Îmbunătățirea biosintezei glicozidelor feniletanoide în culturile celulare de Cistanche Deserticola prin stres osmotic

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Chun-Zhao Liu. Xi-Yu Cheng

AbstractEfectul stresului osmotic asupra creșterii celulelor și biosintezei glicozidelor feniletanoide (PeGs) a fost investigat în culturi de suspensie celulară deCistanche deserticolaYC Ma, o plantă medicinală din deșert cultivată în regiunea de vest a Chinei. Diverse concentrații inițiale de zaharoză au afectat în mod semnificativ creșterea celulară și biosinteza PeG-urilor în culturile de suspensie, iar cea mai mare greutate uscată și acumularea de PeG-uri au atins 15,9 gl–1-DW și, respectiv, 20,7 mg g–{1-DW la osmotica inițială. stres de 300 mOsm kg–1 unde concentrația de zaharoză a fost de 175,3 mM. Analiza stoichiometrică cu diferite combinații de zaharoză și zahăr nemetabolic (manitol) sau agenți osmotici fără zahăr (PEG și NaCl) a relevat faptul că stresul osmotic în sine a fost un factor important pentru îmbunătățirea biosintezei PeG-urilor în culturile în suspensie celulară deCistanche deserticola. Conținuturile maxime de PeG de 26,9 și 23,8 mg g–1-DW au fost obținute după 21 de zile la combinațiile de 87,6 mM zaharoză cu 164,7 mM manitol (303 mOsm kg–1) sau respectiv 20 mM PEG, care a fost mai mare decât cea a culturilor de celule C. deserticola crescute sub o concentrație inițială de zaharoză de 175,3 mM după 30 de zile. Acumularea stimulată de PeG în culturile de suspensie celulară a fost corelată cu creșterea activității fenilalaninei amoniu lază (PAL) indusă de stresul osmotic.

Cuvinte cheie Cistanche deserticola, Plantă medicinală din deșert, Glicozide feniletanoide, Stres osmotic, Fenilalanină amoniac-lază

Cistanchetubulosaare multe efecte, click aici pentru a afla mai multe

Introducere

Cistanche deserticolaYC Ma, o plantă prețioasă chineză, parazitează rădăcinile Haloxylon ammodendrun și crește în zonele deșertice din vestul Chinei. Glicozidele feniletanoide (PeG), principalele componente bioactive izolate din C. deserticola, au activități marcate în captarea radicalilor liberi, creșterea imunității, îmbunătățirea funcției sexuale etc. (Zong et al. 1996; Lu 1998; Wang et al. 2001). Datorită exploatării și utilizării necontrolate aCistanche deserticola, resursa naturală aCistanche deserticola era în pragul epuizării. Având în vedere aceste probleme, producția de PeG prin culturi în suspensie celulară de C. deserticola a fost considerată o alternativă promițătoare pentru a rezolva deficitul deCistanche deserticolamateriale vegetale (Lu și Mei 2003; Ouyang și colab. 2003; Cheng și colab. 2005a).

Stresul osmotic este un factor important care afectează creșterea plantelor, dezvoltarea, morfogeneza și formarea metaboliților secundari. Producția îmbunătățită de metaboliți secundari din culturi de țesuturi in vitro sub stres osmotic optim a fost raportată la câteva specii de plante medicinale (Kim și colab. 2001; Wang și colab. 1999; Wu et al. 2005). Zaharoza este un agent de stres osmotic obișnuit utilizat în aceste cazuri și servește, de asemenea, ca o sursă vitală de carbon și energie. Prin urmare, este foarte dificil de separat efectul stresului osmotic și rolul nutrițional al zaharurilor ca surse de carbon. O creștere a stresului osmotic inițial cu manitol nemetabolic, sorbitol și PEG a îmbunătățit, de asemenea, acumularea de paclitaxel în culturile de celule Taxus Chinensis, acumularea de saponină și polizaharide în culturile de celule Panax notoginseng și acumularea de eleuterozide în culturile embriogene de Eleutherococcus Kimsiliflorus (Zhang et al.; 1995). et al. 2001; Shohael et al. 2006). Rezultatele lor au indicat că efectele concentrației de carbohidrați și ale stresului osmotic au fost diferite în funcție de speciile de plante și metaboliții secundari.

