Efectul extractelor de Cistanche Tubulosa asupra funcției de reproducere masculină la șobolanii diabetici induși de streptozotocină-nicotinamidă-Ⅱ

3.2. Analiza in vivo

3.2.1. Efectele CTE asupra greutății corporale și aportului de calorii

După 6 săptămâni de experimentare, grupul cu diabet zaharat (HFD-DM) a prezentat o greutate corporală mai mare decât grupul de control. Grupul HFD-DME4 a arătat o greutate corporală mai mică decât grupurile HFD-DM și HFD-DMER (Figura 7a). Aportul caloric al grupului de control a fost semnificativ mai mic decât în ​​celelalte grupuri. Nu a existat nicio diferență semnificativă între aportul caloric al celorlalte cinci grupuri (Figura 7b).

3.2.2. Testul de toleranță la glucoză orală (OGTT) pentru a determina inducerea cu succes a diabetului

Testul oral de toleranță la glucoză (OGTT) este folosit ca instrument promițător pentru detectarea diabetului zaharat. Nivelurile crescute de glucoză din sânge indică starea diabetică. După cum se arată în Figura 8a, nivelul glucozei plasmatice a fost mai scăzut în grupurile CTE decât în ​​grupul DM la 0, 30, 90 și 120 min. În plus, aria de sub curba (AUC) a concentrației glucozei plasmatice a arătat că în grupurile CTE și RSG, rata de absorbție a glucozei din sânge a fost crescută (Figura 8b).

3.2.3. Conținutul total de glucoză plasmatică, colesterol și trigliceride

Nivelul glicemiei plasmatice a jeun a fost mai mare în grupul cu DZ și mai scăzut în grupul cu DME2 (cu excepția controlului) decât la alții. Nu a existat nicio diferență semnificativă în colesterolul total între grupuri, cu excepția grupului DME4. În grupul DME4, nivelul colesterolului a fost mai scăzut decât al celorlalți. Nivelul de trigliceride a fost mai mare în grupul DM și mai scăzut în grupul DME4, iar conținutul de trigliceride a fost scăzut odată cu creșterea concentrației de CTE (Tabelul 2). Rezultatele arată că nivelul de glucoză plasmatică, colesterol și trigliceride a fost mai mare în grupul cu DZ și nivelul a fost semnificativ scăzut la tratamentul cu CTE.

3.2.4. Nivelurile de insulină plasmatică, nivelul leptinei plasmatice și evaluarea modelului de homeostazie – valorile rezistenței la insulină (HOMA-IR)

Nivelurile insulinei plasmatice, leptinei și valorilor HOMA-IR sunt prezentate în Tabelul 3. Grupul cu DZ a avut niveluri mai mari de insulină plasmatică și leptină plasmatică decât grupul de control. Indicele HOMA-IR a fost, de asemenea, semnificativ mai mare în grupul DM. Valorile insulinei plasmatice, leptinei și HOMA-IR au fost scăzute odată cu creșterea concentrației CTE. Leptina plasmatică a fost redusă semnificativ în grupurile CTE, dar grupul cu medicamente RSG (DMR) nu a arătat nicio diferență semnificativă față de grupul cu DM.

3.2.5. Efectul CTE asupra nivelurilor plasmatice de LH și testosteron la șobolanii diabetici

După cum se arată în Tabelul 4, concentrațiile de testosteron la șobolanii diabetici (DZ) au fost semnificativ scăzute, în timp ceconcentrațiile de testosteron au fost semnificativ crescutela diferite doze de CTE. În plus, rezultatele au arătat o scădere ușoară a nivelului de LH în grupul DM în comparație cu DMR, DME1, DME2 și DME4. Producția de LH a fost mai mare în grupul DME4.

