculin [4,5]. 

Procesul de spermatogeneză este controlat de hipotalamus-hipofizo-gonadale (HPG)axă. Hormonul de eliberare a gonadotropinei (GnRH) produs de hipotalamus stimuleazăproducerea hormonului luteinizant (LH) și a hormonului foliculostimulant (FSH). Se găsesc celule Leydigadiacent tubului seminifer și produc testosteron sub controlul LH. FSH declanșeazăproducerea proteinei care leagă antigenul (ABP) care ajută la trecerea hormonului masculin. Astfel, infertilitateaiar alte probleme apar în principal din cauza perturbărilor care apar în axa HPG. Administrarea decombinația de streptozotocină-nicotinamidă induce diabet la șobolanii experimentali. Streptozotocinaeste un compus chimic toxic pentru producerea de insulină celulele din pancreas și nicotinamida este avitamina solubila in apa care protejeaza celule din deteriorarea completă [6]. Cistanche tubulosaeste o specie de plante din deșert cunoscută și sub numele de "Rou Cong-Rong" [7]. Este unplantă parazită neclorofilă care crește în principal pe rădăcinaCalotropis proceracopac și estedistribuit pe scară largă în ținuturile aride din Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongolia, Iran și India. ComunnumeleCistanche tubulosaeste „Zambilă din deșert”. Este larg acceptat în medicina tradițională chinezăși i s-a dat numele „Ginsengul deșertului”. Este utilizat pe scară largă în domeniul medicinal pentrutrata leucoreea morbidă, metroragia abundentă, bolile renale cronice, constipația, impotența șiinfertilitate. Constituentii chimici aiCistanche tubulosaconstau din glicozide feniletanoide nevolatile(PHG), iridoizi, lignani, uleiuri volatile, alditoli, oligozaharide și polizaharide [8]. Studiiarată că echinacozidul din această plantă protejează fibroblastele deteriorate prin reglarea nivelurilor de ROS.9]. Acest compus produce împreună activități antioxidante, vasorelaxante și antiinflamatoriineuroprotecția și prevenirea osteoporozei [10,11]. Acest studiu a avut ca scop investigarea efectuluiCistanche tubulosaextragecare conțin ECH pedisfuncția reproductivă a șobolanului diabetic indus de streptozotocină-nicotinamidă.

2. Materiale și metode

2.1. Materiale

ECH și CTE au fost achiziționate de la Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Avansatprodusele finale de glicație (AGE) au fost achiziționate de la Biovision (San Francisco, CA, SUA). LC-540și liniile celulare TM3 au fost achiziționate de la Institutul de Cercetare și Dezvoltare în Industria Alimentară(Hsinchu, Taiwan). Sobolani masculi Sprague-Dawley (SD) in varsta de cinci saptamani au fost cumparati de laCentrul național pentru animale de laborator (Taipei, Taiwan). Dieta de laborator pentru furaje® a fost achiziționat de la PMINutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). 2, a fost obţinut 2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)din Sigma (St. Louis, MO, SUA). Metanol și 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetansulfonicacid (HEPES) au fost, de asemenea, achiziționate de la Sigma. Mediul Eagle modificat de Dulbecco/F12 șitripsină-EDTA au fost obținute de la GIBCO (New York, NY, SUA). 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bromură de difeniltetrazoliu (MTT), diacetat de dicloro-dihidro-fluoresceină (DCFH-DA), dimetilsulfoxid (DMSO) și nitroblue tetrazoliu (NBT) au fost achiziționate de la Sigma. Glucoză enzimaticătrusele au fost obținute de la Kyokutoseiyaku, Tokyo, Japonia. Au fost achiziționate truse ELISA pentru insulinăde la Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Suedia). Extracția proteinelor tisulare T-PERReactivul a fost achiziționat de la Thermo Scientific (Chicago, IL, SUA). Nuclear anti-om/șoarece/șobolanfactor-kappa B NF-κAnticorpii policlonali B au fost achiziționați de la Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA, SUA. Receptor anti-șoarece/șobolan pentru produse finale de glicare avansată (RAGE) policlonalanticorpi, anticorpi policlonali anti-uman/șoarece/șobolan StAR și anti-om/șoarece/șobolanAnticorpii monoclonali de citocrom P450 17A1 au fost achiziționați de la Gene Tex (Irvine, CA, SUA).Anticorpii policlonali anti-om/șoarece/șobolan CYP11A1 au fost obținuți din Cell SignalingTehnologie (Beverly, PA, SUA). Reactivul easy-Blue a fost achiziționat de la Invitrogen, Thermo FisherȘtiințific (Carlsbad, CA, SUA). Agaroză și marker ADN 100 bp au fost obținute de la Promega,Corporation (Madison, WI, SUA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit a fost achiziționat de la QIAGEN,Hilden, Germania.