Obiectivul studiului actual este axat pe efectele osmotice ale zaharozei, manitolului, PEG și NaCl asupra creșterii celulare și biosintezei PeG înCistanche deserticolaculturi de suspensie celulară. Activitatea PAL în culturile de suspensie a fost investigată sub diferite combinații de agenți osmotici inițiali și este discutat posibilul mecanism de acumulare îmbunătățită a PeG-urilor prin creșterea stresului osmotic.

Materiale și metode

Materiale vegetale și inducția calusului

Semințele deCistanche deserticolaYC Ma au fost colectate din zonele deșertice din provincia Xinjiang din China și depozitate la 4C înainte de utilizare. Identitatea botanică a fost confirmată prin comparație cu standardele de referință de la Institutul de Botanică, Academia Chineză de Științe, PR China. Semințele au fost sterilizate la suprafață prin scufundare în etanol 70% timp de 30 de secunde, apoi scufundate într-o soluție apoasă 20% de hipoclorit de sodiu 5,4% în apă timp de 20 de minute, urmate de trei clătiri cu apă distilată sterilă. Calli au fost induși din semințele sterilizate la suprafață aleCistanche deserticolape mediu MS (Murashige și Skoog 1962) suplimentat cu 1,0 mg l–1 acid naftalenacetic (NAA), 2,0 mg l–{1 6-benzil adenină ({{7} }BA), 0,25 mg l–1 2, 4-acid diclorofenoxiacetic (2, 4-D), 6 gl–1 agar (PhytoTechnology LaboratoriesTM, ID produs: A181) și 30 gl–1 zaharoză timp de 60 de zile într-un cabinet de creștere în întuneric la 25C. Culturile de calus induse din explantele de semințe au fost ulterior subcultivate în mediul solid de mai sus la un interval de 30 de zile (Cheng și colab. 2005a).

Înființarea și întreținerea culturilor de suspensie celulară

Culturile de calus în suspensie (3,0 g greutate proaspătă) care au fost filtrate printr-o sită cu ochiuri de 1,000 lm și reținute pe o sită cu ochiuri de 200 lm au fost subcultivate într-un Erlenmeyer de 500-ml balon care conține 100 ml din mediul lichid de mai sus pe un agitator rotativ la 110 rpm la 25°C în întuneric la un interval de subcultură de 18 zile. pH-ul mediului a fost ajustat la 5,8 cu NaOH 1 M sau HCI 1 M înainte de autoclavare. Culturile de calus în suspensie subcultivate după zece ori au fost utilizate ca inocul pentru următoarea cultură experimentală în balon. Toate experimentele cu balon au fost efectuate în baloane Erlenmeyer de 250 ml care conțineau 50 ml mediu lichid cu 30 gl–1 zaharoză și s-au inoculat cu 1,5 g greutate proaspătă de culturi de suspensie celulară de 18-o zi. Aceste baloane Erlenmeyer au fost incubate pe un agitator rotativ (110 rpm) la 25C în întuneric.

Experimentul stresului osmotic

Pentru a investiga efectul concentrației inițiale de zaharoză asupracreșterea celulelor și acumularea de PeG,Cistanche deserticolaculturile în suspensie au fost cultivate în mediu MS cu 87,6,175,3 și 262,9 mM zaharoză. Pentru condiții de stres osmotic,Cistanche deserticolaculturile în suspensie au fost incubate în MSmediu conţinând 87,6 mM zaharoză combinat cu164,7 mM manitol. Alți agenți osmotici (PEG 4,000 șiNaCl) au fost adăugate în echivalentul osmolarității87,6 mM zaharoză. Concentrațiile echivalente osmoticede agenți osmotici au fost determinați experimental ca PEG4,000 de 20 mM și, respectiv, NaCI de 50 mM. Baloane triple au fost utilizate în toate experimentele și toate valorileau fost mijloacele baloanelor triplicate ± SD.