3.2.6. Efectul CTE asupra parametrilor spermatozoizilor la șobolani diabetici

Rezultatele experimentale au arătat că grupul cu DZ a avut o scădere semnificativă a numărului și motilității spermatozoizilor decât grupul de control, în timp ce rata anomaliilor spermatozoizilor a fost semnificativ crescută în grupul DZ. Interesant este că numărul spermatozoizilor, motilitatea spermatozoizilor și rata anomaliilor spermatozoizilor din grupul DMR s-au îmbunătățit, dar motilitatea spermatozoizilor nu atinge un nivel semnificativ în comparație cu DME4. DME2 a arătat un număr mai bun de spermatozoizi decât toți, iar rata de motilitate a fost semnificativ crescută în grupul DME4. Nu a existat nicio diferență semnificativă între numărul de spermatozoizi anormali între grupurile tratate cu RSG și CTE (Tabelul 5).

3.2.7. Efectul CTE asupra morfologiei tubilor seminiferi la șobolanii diabetici

Figura 9 prezintă colorarea H&E a secțiunii de testicul. Săgeata neagră indică celula Leydig, iar săgeata albă desemnează celula Sertoli. Atât celula Leydig, cât și celula Sertoli din grupul DM au prezentat atrofie semnificativă și a fost observată o cavitate în lumen. Structura celulelor Leydig și Sertoli a fost restaurată în grupurile tratate cu CTE și RSG. Grosimea tubului seminifer a fost mai mare în grupurile CTE și RSG decât în ​​grupul DM.

3.2.8. Efectul CTE asupra MRNA-urilor KiSS1, GPR54, SOCS-3 și SIRT1 în hipotalamusul șobolanilor diabetici

Expresia KiSS1 (Figura 10a), GPR54 (Figura 10b), SOCS-3 (Figura 10d) și SIRT1 (Figura 10c) au fost prezentate în Figura 10. Expresia ARNm a KiSS1 și a receptorului GPR54 la șobolanii diabetici a fost semnificativ mai mic decât în ​​grupul de control. Nivelurile de expresie ARNm KiSS1 și GPR 54 în DMR, DME1, DME2 și DME4 au fost semnificativ crescute. În special, expresia ARNm GPR54 a fost crescută semnificativ în DME4 și a fost aproape similară cu grupul de control.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU PROTECȚIA PRODUCȚIEI DE TESTOSTERON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Acest experiment a explorat în continuare cantitatea de ARNm SOCS-3 și SIRT1 din hipotalamusul șobolanilor. Expresia ARNm SOCS-3 la șobolanii diabetici a fost crescută semnificativ, indicând faptul că impedanța leptinei a fost mai gravă. Grupurile DMR, DME1, DME2 și DME4 au prezentat îmbunătățiri semnificative în comparație cu grupul cu diabet. Expresia ARNm SIRT1 în grupul DM a scăzut semnificativ și a crescut semnificativ în grupurile DME1 și DME4.

3.2.9. Efectul CTE asupra enzimelor antioxidante din plasmă și testiculele șobolanilor diabetici

Tabelul 6 arată că activitatea SOD în plasmă, activitatea GPx și activitatea catalazei la șobolani diabetici au fost scăzute semnificativ și activitățile au fost crescute la grupurile tratate cu CTE și RSG. În plus, DME4 a arătat îmbunătățiri semnificative ale activității GPx decât altele. Rezultatele au arătat că activitățile SOD și catalazei la șobolanii diabetici au fost semnificativ scăzute după șase săptămâni. Activitatea SOD și a catalazei grupului DMR nu atinge un nivel semnificativ. Grupurile tratate cu CTE au prezentat îmbunătățiri semnificative în activitatea SOD și a catalazei. Activitățile crescute ale catalazei și SOD în grupurile CTE au fost observate și în testicul (Tabelul 7). Cea mai mare activitate a SOD și a catalazei a fost observată în grupul DME1 și, respectiv, în grupurile DME2.

