Eficacitatea și mecanismul Cistanches Extract Herba în tratarea disfuncției reproductive la șobolani cu deficiență de yang-rinichi bazată pe metabolomici

AbstractAcest studiu investigheazăEfect protector reproductivşiMecanism potențial al Cistanches Extract Herba(Che) pe un model de șobolanDeficit de rinichi-yangindus de adenină. Șobolanii au fost împărțiți aleatoriu în cinci grupuri: normal, model, cu doză mică CHE (0. 6 G · kg -1 · d -1), Che cu doză mare (1,2 G · kg -1 · d -1) și l-carnitină (100 mg · kg -1 · d -1). Șobolanii li s -a administrat adenină (200 mg · kg -1 · d -1) de Gavage pentru primele 14 zile pentru a induce deficiență de yang de rinichi, în timp ce primind simultan tratamentul medicamentos. După 14 zile, modelarea a fost întreruptă, dar tratamentul medicamentos a continuat timp de 49 de zile. Conținutul componentelor din CHE a fost analizat prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC). Modelul de deficiență de renală indusă de adenină a fost evaluat prin caracterizarea simptomelor și măsurarea nivelurilor de testosteron (T) folosind un kit de test imunosorbent legat de enzimă (ELISA). Deteriorarea patologică a testiculelor și epididimului a fost evaluată pe baza greutății umede și efectuarea colorației hematoxilinei-eozinei (HE). Densitatea spermatozoizilor și motilitatea au fost măsurate folosind analiza spermatozoizilor asistată de computer (CASA), iar viabilitatea spermatozoizilor a fost evaluată folosind kituri de colorare a spermatozoizilor vii/morți, iar morfologia spermatozoizilor a fost evaluată folosind colorarea cu eosină, determinând astfel calitatea spermatozoizilor de șobolan. Metabolomi CS a fost utilizat pentru a analiza modificările metaboliților serici, pentru a îmbogăți căile metabolice aferente și a explora mecanismul CHE în îmbunătățirea deteriorării funcției reproductive la șobolani cuSindromul deficienței de rinichi-yang. Comparativ cu grupul normal, grupul model a prezentat semnificativSimptome de deficiență de rinichi, niveluri de T reduse, scăderea greutăților umede testiculare și epididimale și deteriorarea patologică semnificativă la testicul și epididim. Densitatea spermei, motilitatea și viabilitatea, cu o rată crescută a anomaliilor spermatozoizilor. În schimb, șobolanii tratați cu CHE au arătat îmbunătățiri marcate ale simptomelor deficienței de yang-rinichi, niveluri de T restaurate, atenuarea deteriorării patologice ale testiculelor și epididimului și au îmbunătățit diverși parametri de spermă. Rezultatele metabolomice au relevat 286 de metaboliți diferențiali între grupurile normale și model (191 au reglementat și 95 reglementat în jos). Au fost identificați șaptezeci și cinci de metaboliți diferențiali între modelul și grupurile CH cu doze mici (21 reglate și 54 reglementate în jos). Un total de 24 de metaboliți diferențiali comuni au fost identificați în cele trei grupuri, 22 dintre acești metaboliți prezentând tendințe de reglare opusă între cele două grupuri de comparație. Acești metaboliți au fost implicați în primul rând în metabolismul acidului linoleic, metabolismul lipidelor eterice și acidul pantotenic și coenzima A biosinteză, precum și metaboliți incluzând 13- acid hidroperoxilinoleic (13- hpode), lizofosfatidilcholină și pantotină. CHE poate îmbunătăți simptomele deficienței de rinichi la șobolani, poate atenua deteriorarea organelor reproductive și poate îmbunătăți calitatea spermatozoizilor. Reglarea metabolismului lipidelor poate fi un mecanism potențial prin care CHE îmbunătățește funcția reproductivă la șobolani cuDeficit de rinichi-yang. Potențialii compuși bioactivi ai CHE includ includEchinacosidă, verbascosidă, Salidroside, Betaine și Cistanoside A.

