Întunecarea pielii rezultă ca o consecință a acumulării melaninei pigmentului pielii. Pentru a combate acest lucru, amplitudinea agenților de iluminare a pielii sunt disponibili comercial, majoritatea dintre care inhibă sinteza melaninei. Decolorarea melaninei este o metodă alternativă de iluminare a pielii. În acest studiu, arătăm că lignina peroxidaza (LiP), o enzimă extracelulară purificată din Phanerochaete chrysosporium NK-1 izolată din solul forestier poate degrada și decolora eficient melanina in vitro. Condițiile de decolorare, inclusiv pH-ul, temperatura, timpul de incubare, concentrația de enzime și adăugarea de mediator au fost investigate pentru a optimiza condițiile de reacție. Rezultatele indică faptul că pH 3, 40 grade, 15 UI/ml și 10 ore de incubare au fost condițiile optime pentru decolorarea melaninei. Utilizarea mediatorului, alcoolul veratrilic, s-a dovedit, de asemenea, eficientă pentru a spori eficacitatea decolonizării melaninei, cu o decolorare de până la 92%. Rezultatele microscopiei electronice cu scanare au arătat spații goale pe granulele de melanină tratate în comparație cu proba netratată, indicând degradarea melaninei. S-au observat modificări în regiunea amprentelor digitale a melaninei. Între numerele de undă 1500–500 cm−1, de exemplu, prezența unor noi vârfuri în melanina tratată la 1513, 1464 și 1139 cm−1 CH2, îndoirea CH3 și întinderea C–O–C au reprezentat modificări structurale. Un nou vârf la 2144 cm-1 (alchinil C≡C întindere) a fost de asemenea detectat în melanina decolorată. Studiul de citotoxicitate a arătat că melanina și LiP tratate au efecte citotoxice scăzute; cu toate acestea, mediatorul alcoolului veratrilic ar putea duce la o mortalitate ridicată, ceea ce sugerează că utilizarea acestuia ar trebui testată meticulos în formularea produselor de sănătate și de îngrijire a pielii. Descoperirile studiului sugerează că LiP produs de Phanerochaete chrysosporium are potențialul de a fi utilizat în industria medicală și cosmetică, în special pentru dezvoltarea agenților de albire cosmetice pe bază de bio.

Potrivit unor studii relevante, cistanche este o plantă comună cunoscută drept „planta miracolă care prelungește viața”. Componenta sa principală este cistanozida, care are diverse efecte precum antioxidante, antiinflamatorii și promovarea funcției imunitare. Mecanismul dintre cistanche și albirea pielii constă în efectul antioxidant al glicozidelor cistanche. Melanina din pielea umană este produsă prin oxidarea tirozinei catalizată de tirozinază, iar reacția de oxidare necesită participarea oxigenului, astfel încât radicalii liberi de oxigen din organism devin un factor important care afectează producția de melanină. Cistanche conține cistanozidă, care este un antioxidant și poate reduce generarea de radicali liberi în organism, inhibând astfel producția de melanină.

Faceți clic pe Cistanches Herba pentru albire

Pentru mai multe informatii:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Melanina este un grup de pigmenți complexi, recalcitranți și pervazivi, biopolimerici ai pielii, produși de celule specializate ale pielii numite melanocite 1,2. Funcția sa principală este de a proteja pielea împotriva radiațiilor UV dăunătoare ale luminii solare prin formarea de capace supranucleare în jurul ADN-ului celulelor pielii 3. În plus, este responsabil pentru diferite culori ale pielii prin absorbția diferiților radicali liberi din citoplasmă. Majoritatea acestor agenți de iluminare a pielii obținuți din resurse naturale inhibă producția de melanină în celulele pielii prin inhibarea enzimelor tirozinazei, suprimarea biosintezei pigmentului și prin unele căi alternative. Diferiți compuși precum hidrochinona, eteri monobenzilici ai hidrochinonei, mercurul, corticosteroizii și arbutina sunt utilizați în formularea comercială pentru produsele cosmetice pentru albirea pielii, cu toate acestea, aplicațiile lor au fost asociate cu efecte secundare grave. De exemplu, mercurul este raportat că provoacă leziuni ale rinichilor, iar plumbul a fost raportat că provoacă anxietate, depresie și psihoză 4,5. Utilizarea corticosteroizilor poate provoca sindromul Cushing, diabet, hipertensiune arterială, insuficiență suprarenală, imunosupresie, subțierea pielii, acnee, dermatită și hipertricoză 6. Tain și colab. (2009) au raportat că utilizarea arbutinei în produsele cosmetice pentru albirea pielii a fost eficientă pentru concentrații de până la 3%, dar o creștere suplimentară a concentrației a provocat efecte citotoxice. Având în vedere aceste limitări, aplicațiile acestor inhibitori în produsele cosmetice pentru albirea pielii au fost criticate pe scară largă de autoritățile de sănătate și siguranță. S-a propus ca produsele cosmetice pentru albirea pielii ar putea ajunge până la 155,44 miliarde USD până în anul 2021, cu o rată anuală de creștere de 4,9%. Datorită cererii tot mai mari de agenți de albire a pielii siguri și naturali la nivel mondial, decolonizarea enzimatică a melaninei a primit un interes considerabil 7-9.