un 5% CO2 incubator (CO2 incubator, Napco 5410, Taiwan). Linia celulară TM3 a fost cultivată în Dulbeccomediu Eagle modificat (DMEM) suplimentat cu glucoză (4,5 g/L), piruvat de sodiu (0,5 mM),L-glutamină (2,5 mM), bicarbonat de sodiu (1,2 g/L), 4-({2-hidroxietil){-1-piperazinetansulfonicacid (HEPES, 15 mM) și ser fetal de vițel (FCS, 10 la sută) sau ser de cal (5 la sută) la 37 de ani◦C într-o proporție de 5%.CO2 incubator.

Determinarea viabilității celulare a echinacozidei (ECH): 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-Reactivul bromură de difeniltetrazoliu (MTT) a fost utilizat pentru analiza viabilității celulare. Concentrația celularăa fost ajustat la 2× 105celule / ml într-o placă de 96-godeuri. Apoi, 20µL de ECH (diluat în 2 procente din mediu)a fost adăugată și incubată timp de 24 ore la 37°C◦C în 5% CO2 incubator. Mai târziu, 100µL de reactiv MTT a fostadăugat și incubat timp de 4 ore la 37°C◦C în condiții de întuneric. Absorbanța a fost măsurată la 570 nm(Cititor ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, Elveția).Viabilitatea relativă a celulei ( procente )=[(Aproba la 570 nm− Anecompletat la 570 nm)]/[(Acontrol la 570− Anecompletat la 570)] × 100.

Analiza conținutului speciilor reactive de oxigen (ROS):

Numărul de celule a fost ajustat la2 × 105celule/mlîntr-o placă de 12-godeuri care conține 2% FBS. Apoi, 50µL/mL de ECH, RES și AGEau fost adăugate pe placă și incubate la 37°C◦C timp de 24 de ore. După 24 de ore, 20 ,70 -diclorofluorescein-diacetat(DCFH-DA) a fost adăugat și incubat la 37°C◦C timp de 30 min. După centrifugare (400× g, 5 minute),

și AGE au fost adăugate și incubate la 37°C◦C în 5% CO2 incubator 24 ore. După, 400µL de T-PERau fost adăugate, răzuite celulele și centrifugate la 125,000× g timp de 20 de minute (4◦C). Supernatantula fost colectat și depozitat la−80 ◦C (−80 ◦C congelator, Nuaire, Plymouth, MN, SUA) pentru analize suplimentare.

Trusa de acid bicinchoninic (BCA) a fost folosită pentru cuantificarea proteinelor. Apoi, 10µL de soluție celulară standardși 200µL de reactiv BCA au fost adăugați pe plăcile de 8-godeuri și incubate la 37°C◦C în 5% CO2 incubatortimp de 30 min. Absorbanța a fost măsurată la 562 nm. S-a efectuat analiza de identificare a proteinelorprin electroforeză cu dodecil sulfat de sodiu (SDS)-gel de poliacrilamidă (SDS-PAGE). Mostrele au fostpreparat prin adăugarea de lizat de proteine ​​la tamponul de încărcare cu proteine ​​și s-a efectuat analiza Western blotpentru a detecta proteinele specifice.