3.2.10. Efectele CTE asupra stresului oxidativ și inflamației în plasmă și testicul șobolanilor diabetici

Producția de oxid nitric (NO) în plasmă (Figura 11a) și testicul (Figura 11b) au fost prezentate în Figura 11. Producția de NO în grupul DM a fost semnificativ crescută atât în ​​testicul, cât și în plasmă, comparativ cu grupul de control. O reducere treptată a producției de NO a fost observată în grupele DME1, DME2 și DME4 (în plasmă). Grupul DMR a arătat, de asemenea, o reducere semnificativă a producției de NO. În cazul testiculelor, s-a observat o ușoară reducere a producției de NO la grupurile CTE, în timp ce grupul DMR nu a redus semnificativ producția de NO.

După cum se arată în figurile 12 și 13, nivelurile de TNF- și IL-6 au fost semnificativ crescute la șobolanii diabetici (atât în ​​plasmă, cât și în testicul), indicând faptul că inflamația este mai gravă. În plasmă, nivelul de TNF- este similar în grupurile tratate cu CTE și RSG (Figura 12a). Grupurile CTE (în special DME2) au redus în mod semnificativ nivelul de TNF- în testicul (Figura 12b). Nivelul IL-6 a fost redus semnificativ în plasma grupurilor CTE și RSG (Figura 13a). În testicul, a existat o tendință de reducere a nivelului IL-6, dar aceasta nu a atins un nivel semnificativ (Figura 13b).

3.2.1.1. Efectele CTE asupra stresului oxidativ și inflamației la spermatozoizii șobolanilor diabetici induse de dieta bogată în grăsimi

Figura 14 prezintă conținutul de anioni superoxid în sperma de șobolan. Rezultatele au arătat că producția de anioni superoxid în spermatozoizii șobolanilor diabetici a crescut semnificativ și nu a fost observată nicio îmbunătățire semnificativă în grupul DMR. Grupările DME1 și DME4 au prezentat o producție semnificativ redusă de anion superoxid.

3.2.12. Efectele CTE asupra peroxidării lipidelor la spermatozoizii șobolanilor diabetici induse de dieta bogată în grăsimi

Studiile au arătat că peroxidarea lipidelor a fost crescută atât la pacienții cu diabet de tip 1, cât și la pacienții cu diabet de tip 2 [19]. Nivelul de malondialdehidă (MDA) în plasmă, spermă și testicul este prezentat în Tabelul 8. Nivelul de MDA în plasmă, testicul și spermatozoizi din grupul cu DZ a fost semnificativ mai mare, iar tratamentul cu CTE și RSG a redus producția de MDA. O reducere semnificativă a fost observată în grupele DME4 și DMEI din plasmă. Acest studiu a constatat că șobolanii diabetici nu numai că au crescut gradul de peroxidare a lipidelor în plasmă, dar au crescut și în testicul și spermatozoizi. S-a observat o îmbunătățire semnificativă la diferite doze de CTE.

4. Discuție

Diabetul este o boală cronică asociată cu un nivel ridicat de zahăr în sânge. Dezechilibrul dintre nivelurile de antioxidant și ROS va duce la starea numită stres oxidativ. Superoxidul, radicalul hidroxil, peroxidul de hidrogen, oxidul nitric și oxigenul singlet sunt câteva dintre exemplele de ROS care vor contribui la afecțiunile diabetului prin stres oxidativ [20].Cistanche tubulosaeste o plantă de deșert care conține componente active precumpolizaharide, oligozaharide, glicozide feniletanoide (echinacozide, verbascozide), acid palmitic, acid linoleic, iridoizi, alditoli și lignani. Această plantă este capabilă să producă efecte antiinflamatorii, neuroprotectoare, antibacteriene, antivirale, antioxidante, antitumorale și imunomodulatoare [21]. Studiile de literatură arată că glicozidele feniletanoide din Cistanche tubulosa sunt motivul major al activității antioxidante [22]. Resveratrolul (RES) și rosiglitazona (RSG) au fost luate drept control pozitiv pentru studiile in vitro și, respectiv, in vivo. RSG este un sensibilizator puternic de insulină și are o afinitate față de izoforma receptorului activat de proliferarea peroxizomilor (PPARc). Controlează hiperglicemia la pacienții diabetici [23]. RES are activitate antioxidantă naturală și acționează ca un vasodilatator, reglează metabolismul lipoproteinelor, inhibă agregarea trombocitelor și previne cancerul [24,25]. Investigația noastră a indicat că ECH prezintă o activitate de captare a radicalilor mai bună decât CTE și RES (Figura 1). De asemenea, se înțelege că ECH nu provoacă nicio toxicitate semnificativă pentru celulele LC-540 și TM3 Leydig (Figura 2).