 

Cuvinte cheie Cistanches Herba Extract; Deficit de rinichi-yang; Oligasthenospermia; adenină; metabolom; Metabolismul lipidelor

 

 

Călătoria cliențilorDespre Cistanche pentru îmbunătățirea funcției reproductive

 

 

 

Sindrom de deficiență de yangeste un tip de sindrom rece de deficiență cauzat de deficiența de yang de rinichi, eșecul funcției de încălzire și eșecul transformării QI. Medicina modernă consideră că este o boală metabolică cauzată de tulburări neuroendocrine, inclusiv axa hipotalamică-hipotelui-gonadal (HPG). Pacienții de sex masculin clinic prezintă de obicei simptome precum scăderea libidoului, volumul scăzut de spermă, motilitatea spermatozoizilor scăzute și durerile de spate scăzute. Simptomele severe pot duce la infertilitate și defecte de naștere [1]. Încălzirea yang -ului de rinichi este metoda de tratament de bază a medicamentului tradițional chinezesc pentru infertilitatea masculină cauzată de deficiența de yang de rinichi [2]. Cistanche Deserticola este tulpina cărnoasă uscată, cu frunze scalnice ale plantei Cistanche Deserticola Ycma din familia Orobanchaceae. Are efectul de a tonifica yang -ul rinichilor și de a beneficia esența și sângele. Este adesea folosit pentru a trata deficiența de yang -rinichi, impotența și infertilitatea [3]. Conform statisticilor, Cistanche Deserticola este, de asemenea, cel mai frecvent utilizat medicament în rețetele de tonifiere a rinichilor și de întărire a yang-ului de-a lungul veacurilor [4]. Studiile farmacologice moderne au confirmat că extractele precum glicozidele totale și oligozaharidele din Cistanche Deserticola pot regla homeostazia axei HPG și a axei hipotalamus-hipoterogene-suprarenale la șobolani cu deficiență de yang de rinichi [5]. Extractul de cistanche deserticola poate îmbunătăți, de asemenea, spermatogeneza și disfuncția sexuală la șobolani cu deficiență de yang de rinichi [6-7]. Cu toate acestea, mecanismele potențiale ale acestor efecte terapeutice nu au fost explorate în profunzime. Metabolomica combină dinamic modificările metabolitelor cu procesele biologice într -un mod general, dezvăluind natura metabolică a proceselor fiziologice și ale bolii și mecanismele farmacodinamice ale medicamentelor. Această caracteristică holistică și dinamică este în concordanță cu conceptul de medicină tradițională chineză [8]. Prin urmare, acest studiu a utilizat tehnologia metabolomică pentru a explora eficacitatea și mecanismul extractului de deșerticola de cistansche pe deteriorarea funcției reproductive la șobolani cu deficiență de yang de rinichi cauzată de adenină și pentru a explica conotația științifică modernă a Cistanche Deserticola în tonificarea Yang.

1 Materiale

1.1 animale

50 SPF Grad 9- șobolani SD masculi în vârstă de săptămână, cântărire 330-340 G, au fost achiziționate de la Beijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd., numărul de licență Scxk (Beijing) 2019-0008. Animalele au fost păstrate în camera de animale SPF din centrul de animale experimentale al Institutului de Materia Chineză Medica, China Academia de Științe Medicale Chineze, cu iluminare circadiană naturală, umiditate și temperatură constantă și dietă și activitate gratuite. Experimentul de animale a trecut de revizuirea etică a bunăstării experimentale a animalelor din Institutul de Materia Chineză Medica, China Academia de Științe Medicale Chineze (număr de aprobare etică 2021B166).