2.2.2. Analiza in vivo

Design de model animal: șobolani masculi Sprague–Dawley (SD) în vârstă de 60 de 4-săptămâni au fost achiziționați de laCentrul național pentru animale de laborator (Taipei, Taiwan). Fiecare șobolan a fost adăpostit individual în dezinfectantcuști din oțel inoxidabil la temperatură controlată (23± 1 ◦C) și umiditate (40–60 la sută) cu 12 oreciclu lumina/întuneric de 12 ore. Mâncarea și apă au fost furnizate ad libitum. Fiecare șobolan a fost domesticit în primulsaptamana si a dat dieta de laborator pentru rozatoare 5001 ca dieta principala. Toate procedurile au respectat standardulal Comitetului Instituțional pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor (Aviz IACUC Nr. 101026) al NaționaluluiUniversitatea Ocean din Taiwan, Taiwan. După domesticire, șobolanii au fost împărțiți în două grupe: martorgrupul (Con) care a fost hrănit cu dieta de laborator 5001 și grupul de diabetici care a fost hrănit cu o dietă bogată în grăsimi(HFD, 40 la sută) pentru întregul experiment. După ce a fost hrănit cu HFD timp de 4 săptămâni, grupul diabeticșobolanii au fost injectați cu streptozotocină (65 mg/kg) (STZ) pentru a induce diabetul zaharat (DM). ÎnLa 15 minute de injectare STZ, s-a injectat nicotinamidă (230 mg/kg greutate corporală). La o săptămână după injectare,a fost efectuat un test oral de toleranță la glucoză (OGTT) pentru a determina inducerea cu succes a diabeticilormellitus (DM). După aceea, animalele au fost împărțite în șase grupuri: martor (hrănit cu dietă de laborator5001); grupa DM (DM plus 45% HFD); Grupa DMR (DM plus rosiglitazonă: 0,571 mg/kg BW) plus 45% HFD;Grupa DME1 (DM plus CTE: 80 mg/kg BW) plus 45% HFD; Grupa DME2 (DM plus CTE: 160 mg/kg BW)plus 45 la sută HFD; și grupul DME4 (DM plus CTE: 320 mg/kg BW) plus 45% HFD. Rosiglitazona (RSG) a fostluat drept control pozitiv. Au fost utilizate trei doze de CTE (80, 160 și 320 mg/kg) conformrecomandarea Taiwan Food and Drug Administration (TFDA) funcțională alimentarăghiduri de evaluare. Tratamentele au fost date până la sfârșitul experimentului. Toți șobolanii experimentaliau fost sacrificate după 6 săptămâni. Sângele a fost colectat de la șobolani a fost centrifugat la 3000 rpm pentru15 min la 4◦C. Supernatantul a fost examinat pentru următoarea analiză:Glucoză totală, trigliceride și colesterol

Determinare:

Determinarea glucozei a fostrealizat de truse enzimatice de glucoză. Apoi, 20µL de probe de plasmă sanguină au fost adăugate lareactivi și păstrați la 37◦C timp de 5 min. Trigliceridele totale și concentrația de colesterol total au fostdeterminat prin utilizarea truselor enzimatice de trigliceride și colesterol. Apoi, 10µL de plasmă sanguină au fostadăugat la reactivi și experimentul a fost efectuat conform instrucțiunilor producătorului.Absorbanța a fost măsurată la 510 nm.Glucoză/trigliceride/colesterol total în plasmă (mg/dL)=(Aprobă− AGol)/(Astandard− AGol) × 200. O mostră: Absorbanța probelor de sânge, AGol: Valoarea de absorbție a truselor fără eșantion, Standard: Valoarea absorbanței reactivului standard, 200: reactivi standard la o concentrație de200 mg/dL.Modelul de evaluare a insulinei, leptinei și homeostatice – Determinarea rezistenței la insulină (HOMA-IR):Nivelul de insulină a fost determinat prin truse ELISA de insulină. Aici, 25µL de plasmă sanguină au fost adăugate lareactivii și absorbanța a fost măsurată la 450 nm. Conținutul total de leptină a fost determinat prin utilizareakit de testare imunometrică a enzimei leptinei. Apoi, 100µS-au analizat l de plasmă și absorbanțaa fost măsurat la 450 nm folosind un cititor ELISA. Întregul experiment a fost realizat conforminstructiunile producatorului. Valoarea HOMA-IR a fost determinată din modelul homeostazieiecuația de evaluare=Concentrația de insulină plasmatică a jeun (mU/mL)× glucoza plasmatica a jeunconcentrații (mmol/L)/22,5.Peroxidarea lipidelor plasmatice: aici, 0,5 ml de plasmă sanguină au fost amestecate cu 1 ml de reactiv (15% ,acid tricloracetic g/v în {{0}}.25 N acid clorhidric (HCl) și 0,375 la sută,w/v acid tiobarbituric în0.25 N HCl) și plasat într-o baie de apă (Baie de apă, BUCHI 461, Zürich, Elveția) la 100◦C pentru15 minute. După răcire, s-a adăugat 1 ml de n-butanol, s-a agitat energic și s-a centrifugat la 1500°C.× g timp de 10 min. Supernatantul a fost colectat și absorbanța a fost măsurată la 532 nm [12]. Concentrația de malondialdehidă (MDA) (nM/mL)=[(O probăla 532 nm− Anecompletat la 532 nm)/ (Standardla 532 nm− Anecompletat la 532 nm)] × 5. Determinarea nivelurilor plasmatice de testosteron și hormon luteinizant (LH): testosteronulTrusa ELISA a fost folosită pentru a măsura nivelul de testosteron din plasma sanguină. Kitul RIA a fost folosit pentrudetermina concentratia de LH. Apoi, 50µS-au adăugat l de plasmă și s-au bazat calculeleasupra concentrației hormonului LH-RP-3 (standard). Etapele viitoare au fost efectuate conformla instrucțiunile producătorului.Determinarea factorului de necroză tumorală (TNF) - și concentrația de interleukin-6 (IL-6):Anticorpul capturat a fost diluat de 250 de ori în tampon de acoperire, adăugat pe o placă de 96-godeuri (100µL/bine),si tinut la 4◦C pentru noapte. Supernatantul a fost aspirat și spălat de cincisprezece ori cu spălaretampon (1 dată PBS, 0,05 procente Tween 20). După incubare (1 h) cu 200µg de diluant de analiză, celulele au fostspălat de 5 ori cu tampon de spălare și 100µL de TNF- soluție standard sau probe de testare au fostadăugat în fiecare godeu și incubat timp de 2 ore. După spălare, 100µS-au adăugat L de anticorpi detectați IL-6și incubat timp de 1 oră la temperatura camerei. Supernatantul a fost aspirat și spălat de 5 ori. Apoi,480 µL de enzimă avidin-peroxidază de hrean (HRP) au fost adăugate și incubate timp de 30 de minute în cameră.temperatura. Supernatantul a fost aspirat și spălat de cinci ori cu tampon de spălare. Apoi, 100µL de soluție de substrat au fost adăugate și incubate timp de 15 minute la temperatura camerei. Mai târziu, 50µL de oprireS-a adăugat soluție (acid fosforic 1 M) în fiecare godeu și absorbanța a fost măsurată la 450 nm.Analiza parametrilor spermatozoizilor și testiculelorColectarea probelor de spermă: Colectarea probei de spermă a fost efectuată în conformitate cumetoda raportata anterior in [13]. Spermatozoizii au fost colectați din supernatant și utilizate pentruanaliza ulterioara.Numărul de spermatozoizi, motilitatea spermatozoizilor și spermatozoizii anormali: numărul de spermatozoizi au fostcalculat folosind hemocitometrul și soluția de albastru tripan. Apoi, 100µL de lichid de spermă au fostamestecat cu soluție de albastru tripan și numărul de spermatozoizi, motilitatea și spermatozoizii anormali au fostcalculat folosind un hemocitometru și un microscop [14]. Nitro blue Tetrazolium NBT Reducerea și peroxidarea lipidică a spermatozoizilor și testiculelor: lipideleperoxidarea și reducerea NBT au fost analizate după aceeași procedură de analiză a plasmei.

Determinarea superoxid dismutazei (SOD) și a activității catalazei: Superoxid dismutazăActivitatea (SOD) a fost analizată utilizând kitul RANSEL. Aici, 0,05 ml de omogenate testiculareau fost adăugate la 1,7 mL de soluție de reacție (0.{05 mM xantină, 0,025 mM 2-({4-iodofenil)-{{0}}({4-nitrofenol)-5-clorura de feniltetrazoliu (INT)). După amestecare, 0,25 ml xantin oxidază (80 U/L)a fost adăugată şi a reacţionat la temperatura camerei timp de 30 s la temperatura camerei. Absorbanța a fostmăsurată la 505 nm. Concentrația proteică a omogenatului testicular a fost determinată deTrusa de analiză a proteinei Bio-Rad DC și activitatea sa specifică (U/mg proteină) a fost calculată. CatalazaActivitatea (CAT) a fost determinată conform unei metode raportate anterior [15]. Colorare H&E (hematoxilină și eozină).Testiculul a fost înmuiat în 10% formol timp de 24 de ore și păstrat la 4◦C. Tăiați țesuturile îndimensiune micro și atașat la diapozitiv. După fixare (95% metanol plus 5% acid acetic), lamelele au fostscufundate în hematoxilină timp de 3 minute, spălate cu apă curentă timp de 5 minute și apoi înmuiate cu50%, 70% și 90% alcool pentru un minut. După aceea, lamelele au fost colorate cu eozină timp de 10 s șiînmuiat în alcool 100% timp de un minut până s-a estompat. În cele din urmă, lama a fost înmuiată în xilen pentru unulminut. Ulterior, lama a fost uscată la aer și sigilată. Tubul colorat a fost plasat într-un contrast de fază inversatmicroscop (microscop cu diferență de fază inversată, Olympus CK-2, Tokyo, Japonia) de observatmorfologia.Analiza hipotalamusuluiSoarecele KISS1, receptor cuplat cu proteina G (GPR) 54, supresor al semnalizării citokinei 3 (SOCS-3)și sirtuina 1 (SIRT1)secvențele de gene au fost identificate de la NCBI (Centrul Național pentru BiotehnologieInformații) baza de date genetică și un primer specific au fost concepute utilizând Primer 5.0 PREMIER Biosoft,Palo Alto, CA, SUA). Primerii utilizați în experiment sunt enumerați în tabel1.