Enzimele microbiene extracelulare, cum ar fi lacaza, peroxidaza de mangan și peroxidaza de lignină (LiP) au fost testate anterior pentru decolorarea melaninei și sunt considerate ca o potențială alternativă ecologică la substanțele chimice toxice 1. Printre acestea, LiP a fost găsit foarte eficient pentru decolorare. de melanină din cauza potențialului său redox ridicat de a oxida alcoolul veratrilic (VA) decât celelalte enzime înrudite. În ciuda potențialului ridicat de oxidare și a catalizarii eficiente a melaninei, producția volumetrică și dificultățile de purificare sunt limitările majore pentru aplicațiile comerciale ale LiP în agenții de albire a pielii. În plus, LiP își pierde activitatea enzimatică pentru decolonizarea melaninei sub exces de peroxid de hidrogen, care este considerat critic pentru oxidarea melaninei. Pe lângă rolul său important, H2O2 inactivează LiP reducând astfel performanța catalitică a enzimei.

Rezultate

Decolorarea melaninei de către Phanerochaete chrysosporium NK-1.Tulpinile fungice au fost testate pentru decolorarea melaninei. Ciupercile au fost inoculate pe punct pe mediul solid care conține melanină și VA ca inductor LiP. După șapte zile de incubație, Phanerochaete chrysosporium NK-1 a arătat capacitatea de a decolora melanina, așa cum se arată în Fig. 1.

Condiții pentru decolorarea optimă a melaninei.pH. Enzima purificată a fost utilizată pentru decolorarea melaninei sintetice in vitro. Efectele diferitelor condiții asupra decolorării melaninei au fost observate 10. Efectele pH-ului asupra decolorării melaninei de către LiP au fost examinate mai întâi. Pentru aceasta, decolorarea melaninei a fost efectuată în diferite condiții de pH variind de la 2,0 la 6,0 la o temperatură de 30 de grade atât în ​​prezența cât și în absența VA pentru o perioadă de incubație de 6 ore. Rezultatele din Fig. 2 arată că, în general, decolorarea melaninei în prezența VA a fost mai mare în toate condițiile de pH. În special, este mai proeminent în condiții de pH mai ridicat. VA poate ajuta la formarea radicalilor cationici 11. Acești radicali au un potențial redox mult mai mare de a ataca legăturile C-C nespecific în melanină și duce la decolorare 12. În prezența VA, a fost atinsă cea mai mare decolorare a melaninei de 88% la pH 3 urmată de 71% la pH 2, în timp ce cea mai scăzută decolorare a melaninei de 39% a fost observată la pH 6. În absența VA, cea mai mare decolorare a melaninei de 86 procente a fost observată la pH 3, în timp ce cea mai scăzută decolorarea melaninei de 35% și 36% a fost observată la pH 5 și, respectiv, 6. Decolorarea melaninei prin LiP în acest studiu a fost foarte eficientă în condiții de pH mai scăzute, adică 2 și 3 (Fig. 2), deși alte studii au arătat o condiție optimă de pH la 4 1.