 

1,2 medicamente

Cistiile Cistanche Deserticola au fost achiziționate de la Beijing Tongrentang (magazinul Chongwenmen), numărul de lot 1806016 și au fost identificate de Zhu Jingjing, cercetător la Institutul din China Materia Medical, China Academia de Științe Medicale Chineze, ca și Fluturașul Drept cu Fulturile de Scară din Cistance Eserticola, ca o plantă fluture sau cu Floody Fulty Frunze. Cântăriți 500 g de cistanche deserticola și adăugați
De 10 ori cantitatea de 70% etanol la extract de reflux pentru 2,5 h, filtrează, adăugați de 8 ori cantitatea de 70% etanol la reziduuri și extract de reflux timp de 2,5 h, filtrați, combinați cele două filtrate și reduceți presiunea pentru a usca extractul combinat la pulbere. Randamentul de pulbere uscat este de 47%și îl depozitați într -o stare uscată.

1,3 reactivi

Echinacoside, verbascoside, salidroside, betaine, cistancheside A, tubuloside A, and caffeic acid were purchased from Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd., with batch numbers JOT-10172, JOT-10007, JOT-10012, JOT-10165, JOT -11356, JOT11627, și JOT -10196, respectiv; Acetonitrilul de calitate cromatografică, metanolul de calitate cromatografică și acidul fosforic de calitate analitică au fost achiziționate de la Chengdu Zhongjinlong Technology Development Co., Ltd., cu numere de lot Sigma-WXBFF1922V, Sigma-WXBF2452V și, respectiv, 20240220; Adenine a fost achiziționată de la Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., cu numărul de lot S18009; L-Carnitine (LC) a fost achiziționată de la Shenyang No. 1 Pharmaceutical Co., Ltd., cu numărul de lot 210372;
Activitatea celulelor Calcein/PI și kiturile de detectare a citotoxicității au fost achiziționate de la Beijing Biolab Technology Co., Ltd., numărul lotului HR0444; Testosteronul (T) testul imunosorbent legat de enzimă (ELISA) a fost achiziționat de la Wuhan Elaruite Biotechnology Co., Ltd., numărul de lot E-El -0155 C; Apa de amoniac a fost achiziționată de la Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., numărul de lot 10002108; Soluția de colorare a hematoxilinei-eosinei (HE) a fost achiziționată de la Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd., număr de lot BSBA -4025.

 

2.2 Analiza componentelor chimice ale extractului de cistanie deserticola

2.2.1 Pregătirea soluției stoc de referință

Precis cântărește 10,41 mg de salidrosidă, 11,19 mg de echinacosidă, 10. 86 mg de cistancheside A, 10,19 mg de tubulozidă A, 10,28 mg de verbascosidă și 10,67 mg de acid cafeic în flarmele volumetrice de 25 ml.

 

2.2.2 Pregătirea soluției de referință mixtă

Pipeta precis 1 ml de soluție de referință Salidrozidă, 5 ml de echinacosidă, 2 ml de cistanchesidă A, 100 µl de tubulozidă A, 350 µl de verbascozidă și 100 µl de acid caffeic în același balon volumetric de 25 ml, adăugați apă pentru a dilua la scară, a agita bine pentru a obține o soluție de referință mixtă. Cântărește cu exactitate 12,24 mg de betaină într -un balon volumetric de 10 ml, se adaugă 50% metanol pentru a se dizolva și se dilua la marcă, se agită bine și obține soluția de referință betaină.

2.2.3 Pregătirea soluției de testare

Cântărește cu exactitate 310,14 mg din proba de testare într -un balon volumetric de 25 ml, se adaugă apă pentru a se dizolva și se dilua la marcă, se agită bine și se filtrează.

 

2.2.4 Condiții cromatografice
Metoda de detectare a betainei: coloana xamidă (4,6 mm × 250 mm, 5 μm); Faza mobilă acetonitril-apă (80:20); temperatura coloanei 30 grade; debit 1 ml · min -1; Volumul de injecție 10 µl.
Alte condiții de detectare a componentelor: Kromasil 100-5- coloana C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm); Acetonitril în fază mobilă (A)

și {{0}}. 1% soluție de acid fosforic (b); temperatura coloanei 30 grade; debit 1 ml · min -1; Volumul de injecție 10 µl, eluția gradientului (0 ~ 10 min, 10%A; 10 ~ 20 min, 10%~ 15%A; 20 ~ 25 min, 15%A; 25 ~ 40 min, 15%~ 22%A).