Extragerea acidului ribonucleic (ARN) din hipotalamus. Extragerea ARN-ului dinhipotalamusul creierului a fost efectuat folosind kit-ul RNeasy Lipid Tissue Mini. Cel obtinutARNm-urile au fost măsurate cantitativ prin transcripție inversă (RT) și reacția în lanț a polimerazei(PCR). ADN-ul compliment obținut din analiza RT a fost stocat la−20 ◦C pentru utilizare ulterioară.ADN-ul extras a fost supus analizei reacției în lanț a polimerazei (PCR) utilizând polimeraza Taq.Apoi, 5~10µL din produsul PCR au fost prelevate și analizate prin electroforeză pe un agar 1,5%.coloid. Imaginea a fost realizată într-un sistem de imagistică UVP BioDoc-It. complementar transcris inversA fost luat acid dezoxiribonucleic (ADNc) și a fost efectuată PCR folosind IQ SYBR Green SupermixKit. Ulterior, a fost analizat cu iQTM 5 Optical System Software. Proteinele au fost extrase folosind areactiv de extracție a proteinelor (T-PER). Apoi, 20 mg de omogenat testicular au fost adăugate la 400µL de T-PER și centrifugat (centrifugă de mare viteză, Hettich CR-12, Tuttlingen, Germania) la 4◦C (125,000× g) timp de 20 min. Următoarea metodă a fost similară cu „identificarea și cuantificareaanaliza proteinelor” analiză in vitro.2.3. Analize statisticeRezultatele experimentale au fost exprimate ca medie± abaterea standard (Media± SD) șidatele au fost analizate cu ajutorul software-ului Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk,New York, NY, SUA. Diferențele dintre grupuri au fost analizate prin analiza unidirecțională avarianță (ANOVA). Comparații multiple ale diferitelor grupuri au fost analizate prin testul lui Duncan lavaloareap < 0.05="" as="" the="" signifificant="">

3. Rezultate

3.1. Analiza in vitro

3.1.1. Comparația activităților antioxidante ale ECH, CTE și RES

Stresul oxidativ ridicat pe termen lung și inflamația cronică sunt principalele cauze ale diabetuluicomplicatii [16]. CTE conțin diverse glicozide feniletanoide, cum ar fi echinacozida(ECH) și actozidă, cu potențial de activitate antioxidantă [17]. Captarea radicalilor DPPHtestul a fost efectuat pentru evaluarea activității antioxidante a ECH. Trolox și resveratrol(3,5,4'-trihidroxistilben, RES) au fost luate drept standard și, respectiv, martor pozitiv. Așa cum se aratăîn figură1, ECH a arătat o activitate mai bună de captare a radicalilor, iar activitatea a fost semnificativ mai maredecât cel al controlului pozitiv (RES).

3.1.2. Viabilitatea celulară a ECH pe celulele LC-540 și TM3 LeydigTestul MTT a fost efectuat pentru evaluarea viabilității celulare a diferitelor concentrații de ECH.Celulele Leydig LC-540 și celulele Leydig TM3 au prezentat mai mult de 80% din viabilitate după ce au fost tratate cuECH (Figura2). În comparație cu celelalte concentrații, un 100-µConcentrația M (diluții de 100µM în 2 procente FBS) de ECH a arătat o viabilitate celulară mai bună în celulele TM3 Leydig. Rezultatul a indicat căconcentrația crescută de ECH nu contribuie la nicio toxicitate semnificativă asupra celulelor.