Analiză

Cistanche deserticolacelulele cultivate sub diferite stres osmotic au fost observate cu microscopul luminos Nikon AFX-DX (Nikon, Japonia) sub măriri de 400·. Osmolaritatea mediului de cultură a fost măsurată cu un osmometru cu presiune de vapori (Fiske One-Ten Osmometer, MA, SUA). Pentru determinarea greutății proaspete (FW),Cistanche deserticolacelulele au fost presate ușor pe hârtie de filtru pentru a îndepărta excesul de apă și s-au cântărit. Ulterior, celulele au fost uscate într-un cuptor la 60°C timp de 24 de ore și a fost înregistrată greutatea uscată (DW). Concentrația zahărului rezidual a fost determinată utilizând fenol și acid sulfuric concentrat, folosind glucoză ca standard (Dubois et al. 1956).

PeG-urile au fost extrase din celulele uscate cu metanol timp de 15 minute la 60C într-o baie de apă cu ultrasunete (KQ2200, Shanghai Cany Precision Instrument Co., Ltd, China) cu o frecvență de 40 kHz și o putere de 100 W. Filtratul a fost concentrat iar reziduul dizolvat în apă distilată și apoi trecut printr-o coloană de rășină macro reticulară (AB-8, produs chimic al Universității Nankai, Tianjin, China). Eluatul de metanol a fost colectat și conținutul total de PeG a fost testat la 333 nm folosind echinacozidă ca standard (Du și Liu 1993a; Du și colab. 1993b).

Viabilitatea celulară a fost estimată prin reducerea clorurii de 2, 3, 5-trifenil tetrazoliu (TTC) (Steponkus și Lanphear 1967). Indicele de viabilitate este definit ca absorbanța măsurată per gram de țesut proaspăt. Determinarea activității PAL sa bazat pe metoda lui Koukol și Conn (1961). O unitate a activității PAL (U) este definită ca cantitatea de variație a absorbanței de 0.01.

rezultate si discutii

Efectul concentrației inițiale de zaharoză asupra creșterii celulare și a biosintezei PeG în culturile în suspensie de celule deCistanche deserticola.Răspunsul luiCistanche deserticolaCulturile de suspensie celulară au fost testate la concentrația inițială de zaharoză între 87,6 și 262,9 mM. După cum se arată în Fig. 1, celulele au crescut și au acumulat PeG rapid la o concentrație inițială scăzută de zaharoză de 87,6 mm, iar creșterea celulară și acumularea de PeG au fost suprimate în mod evident la o concentrație inițială mare de zaharoză de 262,9 mM. Raportul dintre greutatea proaspătă și greutatea uscată a scăzut atunci când concentrația inițială de zaharoză a crescut de la 87,6 de la 262,9 mM (datele nu sunt prezentate). Greutatea maximă uscată de 15,9 gl–1 și conținutul de PeGs de 20,7 mg g–1-DW au fost obținute în ziua 30 la o concentrație inițială de zaharoză de 175,3 mM din care osmolaritatea a fost de aproximativ 300 mOsm kg–1. Sub observație microscopică, pereții celulari au fost separați de citoplasmă la cel mai mare stres osmotic de 388 mOsm kg–1, unde o concentrație inițială de zaharoză a fost de 262,9 mM (Fig. 2), iar cel mai mare stres osmotic ar putea perturba metabolismul celulelor și poate duce la suprimarea severă a creșterii și declinul biosintezei PeGs. Un fenomen similar a fost observat și în culturile în suspensie de culturi de celule în suspensie de T. Chinensis, iar concentrația optimă de zaharoză pentru producția de paclitaxel a fost de 175,3 mM (Kim și colab. 2001). Cu toate acestea, o concentrație inițială de zaharoză de 204,5 mM a fost benefică pentru creșterea culturilor de celule E. sessiliflorus. O concentrație mai mare de zaharoză de 262,9 mM a îmbunătățit biosinteza eleuterozidelor, fenolului și flavonoidelor în culturile de Eleutherococcus (Shohael și colab. 2006). Este clar că concentrația inițială de zaharoză este importantă pentru creșterea și acumularea metaboliților secundari ai culturilor de celule vegetale și efectul său este legat de o linie celulară specifică.