 

2.3 Detectarea indexului

2.3.1 Parametri dinamici dinamici ai spermei epididimale

Cavitatea abdominală de șobolan a fost disecată pentru a expune epididimul stâng. Coada epididimală stângă a fost tăiată rapid și plasată în 2 ml de cultură DMEM fără roșu fenol preîncălzit într-o baie de apă de 37 de grade. Acesta a fost tăiat în bucăți cu foarfece oftalmice, zguduit ușor și plasat într -o baie de apă de 37 de grade pentru incubare timp de 10 minute pentru a permite întregului spermă să înoate din epididim și să pregătească suspensia de spermă. 10 µl de suspensie de spermă au fost aruncate pe un diapozitiv de numărare a spermatozoizilor, iar tehnica CASA a fost utilizată pentru a observa și înregistra densitatea spermatozoizilor, viteza medie a căii (VAP), viteza de curbiline (VCL), liniaritatea (LIN), WOBBLE (WOB), dreptul (STR) și ritmul de frecvență încrucișată (BCF).

 

2.3.2 motilitatea spermei și rata de deformare

Pipetă 20 µl de suspensie spermatoză proaspăt preparată într-o iodură de propidiu pre-preparată (PI) (diluată 3 000 ori) și calcein-am (diluat de 200 de ori) soluție de colorare mixtă, se incubează într-o baie de apă de 37 de grade timp de 30 min și observă sub un microscop fluorescență. Numărați numărul total de spermatozoizi supraviețuitori și spermă de tranziție în fiecare 200 spermă în diferite domenii de vedere. Sperma vie: capul de spermă, corpul și coada sunt toate fluorescente verzi, iar activitatea spermatozoizilor poate fi văzută la microscop. Sperma de tranziție: Capul de spermă este fluorescent roșu, iar corpul este evident fluorescent verde. În acest moment, sperma se află în perioada tranzitorie a morții. Sperma moartă: Doar capul de spermă este fluorescent roșu, iar întregul corp nu are fluorescență verde.
Luați 100 µl de suspensie de spermă și așezați -o într -o baie de apă de 60 de grade pentru inactivare timp de 10 min, apoi trageți 5 µl și aruncați -o pe diapozitiv, întindeți -l uniform și uscați -l, fixați -l cu metanol, colorați -l cu colorant eosin, clătiți -l cu apă curentă, lăsați -l să stea și să -l usuce, îl face să fie transparent cu xilen și să -l sigilați cu apă neutră. Numărați numărul de spermatozoizi anormali în fiecare 200 spermă în diferite câmpuri la microscop și calculați raportul.

 

2.3.3 Colorarea patologică a epididimului și testiculelor

După fixare în 4% paraformaldehidă la temperatura camerei timp de 48 de ore, epididimii și țesuturile testiculelor au fost plasate în cutii de încorporare, deshidratate cu etanol gradat, încorporat în parafină și feliat. După depunerea și hidratarea, a fost efectuată o colorare și s -au observat modificări patologice ale testiculelor și țesuturilor epididimice la un microscop optic pentru a determina gradul de leziuni în structura tubulelor seminifere testiculare, leziuni în lumenul epididimal și densitatea spermei.

 

2.3.4 Conținut seric T

După colectarea orbitală a sângelui, a fost lăsat la temperatura camerei timp de 2,5 ore, centrifugat la 3 000 r · min -1 timp de 20 min, iar supernatantul a fost luat pentru a detecta nivelul seric T conform instrucțiunilor kitului T.