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU FUNCȚIA SEXUALĂ MASCULINĂ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

AGE-urile au fost folosite pentru a induce condiții de stres în celulele Leydig. Producția de AGE, inflamația, stresul oxidativ și diabetul sunt interconectate. Starea hiperglicemică a diabetului promovează leziunile celulare prin producerea de AGE și stres oxidativ. AGE-urile induc toxicitatea celulară, care promovează în continuare recrutarea celulelor imune și moartea celulelor. Un nivel ridicat de AGE promovează expresia a două tipuri de receptori numite RAGE și AGER1 [26]. Picurarea și transferul ulterior al unui electron din lanțul respirator mitocondrial la oxigenul molecular în timpul stresului oxidativ are ca rezultat formarea unui anion superoxid. Rezultatele noastre arată că producția de anion superoxid indusă de AGE a crescut în grupul de control și s-au observat îmbunătățiri suplimentare atât cu tratamentele ECH, cât și cu RES. Conform studiului nostru, s-a înțeles că producția de superoxid (Figura 3) și H2O2 (Figura 4) indusă de AGE a fost scăzută în prezența ECH și RES.

NF-kB este cunoscut ca mediatorul important al inflamației asociate cu diabetul [27]. Expresia NF-kB duce la disfuncții celulare și moarte celulară. Activarea NF-kB de către stresul oxidativ stimulează răspunsul proinflamator, reglarea în sus a endotelinei și apoptoza [28]. Expresia RAGE și NF-kB a fost crescută în grupurile stimulate cu AGE și reducerea ulterioară a fost observată în celulele tratate cu ECH și RES (Figura 5).

Testosteroneste un steroid anabolic primarhormon sexual masculinsintetizat din colesterol. Procesul începe cu scindarea oxidativă a lanțului lateral al colesterolului de către gena de scindare a lanțului lateral al colesterolului (CYP11A). Această genă este localizată în membrana mitocondrială și transformă colesterolul în pregnenolon. În continuare, gena CYP17A1 din reticulul endoplasmatic îndepărtează doi atomi de carbon în plus și produce mai mulți steroizi C19. În plus, pregnenolona este oxidată pentru a forma androstendionă/progesteron de către hidroxisteroid dehidrogenază (3- -HSD). În cele din urmă, testosteronul este produs prin reducerea grupului ceto în poziția a 17-a de carbon a androstenedionei de către 17-beta-hidroxisteroid dehidrogenază (17- -HSD). Celulele Leydig sunt implicate în producția majoră de testosteron. Transferul colesterolului în membrana mitocondrială internă necesită acțiunea proteinei regulatoare acute steroidogene (StAR). Studiile actuale arată că expresia StAR, CYP11A1, CYP17A1 și HSD17 3 a fost scăzută în celulele tratate cu AGE (martor) și a fost observată o creștere extraordinară în celulele tratate cu ECH și RES (Figura 6) . Astfel, rezultatele arată că producția detestosteronul a fost crescut în grupurile tratate cu ECH și RES. 