Temperatura. Decolorarea melaninei prin LiP a fost studiată la diferite temperaturi cuprinse între 20 și 60 de grade atât în ​​prezența cât și în absența VA la o perioadă de incubație de 6 ore. În absența VA, procente similare (19 la sută) de decolorare a melaninei au fost observate la temperaturi de 20 și 30 de grade (Fig. 3). Cea mai mare și cea mai scăzută decolorare a melaninei în absența VA a fost observată la 40 și, respectiv, 50 de grade. Cu toate acestea, cu VA în soluție, decolorarea melaninei a crescut de la 20 la 40 de grade și a scăzut până la 60 de grade. În prezența VA, cea mai mare decolorare a melaninei este de aproximativ 60% la 40 de grade. Decolorarea este în general mai scăzută deoarece experimentul a fost efectuat într-o condiție de pH mai blândă.

Concentrația LiP. Decolorarea melaninei a fost de asemenea examinată cu variații ale concentrațiilor de enzime. Cinci concentrații diferite, adică 5, 10, 15, 20 și 25 UI/mL de LiP au fost examinate pentru decolorarea melaninei în prezența și absența VA, așa cum se arată în Fig. 4. În mod surprinzător, cea mai eficientă concentrație de enzimă a fost 15 UI/ml pentru ambele soluții cu și fără VA. După o perioadă de incubație de 6 ore, cea mai mare decolorare a melaninei a fost de 92% în prezența VA și 70% în absența mediatorului folosind o concentrație de enzimă de 15 UI/mL, în timp ce cea mai scăzută decolorare a melaninei de 23% a fost observată în absența VA folosind 5 UI/mL de LiP. Nu este clar că decolorarea este mai puțin eficientă cu concentrații mari de enzime, adică 20 și 25 UI/ml (Fig. 4).

Timp de incubație. Experimentele de decolorare au fost efectuate la 2, 4, 6, 8 și 10 ore de incubație. Aceste reacții au fost efectuate și în prezența și absența VA. Rezultatele au arătat că eficacitatea decolorării este corelată pozitiv cu timpul de incubare, așa cum era de așteptat (Fig. 5). Creșterea gradului de delocalizare a fost mai proeminentă în incubația inițială. Cea mai mare decolorare a melaninei (68%) a fost observată după o perioadă de incubație de 10 ore în prezența VA și 59% în absența VA. Decolorarea melaninei a fost de până la 15% după 2 ore de incubare fără VA. Prin urmare, pe baza rezultatelor testului, am ajuns la concluzia că condițiile optime sunt pH 3, 40 grade, 15 UI/ml și incubare de 10 ore.

Analize SEM (microscop electronic cu scanare) și FTIR (spectroscopie în infraroșu cu transformare Fourier).Modificările morfologice și structurale ale melaninei au fost caracterizate prin SEM și, respectiv, FTIR. Melanina decolorată a fost analizată prin SEM pentru a observa orice modificări ale suprafeței din punct de vedere morfologic. Melanina sintetică fără niciun tratament enzimatic a fost utilizată ca martor. După cum se arată în Fig. 6, a existat un spațiu liber pe granulele de melanină tratate în comparație cu proba netratată, sugerând că particulele de melanină au fost atacate de enzimă.

Melanina decolorată a fost de asemenea analizată prin FTIR cu melanina netratată ca martor (Fig. 7). Amprentele moleculare ale melaninei decolorate și netratate au fost obținute și comparate pentru a confirma orice modificări structurale în melanina tratată. Vibrații de întindere –H sau de întindere N–H ale acidului carboxilic și grupărilor fenolice. Modificările în spectrul FTIR al melaninei tratate au fost vizibile. Banda largă la numerele de undă 3000–3500 cm−1 indică prezența grupărilor -NH și -OH atât în ​​probele de control, cât și în cele tratate. Cu toate acestea, intensitatea probei tratate este semnificativ mai mare decât a probei de control, ceea ce sugerează că tratamentul a avut adăugări ale acestor grupări funcționale la structură prin atacuri enzimatice. Picurile la 2884,4 cm-1 și 2822 cm-1 au indicat prezența grupărilor alchil în control, în timp ce în melanina decolorată, vârful la numărul de undă 2884,4 cm-1 a fost absent. Vârful de la 2822 cm-1 a deviat la lungimea de undă 2835,92 cm-1, ceea ce a reprezentat modificările structurale ale melaninei tratate și în această regiune. Vârful la numărul de undă 1710 cm−1 în control a fost atribuit prezenței acidului carboxilic. Acest vârf a fost, de asemenea, absent sau redus într-o mare măsură în melanina decolorată, confirmând din nou modificările structurale ale melaninei tratate. Au existat și unele modificări în regiunea amprentei. Între numerele de undă 1500–500 cm-1, de exemplu, prezența unor noi vârfuri în melanina tratată la 1513, 1464 și 1139 cm-1 a reprezentat modificări structurale. Un nou vârf la 2144 cm-1 a fost de asemenea detectat în melanina decolorată.