3.1.3. Efectul ECH asupra producției de superoxid indusă de AGE prin testul NBT în LC-540 și TM3Celula Leydig

AGE provoacă leziuni oxidative în organism datorită oxidării glucozei și formării deradicali liberi precum O2-, radicali hidroxil și grupări carbonil [18]. După ce a fost stimulat cu50 µg/mL de AGE, LC-540 (Figura3a) și TM3 (Figura3b) celulele au fost tratate cu ECH și RES(5 µM și 10µM fiecare). Rezultatele au arătat că producția de anion superoxid a crescutîn lotul martor (AGE stimulate), dar producția de anion superoxid a scăzut dupătratament cu ECH si RES. Din figura3, s-a înțeles că ECH și RES reduc nivelulde producție de superoxid și protejează celulele de deteriorarea oxidativă. În cazul celulelor LC-540,10 µM ECH a arătat o activitate aproape similară cu grupul normal. Producția de superoxid în ambelecelulele a fost scăzută odată cu creșterea concentrației atât a ECH, cât și a RES.3.1.4. Efectul ECH asupra H2O2 Producția în celule Leydig LC-540 stimulate de AGETestul DCFH-DA a fost executat pentru detectarea prezenței speciilor oxidative. După ce a intrat încelulele, colorantul fluorescent FL DCFH-DA este oxidat de H intracelular2O2 și formează diclorofluoresceină(DCF). Așa cum se arată în figura4, a existat o creștere semnificativă a H intracelular2O2 producția înGrupul stimulat de AGE (martor), în timp ce adăugarea a 10µM ECH și RES au fost reduse semnificativH2O2 producție în celule. Administrare de 10µM ECH a dus la doar aproximativ 47,1 la sută de H2O2 producție, semnificativ mai mică decât în ​​grupul martor.

3.1.5. Efectul ECH asupra RAGE și NF-κNivelurile de expresie a proteinei B în LC stimulată de AGE-540Celulele Leydig

Analiza Western blot a fost efectuată pentru a confirma prezența RAGE în LC-540 Leydigcelule. Efectul ECH asupra RAGE (Figura5a) și NF-κB (Figura5b) nivelurile de expresie a proteinelorîn celulele Leydig stimulate de AGE au fost prezentate în figură5. Rezultatele au arătat că, 50µg/mLconcentrația de AGE a indus RAGE și NF- mai mareκExpresia B în celulele LC-540 Leydig și10 µConcentrația M de ECH și RES a redus semnificativ expresia RAGE și NF-κB. Expresia NF-κB a fost semnificativ mai mic în RES și ECH decât antagoniștii RAGE. Deci, rezultatelea confirmat că ECH a redus nivelul de inflamație prin scăderea nivelului de RAGE și NF-κB.

.1.6. Efectul ECH asupra căii de sinteză a testosteronului în celulele Leydig LC-540 stimulate de AGE.

Procesul de spermatogeneză și infertilitate masculină depinde de prezența testosteronului.Așa cum se arată în figura6, expresiile lui StAR (Figura6a), CYP11A1 (Figura6b), CYP17A1 (Figura6c), și HSD17 3 (Figura6d) proteinele au scăzut semnificativ în LC-540 Leydig stimulată de AGEcelule (grupul martor). Expresiile lui StAR, CYP11A1, CYP17A1 și HSD17 3 proteine ​​au fosta crescut semnificativ atunci când s-au adăugat antagonistul RAGE, RES și ECH. A crescutexpresia proteinelor StAR și CYP11A1 a fost observată în ambele grupuri tratate cu ECH și RES.Nivelul de expresie al CYP17A1 a fost aproape similar în grupurile RES și ECH. Expresiile luiHSD17 3 din celulele Leydig tratate cu ECH au fost mult mai mari decât cele ale RES și RAGEcelulele tratate cu antagonisti. Expresie crescută a StAR, CYP11A1, CYP17A1 și HSD17 3 proteinea indicat producția normală de testosteron.

5celule/mL și tratament cu RES și ECH(10µM) a fost administrat timp de 24 de ore. -actina a fost luată drept control intern. Grupul normal (Nor)a fost tratat cu mediu și grupul de control (Con) a fost tratat cu AGE (50µg/mL).

Rezultateau fost arătate ca medii±SD (n = 3). Diferențe semnificative (p < 0.05)="" were="" represented="" by="" letters="">analizat prin testul cu intervale multiple al lui Duncan.