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA PUTERII SEXULUI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

În timpul unei afecțiuni diabetice, transportul glucozei către organe este limitat și, ca urmare, nivelurile de glucoză cresc [29]. Prin urmare, starea de hiperglicemie este unul dintre markerii importanți pentru detectarea diabetului. Studiile noastre arată că nivelul glucozei plasmatice a fost crescut la grupurile cu diabet zaharat și ASC a grupului cu DZ a fost semnificativ mai mare decât în ​​celelalte grupuri (Figura 8). Împreună cu glucoza plasmatică, conținutul total de colesterol și trigliceride a fost semnificativ crescut în grupul cu DZ (Tabelul 2). Ateroscleroza este facilitată de un nivel crescut de colesterol și trigliceride [30]. Cu toate acestea, nivelul de colesterol și trigliceride a fost scăzut la grupurile tratate cu CTE și RSG. Conținutul de trigliceride al grupului DME4 a atins valori aproape similare cu grupul martor.

Insulina este un hormon produs de celulele pancreasului și funcționalizat pentru a controla nivelul zahărului din sânge în organism, în timp ce leptina este un hormon produs de adipocite care sunt capabile să regleze aportul alimentar și utilizarea energiei. Studiile au indicat că leptina este implicată în patofiziologia obezității și există o interacțiune pozitivă între leptina și insulină [31]. Studiile noastre arată că nivelul inulinei plasmatice și leptinei au fost mai mari în grupul cu DZ, iar nivelul insulinei a scăzut odată cu creșterea concentrației CTE. Grupul RSG nu prezintă nicio diferență semnificativă față de grupul DM. Rezistența la insulină și funcția celulară au fost evaluate prin metoda HOMA-IR. Valoarea HOMA-IR a crescut în grupul DM și a fost semnificativ diferită de alte grupuri (Tabelul 3).

DZ afectează funcția de reproducere prin alternanța hormonală în axa HPG și studiile au arătat că expresia insulinei în testicul este afectată și de diabet. Se caracterizează prin vacuolizarea celulelor Sertoli, fragmentarea crescută a ADN-ului, spermatogeneza afectată și epuizarea crescută a celulelor germinale. Stresul oxidativ contribuie, de asemenea, la anomalii ale funcției de reproducere [32]. Procesul de formare a spermatozoizilor în organul reproducător masculin (testiculele) se numește spermatogeneză. Testiculul este compus din tubuli strâns încolaci numiți tubuli seminiferi. Celulele Sertoli sunt observate în pereții tubului seminifer și oferă hrană spermatozoizilor imaturi. Investigarea parametrilor spermatozoizilor a indicat că numărul de spermatozoizi și motilitatea au scăzut, iar anomaliile au crescut în grupul cu DZ (Tabelul 5). Un efect opus a fost observat la grupurile tratate cu CTE și RSG. Atât celula Leydig, cât și celulele Sertoli din grupul DM au prezentat atrofie semnificativă, iar cavitatea a fost văzută în lumen. Grosimea tubului seminifer a scăzut, de asemenea, în grupul DM. Un rezultat îmbunătățit a fost observat la grupurile tratate cu CTE și RSG (Figura 9). În plus, nivelul de LH și testosteron a scăzut în grupul cu DZ și nivelurile au crescut în grupurile tratate cu CTE (Tabelul 4). La bărbați, testosteronul seric scăzut și frecvența pulsului LH mai scăzută au fost adesea asociate cu obezitatea și diabetul zaharat de tip 2 [33].