Efecte de citotoxicitate.Citotoxicitatea melaninei degradate și a LiP a fost investigată folosind metoda citotoxicității creveților de saramură 14,15. În studiul de față, efectele citotoxice ale melaninei și LiP tratate au fost scăzute, cu rate viabile ale larvelor de creveți mai mari sau egale cu 90% (Tabelul 1). Creșterea concentrației LiP nu a avut niciun impact asupra viabilității larvelor de creveți până la 80 ul/mL (~80 UI/ml), sugerând activitatea sa citotoxică scăzută. La controalele pozitive cu VA, rata mortalității a fost de 100 la sută, ceea ce sugerează că trebuie luată precauție în timpul aplicării LiP în prezența VA ca mediator în domeniul medical și cosmetic.

Discuţie

În cazul temperaturii, cea mai mare creștere fungică și producție de enzime a fost atinsă la 40 de grade, ceea ce corespunde habitatului natural al P. chrysosporium. Capacitatea LiP de a degrada melanina se bazează pe asemănarea structurală dintre melanină și lignina 18. Eficacitatea degradării melaninei de către LiP in vitro a fost corelată cu mai mulți factori, cum ar fi pH-ul, temperatura, concentrația de enzime și timpul de incubare, de asemenea. ca existenta VA. Un liP poate oxida VA la radicalii săi cationi (VA∙ plus) și poate servi ca un mediator redox care decolorează în continuare melanina, așa cum se arată în Fig. 8.

H2O2 este un substrat esențial ca acceptor final de electroni în timpul decolorării melaninei. LiP este ușor inactivat în concentrația lor în exces, ceea ce induce ruperea structurii hemului sau formarea compusului inactiv III. Este raportat că acest efect inhibitor poate fi diminuat prin oxidarea radicalului 1 cationic VA la VA. LiP oxidează VA la radicalii cationi VA, care acționează ca un mediator redox pentru a decolora melanina. VA este un compus natural produs din ciuperci cu putregai alb, care sunt de așteptat să aibă mai puține efecte secundare. Cu toate acestea, prezența mediatorului VA a dus la o mortalitate ridicată a organismelor testate, în comparație cu efectele citotoxice scăzute ale melaninei și LiP tratate. Ar trebui testat cu atenție în formularea produselor de sănătate și de îngrijire a pielii.

Materiale și metode

Izolarea și identificarea tulpinilor fungice.Izolarea fungică a fost făcută dintr-un loc contaminat folosit ca depozit pentru materiale lemnoase pentru o lungă perioadă de timp. Proba a fost prelevată în sticle sterile și transferată în laborator pentru purificare. Purificarea s-a făcut pe un mediu de agar dextroză de pe litoral. Patru colonii fungice diferite au fost izolate și purificate din probă. Screeningul pentru cea mai bună tulpină a fost făcut pe baza decolorării melaninei și a producției de biomasă în prezența melaninei ca singura sursă de carbon în mediul de sare minerală (MSM). Pe baza screening-ului, organismul selectat a fost identificat prin secvențierea ADN-ului ARNr 5,8S și ARNr 18S folosind primeri universali ITS-1 și ITS-4 10. ADN-ul lor genomic a fost extras conform metodei lui Anderson et al. 19. După purificare, a fost efectuată secvențierea produselor PCR. Secvențele au fost aliniate utilizând instrumentul BLAST la NCBI și omologii au fost analizați pentru filogenie utilizând Analiza genetică evolutivă moleculară (MEGA). Pe baza unei probabilități maxime, a fost construit un arbore de alăturare a vecinilor pentru identificarea tulpinii fungice izolate. Secvențele au fost transmise la NCBI GenBank cu un număr de acces KX064682.1. Analiza filogenetică a arătat că izolatul KX064682.1 a fost o tulpină de Phanerochaete chrysosporium NK-1.