Efectul diferiților agenți osmotici asupra creșterii celulare și biosintezei PeG în culturile de suspensie celulară de C. deserticola

Pentru a înțelege rolul osmotic al zaharozei metabolice și al altor substraturi chimice nemetabolice asupra biosintezei PeG în culturile în suspensie celulară deCistanche deserticola, au fost efectuate o serie de experimente folosind zaharoză combinată cu agenți osmotici nemetabolici (manitol, PEG și NaCl). În aceste experimente, 164,7 mM manitol, 20 mM PEG și 50 mM NaCl s-au adăugat la mediul care conține 87,6 mM zaharoză și a făcut osmolaritatea inițială în jur de 300 mOsm kg–1, care a fost o stare osmotică echivalentă comparabilă cu mediul cu 175,3 mM. zaharoza.

După cum se arată în Fig. 3a, b, adăugarea de manitol (agent osmotic nemetabolic al zahărului) și PEG (agent osmotic nepermeabil) a inhibat ușor rata de creștere a celulelor, dar a îmbunătățit semnificativ biosinteza PeG-urilor înCistanche deserticolaculturi de suspensie celulară. Conținuturile maxime de PeG de 26,9 și, respectiv, 23,8 mg g–1-DW au fost obținute în ziua 21 când celulele au fost crescute în combinații de zaharoză 87,6 mM cu manitol 164,7 mM (303 mOsm kg–1) sau 20 mM PEG (299 mOsm kg–1). Cantitățile de PeG au fost mai mari decât cele aleCistanche deserticolaculturi de celule crescute în mediu lichid MS cu o concentrație inițială de zaharoză de 175,3 mM în ziua 30. Zahărul a fost consumat treptat în timpulCistanche deserticolacultura celulară, iar apoi stresul osmotic indus de zahăr a scăzut în consecință (Fig. 3c, d). Stresul osmotic al mediului lichid cu o concentrație inițială de zaharoză de 175,3 mM a scăzut de la 280 la 110 mOsm kg–1 când PeG-urile din culturile celulare au început să se acumuleze în ziua 9 și au atins maximul în ziua 30 (datele nu sunt prezentate). Agenții osmotici nemetabolici (manitol și PEG) nu au fost consumați în cursul culturii celulare, permițând menținerea stresului osmotic al mediului lichid între 200 și 280 mOsm kg–1, o presiune osmotică favorabilă pentru biosinteza PeG. Aceste rezultate au arătat că stresul osmotic în sine a jucat un rol important în îmbunătățirea biosintezei PeG înCistanche deserticolaculturi celulare.

S-a raportat că adăugarea de NaCl îmbunătățește biosinteza alcaloizilor indol și, respectiv, a saponinei în culturile celulare de Catharanthus roseus și Panax ginseng (Smith et al. 1987; Wu et al. 2005), dar tratamentul cu NaCl a suprimat creșterea celulelor T. Chinensis în timp ce nu prezintă nicio diferență în biosinteza palitaxelului (Kim et al. 2001). Prin urmare, este necesară o investigație detaliată pentru fiecare caz. Adăugarea unui echivalent osmotic de 50 mM NaCl a suprimat creșterea celulară și biosinteza PeGs. Acest rezultat s-ar putea datora naturii permeabile a NaCl, care nu este benefică pentru culturile celulare ale acestei specii de plante deșertice, care poate tolera foarte bine stresul cauzat de secetă.