Kisspeptinele codificate de gena KiSS1 sunt cunoscute ca stimulatorul puternic al axei HPG și orice mutație a genei kisspeptine va duce la niveluri scăzute de steroizi sexuali și gonadotropină. Studiile arată că la șobolanii diabetici induși de STZ, nivelurile de ARNm Kiss1 au fost scăzute [33]. Inițierea și menținerea infertilității la mamifere sunt legate de receptorul 54 cuplat cu proteina G (GPR54). Mutația în GPR 54 se caracterizează prin absența maturizării sexuale și niveluri scăzute de hormoni gonadotropi (LH și FSH). Citokinele proinflamatorii, cum ar fi IL-6 și TNF-reglează în sus expresia supresorului de semnalizare a citokinelor 3 (SOCS3) implicat în rezistența la insulină mediată de inflamație în ficat și adipocite [34]. SIRT 1 este o genă asociată cu reglarea mai multor boli de îmbătrânire. Această genă este exprimată în mod proeminent în celulele pancreasului și reglează secreția de insulină și previne apoptoza. Studiile curente au indicat că expresia KiSS1, GPR54 și SIRT1 a scăzut în grupul DM, dar expresia a crescut în grupurile tratate cu CTE (Figura 10). O creștere a expresiilor SOCS-3 în grupul DM indică starea inflamatorie. Prima legătură moleculară identificată între obezitate și inflamație a fost TNF-. Prin urmare, un nivel crescut de TNF- este un indicator al inflamației. Nivelul scăzut de citokine proinflamatorii, cum ar fi TNF- și IL-6, a fost observat în grupurile tratate cu CTE (Figurile 12 și 13).

Dezechilibrul dintre ROS și antioxidanți duce la afecțiunea diabetică. Superoxid dismutaza (SOD), catalaza (CAT) și glutation peroxidaza (GPX) sunt cunoscuți ca antioxidanți primari responsabili pentru menținerea nivelului optim de ROS [35]. Din rezultate, s-a constatat că activitatea antioxidanților a fost semnificativ mai scăzută în grupul DM. Grupurile tratate cu CT au prezentat îmbunătățiri în producția de antioxidanți. Grupul tratat cu RSG nu a prezentat nicio îmbunătățire semnificativă a activității antioxidante (Tabelele 6 și 7).

Oxidul nitric (NO) este cunoscut ca un ROS important care contribuie la inflamație. Studiile noastre subliniază că nivelul de NO a fost scăzut în grupurile tratate cu CTE (Figura 11). Rezultatele au arătat că conținutul de anioni superoxid din spermatozoizii șobolanilor diabetici a crescut semnificativ și nu a existat nicio îmbunătățire semnificativă după administrarea de RSG. Producția de superoxid a fost redusă în grupele CTE.

Determinarea MDA este foarte utilă pentru evaluarea peroxidării lipidelor. Peroxidarea lipidelor este procesul de oxidare a lipidelor și în final are ca rezultat deteriorarea celulelor. MDA este produs ca rezultat al peroxidării lipidelor acizilor grași polinesaturați. Studiile arată că nivelul MDA este corelat cu vârsta și nivelul glicemiei a jeun [36]. Studiul actual a indicat că CTE îmbunătățește peroxidarea lipidelor în plasmă, testicul și spermatozoizi (Tabelul 8).

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

5. Concluzii

Stresul oxidativ din timpul afecțiunilor diabetice perturbă sistemul reproducător masculin prin afectarea spermatozoizilor și disfuncția gonadală. Cistanche tubulosa este o plantă de deșert larg acceptată în medicina chineză datorită efectelor sale farmacologice.Echinacozid (ECH)este principalul constituent al CTE responsabil pentru activitățile sale antioxidante și antiinflamatorii. Rezultatele noastre in vitro au indicat că ECH a restabilit calea de sinteză a testosteronului și a scăzut nivelul expresiei proteinei NF-kB și RAGE. ECH a inhibat eficient producția de anion superoxid și H2O2 în celulele Leydig. Studiile in vivo au arătat că ECH a redus nivelurile de colesterol, trigliceride, TNF- și IL-6. În plus, expresiile ARNm în hipotalamusul șobolanilor cu diabet au fost îmbunătățite semnificativ. De asemenea, este de remarcat faptul că ECH a redus peroxidarea lipidelor și a îmbunătățit rezistența la insulină la șobolanii masculi diabetici. Activitățile antioxidante au crescut atât în ​​plasmă, cât și în testicul. Prin urmare, studiile noastre au sugerat că ECH a oferit protecție eficientă împotriva disfuncției reproductive la șobolanii masculi diabetici induși de STZ.