Testul pe plăci pentru decolorarea melaninei.Ciuperca putregaiului alb, Phanerochaete chrysosporium NK-1, a fost folosită pentru decolorarea melaninei. Phanerochaete chrysosporium este cunoscut că produce LiP. Melanina sintetică (B049-97-6) a fost folosită ca model de melanină în toate experimentele de decolorare a melaninei. Un mediu modificat cu VA2 ca inductor LiP a fost utilizat pentru a testa capacitatea de decolorare a melaninei a ciupercii. Cutiile Petri au fost folosite pentru a cultiva Phanerochaete chrysosporium NK-1. Mediul a fost preparat prin dizolvarea a 10 g de glucoză, 2 g de extract de malț, 4 g de MgSO4·7H2O, 1 g de KH2PO4, 0.{01 g de FeSO4, 0,005 g ZnSO4, 0,2 g melanină sintetică și 15 g agar în 1-L apă distilată. Plăcile Petri inoculate au fost incubate la temperatura camerei în întuneric. S-a observat măsura în care melanina s-a decolorat sub și în jurul coloniei de ciupercă. S-a descoperit că ciuperca este capabilă să decoloreze melanina și este folosită în continuare pentru a prepara soluții enzimatice.

Prepararea enzimei pentru decolorarea melaninei.Mediul lichid al culturii conținea 10 g glucoză, 0,2 g extract de drojdie, 0.07 g VA, 3.{{13 }} g acid tartric, 1 g tween 80, 0,2 g KH2PO4, 0,146 g CaCl2·2H2O, 0,157 g de K2HPO4, 0.{05 g de MgSO4·7H2O, 42,5 mg de ZnSO4·7H2O, 7,0 mg de CoCl2·6H2O, 7,{0 mg de CuCl2·2H2O, 0,54 mg FeCl3, 0,9 mg NaCI și 0,2 mg melanină sintetică per litru de apă distilată 20. pH-ul mediului a fost ajustat la 4,0 cu soluții de NaOH și HCI. Baloane de 250 ml conţinând alicote de 100 ml mediu de cultură au fost autoclavate şi inoculate cu un inocul de 5 ml. Baloanele au fost apoi incubate pe un agitator rotativ la 30 de grade timp de 15 zile. Probele duplicat au fost colectate pentru testele activității LiP la un interval de 24 de ore.

Test enzimatic.Reactivii pentru testul LiP au inclus tampon tartrat de sodiu 250 mM pH 5,5, VA 10 mM și H2O2 4 mM (30 la sută). Testul enzimatic a fost efectuat într-o cuvă de silice, iar absorbanța a fost măsurată la 310 nm cu un spectrofotometru UV-vizibil (Shimadzu, Kyoto, Japonia). Absorbanța a fost monitorizată la timpi 0-30 s în condiții ambientale. Activitatea enzimei a fost calculată conform Legii lui Beer, Eq. (1) 21.

unde c, este concentrația speciilor de atenuare; A este absorbtivitatea optică; ε este coeficientul de atenuare molar; d este lungimea căii optice. Măsurarea activității enzimatice implică determinarea modificării concentrației în timp, Eq. (2).

Optimizare pentru producția îmbunătățită de LiP și decolorarea melaninei in vitro.Optimizarea pentru producția îmbunătățită de LiP din Phanerochaete chrysosporium NK-1 folosind melanina ca substrat a fost realizată folosind un design Placket Burman. Un Placket de lungime completă s-a bazat pe faptul că subminează efectele interactive între diferite variabile, în timp ce ia în considerare doar tendințele liniare, Ec. (3) 22.

unde Y reprezintă răspunsul și simbolurile indică coeficientul de regresie și k este numărul de factori studiați. Un total de 9 factori au fost studiați pentru a obține cea mai mare concentrație de LiP din Phanerochaete chrysosporium NK-1 pentru decolorarea melaninei prezente în mediu. Designul Placket-Burman a fost construit cu 12 cicluri experimentale totale, așa cum se arată în tabelul 2. Experimentele au fost efectuate pentru un total de 35 de zile și răspunsul a fost măsurat (activitate LiP UI/mL). Datele experimentale au fost analizate folosind software-ul statistic „Design Expert 9”. Mediul optimizat a fost utilizat pentru producția îmbunătățită de LiP și purificat prin precipitare cu amoniu.