Fig. 3 Efectul combinațiilor de zaharoză și alți agenți osmotici nemetabolici asupra creșterii celulare (a), acumulării de PeG (b), consumului de zahăr (c) și modificării stresului osmotic (d) în cursul celulei C. deserticola cultură. Valorile sunt medii ale baloanelor triplicate ± SD

Efectul diferiților agenți osmotici asupra viabilității celulare și activității PAL în culturile de suspensie celulară de Cistanche deserticola

În studiile noastre anterioare (Cheng et al. 2005b, 2006), adăugarea de elicitor a stimulat dramatic biosinteza PeG-urilor înCistanche deserticolaculturi de celule, iar stimularea a fost corelată cu activitatea crescută a PAL, prima enzimă cheie în biosinteza PeGs (Hahlbrock și Grisebach 1979). După cum se arată în Fig. 4, adăugarea de manitol nemetabolic 164,7 mM sau PEG 20 mM în mediu lichid MS care conține 87,6 mM zaharoză a scăzut ușor viabilitatea celulară, dar a îmbunătățit semnificativ activitatea PAL, care a fost mai mare decât cea indusă de o concentrație inițială de zaharoză de 175,3 mM. Acumularea îmbunătățită de PeG înCistanche deserticolaculturile de suspensie celulară a fost legată de creșterea activității PAL stimulată de stresul osmotic însuși. O concentrație inițială de zaharoză de 175,3 mM în mediu lichid MS a provocat o scădere a viabilității celulare în 15 zile și a inhibat activitatea PAL în 21 de zile. După o perioadă de consum de zahăr prin creștereCistanche deserticolaculturile de celule, atât viabilitatea celulară, cât și activitatea PAL a celulelor cultivate au crescut și au atins maximele în ziua 24 și, respectiv, în ziua 30. Activitatea PAL îmbunătățită prin stresul osmotic a fost, de asemenea, observată pentru a îmbunătăți biosinteza saponinei în culturile de celule P. ginseng și acumularea de alcaloizi în celulele cultivate de C. roseus (Godoy-Hernandez și colab. 2000; Wu et al. 2005). Cu toate acestea, adăugarea de NaCI permeabil în mediu lichid MS care conține zaharoză 87,6 mM a scăzut viabilitatea celulară și a inhibat activitatea PAL pe toată perioada de cultură. Ca rezultat, atât creșterea celulară, cât și biosinteza PeG-urilor au fost în mod evident suprimate.

Fig. 4 Variația viabilității celulare (a) și a activității PAL (b) în culturile de celule C. deserticola sub diferite stres osmotic în cursulCistanche deserticolacultură de celule. Valorile sunt medii ale baloanelor triplicate ± SD

Cistanche deserticolaeste o specie de deșert și investigarea unei specii de deșert culturile celulare in vitro a prezentat noi provocări și oportunități pentru înțelegerea fiziologiei plantelor și adaptărilor ecologice. În acest studiu, am dezvoltat un sistem cu potențialul de a studia o cale de biosinteză a transducției semnalului mediată de stres osmotic, iar sistemul a oferit baza pentru producția pe scară largă de PeG folosindCistanche deserticolaculturi de celule printr-o nouă strategie reglată de stres osmotic.

Mulțumiri

Autorii recunosc sprijinul financiar din partea Programului de cercetare în inovare al Academiei Chineze de Științe.

Din: „Îmbunătățirea biosintezei glicozidelor feniletanoide în culturile celulare de Cistanche deserticola prin stres osmotic” de Chun-Zhao Liu. Xi-Yu Cheng

---Plant Cell Rep (2008) 27:357–362 DOI 10.1007/s00299-007-0443-3

Referințe

Cheng XY, Wei T, Guo B, Ni W, Liu CZ (2005a)Cistanche deserticolaculturi de suspensie celulară: biosinteza glicozidelor feniletanoide și activitate antioxidantă. Process Biochem 40:3119–3124
Cheng XY, Guo B, Zhou HY, Ni W, Liu CZ (2005b) Elicitarea repetată îmbunătățește acumularea de glicozide feniletanoide în culturile de suspensie celulară deCistanche deserticola. Biochem Eng J 24:203–207
Cheng XY, Zhou HY, Cui X, Ni W, Liu CZ (2006) Îmbunătățirea biosintezei glicozidelor feniletanoide în culturile de suspensie de celule Cistanche deserticola prin elicitor de chitosan. J Biotech 121:253–260
Du NS, Liu JL (1993a) Determinarea glicozidelor feniletanoide înCistanche deserticolaprin spectrofotometrie cu rășină macro reticulară. Nat Prod Res Dev 5:30–33
Du NS, Wang H, Yi YH (1993b) Izolarea și identificarea glicozidelor feniletanoide dinCistanche deserticola. Nat Prod Res Dev 5:5–8
Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK (1956) Metode colorimetrice pentru determinarea zahărului și a substanțelor înrudite. Anal Chem 28:350–357