 

2.4 Analiza metabolomică

2.4.1 Pregătirea eșantionului seric

În ziua prelevării, șobolanii au fost anesteziați și sângele întreg a fost colectat prin aorta abdominală. Sângele a fost menținut la temperatura camerei timp de 2,5 ore și centrifugat la 3 000 r · min -1 pentru 2 0 min. Supernatantul a fost împărțit în 2 ml tuburi de centrifugă cu numere corespunzătoare și stocate la gradul -80. Se dezgheță la 4 grade înainte de testare, vortexul amestecă probele, transfer cu exactitate 5 0 µl de probe serice la 0,5 ml tuburi EP, adăugați 300 µl de 20% acetonitril-metanol extract intern, vortex mix, apoi centrifugă la 4 grade, 12 000 r · min {-1 12 000 r · min {-1 12 000 R Supernatant și puneți -l într -un alt tub EP curat de 0,5 ml, lăsați -l să stea la gradul -20 pentru 30 min, apoi centrifugă la 4 grade, 12 000 r · min -1 timp de 3 min, luați 180 μl de supernatant pentru injecție.

 

2.4.2 Condiții cromatografice

Waters Acquity UPLC HSS T3 C18 Coloana (2,1 mm × 1 0 0 mm, 1,8 μm). Fazele mobile au fost 0. 1% acid formic în apă (a) și 0,1% soluție de acid formic-acetonitril (b), cu eluarea gradientului (0-11 min, 5% -90% B; 11-12 min, 90% B; {17}}}. B; Temperatura coloanei a fost de 40 de grade, iar debitul a fost de 0,40 ml · min -1.

 

2.4.3 Condiții de spectrometrie de masă

Sursa de ioni electrospray a fost scanată în moduri ionice pozitive și negative. Gazul pulverizator a fost de 50 psi (1 PSI≈6.895 kPa), gazul de încălzire auxiliară a fost de 60 psi, gazul perdelei a fost de 35 psi, iar temperatura sursei ionice a fost de 550 de grade. În modul ion pozitiv, tensiunea de ionizare a fost 5 500 V, modul de sensibilitate ridicată a fost adoptat, tensiunea de declanșare a fost de 60 V, iar energia de coliziune a fost de 30 V. În modul ion negativ, tensiunea de ionizare a fost -4 500 V, tensiunea de declanșare a fost -60 V, iar energia de coliziune a fost { S-a adoptat modul de scanare a sensibilității datelor semi-cantitative.

 

2.4.4 Prelucrarea și analiza datelor

Datele brute ale detectării LC-MS au fost transformate în format MZML prin software Proteowizard, iar pachetul software XCMS a fost utilizat pentru extracția maximă, alinierea și corectarea timpului de retenție. Analiza de regresie a vectorului de asistență (SVR) a fost utilizată pentru a corecta suprafața de vârf, iar vârfurile cu rata lipsă care depășește 5 0}% au fost filtrate. Vârfurile după screening au fost integrate în biblioteca publică, baza de date construită de Wuhan Metwell Biotechnology Co., Ltd. și algoritmul MetDNA pentru a identifica informațiile structurale ale metaboliților. Ulterior, pachetul R a fost utilizat pentru a efectua o analiză statistică univariată și o analiză statistică multivariată folosind metoda testului T a studentului și, respectiv, parțială ortogonală, cel puțin pătrate, analiza discriminantă (OPLS-DA). Condițiile diferențiale de screening metabolit au fost setate la o importanță variabilă în proiecție (VIP)> 1, test pe două fețe p <0. 05, iar metaboliții diferențiali obținuți în această condiție au fost adnotați folosind enciclopedia Kyoto a genelor și genomilor (Kegg) de date compuse (http://www.kegg.jp ID -ul obținut CPD _ a fost introdus pe site -ul Metabo Analyst 6.0
(https://www.metaboanalyst.ca/) pentru analiza îmbogățirii. P a testului hipergeometric a fost utilizat pentru a identifica căile cheie cu o îmbogățire semnificativă.

 

2.5 Analiza statistică

𝑥̅ ± S a fost exprimată ca medie ± abaterea standard (𝑥̅ ± s), iar analiza unidirecțională a varianței a fost utilizată pentru a compara datele dintre mai multe grupuri. P<0.05 was considered statistically significant.