Optimizarea producției și epurării enzimelor.A fost utilizat un mediu scufundat pentru a determina timpul optim de incubare în ceea ce privește activitățile LiP. După cum se arată în Fig. 1 Suplimentată, soluția de cultură are o activitate enzimatică maximă în a 8-a zi, fiind de 140 UI/ml. Prin urmare, a fost utilizat un timp de incubare de 8 zile pentru producerea soluției de enzimă.

Au fost efectuate un total de 12 experimente pentru a determina factorii (9) care au impact asupra activităților LiP. Printre teste, valorile de răspuns ale activității LiP variază de la 171 UI/ml la 576 UI/ml, așa cum se arată în Fig. 2 suplimentată. Execuțiile cu cea mai mare activitate LiP au fost efectuate 3 (576 UI/ml), urmate de rulare. 10 (547 UI/ml). Conform analizei de regresie, temperatura, timpul, concentrația de glucoză, concentrația de substrat și mediatorul au efecte pozitive asupra activității LiP. Efectul extractului de drojdie s-a dovedit a fi neglijabil. Alți factori au efecte negative. Condițiile optime pentru producerea LiP sunt timpul: 35 de zile, temperatura: 40 grade, glucoză (per litru): 20 g, fructoză: 10 g, extract de drojdie: 2 g, peptonă: 2 g, inocul: 10 ml, mediator de substrat: 0,1 ml. Aceste condiții au fost apoi utilizate pentru producția îmbunătățită de LiP care a fost purificată prin precipitare cu amoniu și metode de cromatografie pe gel (Sephadex G-75).

S-a efectuat extracția enzimatică la pH optimizat, temperatură și timp de incubare. Coloana de filtrare cu gel Sephadex G75 a fost utilizată pentru a separa fracțiunea conținutului de proteine ​​din lizatul celular în ceea ce privește gradientul de densitate conform instrucțiunilor producătorului. Abundența proteinelor din extractul brut a fost indicată și prin numărul de benzi care au apărut pe o analiză pe gel de dodecil poliacrilamidă de sodiu (SDS-PAGE). Greutatea moleculară a enzimei purificate a fost de 46. 0 kDa, calculată din analiza SDS-PAGE (Figura 3 completată). Activitățile enzimatice după precipitarea amoniului și purificarea prin cromatografie pe gel sunt 684,0 și, respectiv, 957,6 UI/ml.

Enzima purificată a fost utilizată pentru decolorarea melaninei în diferite condiții fizico-chimice, inclusiv pH, temperatură, timpul de incubare și concentrația enzimei. Melanina sintetică (B049-97-6) a fost utilizată ca model de melanină în toate experimentele de decolorare a melaninei conform 23.

Experimente de decolorare.Efectele pH-ului asupra decolorării melaninei. Pentru a observa efectele pH-ului asupra decolorării melaninei de către LiP, s-au efectuat reacții de decolorare a melaninei la un pH cuprins între 2.0-6.0. Amestecul de reacție a conținut 10 pl de enzimă brută dizolvată într-un tampon TE și 1990 pl de 0,02 procente g/v de melanină. Aceste reacții au fost efectuate atât în ​​prezența, cât și în absența VA. Amestecuri de reacție au fost incubate la o temperatură de 30 de grade timp de 6 ore. Experimentele de control au fost efectuate în paralel prin înlocuirea LiP activă cu enzima denaturată care a fost fiartă la 95 de grade. Amestecuri de reacție au fost monitorizate pentru decolorarea melaninei folosind un spectrofotometru la o lungime de undă de 540 nm înainte și după incubare. Eficiența de decolorare a enzimei a fost exprimată în procente ( procente ). Decolorarea melaninei a fost calculată prin Eq. (4) 11.

Efectele timpului de incubație asupra decolorării melaninei. Pentru optimizarea timpului de incubare, reacțiile de decolorare a melaninei au fost efectuate la timpi de incubație care se extind de la 2-10 h. Amestecul de reacţie a conţinut 10 pl de enzimă brută dizolvată într-un tampon şi 1990 pl de 0,02 procente g/v de melanină la pH 4 în prezenţa şi absenţa VA. Amestecuri de reacţie au fost apoi incubate la o temperatură de 30 de grade şi s-a obţinut procentul de decolorare a melaninei.