Godoy-Hernandez GC, Vazquez-Flota FA, Loyola-Vargas VM (2000) Expunerea la acid trans-cinamic a celulelor Catharanthus roseus stresate osmotic cultivate într-un bioreactor 14-l crește acumularea de alcaloizi. Biotechnol Lett 22:921–925
Hahlbrock K, Grisebach H (1979) Controale enzimatice în biosinteza liginei și flavonoidelor. Ann Rev Plant Physiol 30:105–130
Kim SI, Choi HK, Kim JH (2001) Efectul presiunii osmotice asupra producției de paclitaxel în culturile celulare în suspensie de Taxus Chinensis. Enzyme Microb Tech 28:202–209
Koukol J, Conn EE (1961) Metabolismul aromatic și proprietățile fenilalaninei deaminazei din Hordeum vulgare. J Biol Chem 236:2692–2698
Lu MC (1998) Studii asupra efectului sedativ alCistanche deserticola.J Ethnopharmacol 59:161–165

Lu CT, Mei XG (2003) Îmbunătățirea producției de glicozide feniletanoide de către un elicitor fungic în cultura suspensiei celulare deCistanche deserticola. Biotechnol Lett 25:1437–1439
Murashige T, Skoog F (1962) Un mediu revizuit pentru creștere rapidă și teste biologice cu culturi de țesut de tutun. Plant Physiol 15:473–497
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Yuan XF, Wang YC (2003) Efectul elementelor pământurilor rare asupra creșteriiCistanche deserticolacelulelor și producerea de glicozide feniletanoide. J Biotechnol 102:129–134
Shohael AM, Hakrabarty D, Ali MB, Yu KW, Hahn EJ, Lee HL, Paek KY (2006) Îmbunătățirea producției de eleuterozide în culturi embriogene de Eleutherococcus sessiliflorus ca răspuns la stresul osmotic indus de zaharoză. Process Biochem 41:512–518
Smith JL, Smart NJ, Kurd WGW, Misawa M (1987) Utilizarea compușilor organici și anorganici pentru a crește acumularea de alcaloizi indol în culturile de suspensie de celule Catharanthus roseus (L.) Don. J Exp Bot 38:1507–1511
Steponkus PL, Lanphear FO (1967) Rafinarea metodei clorurii de trifenil tetrazoliu de determinare a leziunii la rece. Plant Physiol 42:1423–1426Wang HQ, Wu JT, Zhong JJ (1999) Îmbunătățirea semnificativă a producției de taxani în culturile în suspensie de Taxus Chinensis prin strategia de hrănire cu zaharoză. Process Biochem 35:479–483
Wang XW, Jiang XY, Wu LY, Wang XF (2001) Efectul de eliminare al glicozidelor deCistanche deserticolaasupra radicalilor liberi și protecția acestuia împotriva deteriorarii ADN-ului induse de OH in vitro. Chin Pharm J 36:29–31
Wu JY, Wong K, Ho KP, Zhou LG (2005) Îmbunătățirea producției de saponină în cultura celulară Panax ginseng prin stres osmotic și hrănire cu nutrienți. Enzyme Microb Technol 36:133–138
Zhang YH, Zhong JJ, Yu JT (1995) Efectul presiunii osmotice asupra creșterii celulare și producției de saponină de ginseng și polizaharide în culturi în suspensie de Panax Notoginseng. Biotechnol Lett 17:1347–1350
Zong GZ, He W, Wu GL, Chen LH (1996) Comparații întreCistanche deserticolaYC Ma și Cistanche tubulosa (Scheak) Wight unele activități farmacologice. Tradit Chin Med J 21:436–438