Analiza SEM a melaninei degradate. Modificările morfologice de suprafață ale melaninei au fost analizate prin microscopie electronică cu scanare (JEOL JSM-5910, Peabody, MA, SUA) 24. Melanina netratată a fost utilizată ca martor. Probele au fost uscate și fixate pe butuci de cupru (10 x 10 mm2) cu bandă de carbon cu două fețe (lipicioasă pe ambele părți). Butoanele au fost spălate cu detergent și uscate cu un uscător cu pistol termic (KADA 85U/SMD) la 200 de grade timp de 2 minute înainte de fixarea probei. Conducția pastă de argint (SPI-CHEM, West Chester, PA, SUA) a fost utilizată pentru a asigura conducția fasciculului de electroni. Aurul a fost depus pe probă cu plasmă creată în condiții de înaltă tensiune (curent de 25 mA timp de 50 s) și vid (10-2 ATM). Morfologia de suprafață a probelor a fost examinată la o putere de mărire de 3000.

Analiza FTIR a melaninei decolorate.Reacțiile sau probele care au prezentat cea mai mare decolorare a melaninei în experimentul de optimizare au fost analizate în continuare prin spectroscopie FTIR (Model nr. 56, Merlin, Germania). Probele au fost centrifugate (10,000 rpm timp de 1 min) și uscate la aer ca pas de pregătire pentru analiza FTIR 20. O analiză calitativă a probelor de melanină a fost efectuată utilizând spectrometrul UV-Vis în infraroșu apropiat (NIR). Lambda 900/Perkin Elmer Instruments. Spectrele au fost înregistrate în intervalul de la 1000 la 3500 cm-1. Probele au fost preparate în pelete de KBr cu dispersie de pulbere. Melanina sintetică netratată a fost utilizată ca martor în această analiză.

Citotoxicitatea melaninei degradate și a LiP.Au fost efectuate teste de letalitate a creveților de saramură pentru a verifica citotoxicitatea melaninei degradate 14,15. Ouăle creveților de saramură au fost clocite într-un vas dreptunghiular cu apă de mare artificială. Vasul conținea un despărțitor de plastic cu găuri mici și împărțea vasul în două compartimente inegale. Ouăle au fost pătate în compartimentul mai mare și acoperite pentru a evita orice pătrundere a luminii, în timp ce compartimentul mai mic a fost iluminat cu o lampă deasupra. Larvele eclozate au fost atrase de lumină spre compartimentul mic. După 48 de ore de incubație, nauplii maturi au fost colectați din compartimentul iluminat folosind o pipetă pasteurizată.

Analize statistice.Datele experimentale au fost analizate folosind software-ul statistic „Design Expert 9”. Imaginile grafice au fost desenate prin intermediul a trei încercări experimentale cu abaterea standard calculată. Semnificația statistică a cursei experimentale a fost calculată prin ANOVA.

Disponibilitatea datelor

Referințe

4. Clarkson, TW, Magos, L. & Myers, GJ Te toxicologia mercurului - expuneri curente și manifestări clinice. N. Engl. J. Med. 349, 1731–1737 (2003).

5. Lynde, C., Kraf, J. & Lynde, C. Tratamente topice pentru melasmă și hiperpigmentare postinflamatoare. Terapia pielii Lett. 11, 1–6 (2006).

6. Hughes, J. & Rustin, M. Corticosteroizi. Clin. Dermatol. 15, 715–721 (1997).

7. Płonka, P. & Grabacka, M. Sinteza melaninei în microorganisme: aspecte biotehnologice și medicale. Acta Biochim. Pol. 53, 423–443 (2006).

8. Lim, Y.-J. et al. Efectele inhibitoare ale arbutinei asupra biosintezei melaninei a hiperpigmentării induse de hormoni de stimulare a melanocitelor în țesuturile pielii de cobai maroniu cultivate. Arc. Rez. farmaceutică 32, 367–373 (2009).

9. Petit, L. & Pierard, G. Produse pentru iluminarea pielii revizuite. Int. J. Cosmet. Sci. 25, 169–181 (2003).

10. Rättö, M., Chatani, M., Ritschkof, A.-C. & Viikari, L. Screening of micro-organismes for decolorization of melanin produced by blue color fungi. Appl. Microbiol. Biotehnologia. 55, 210–213 (2001).

11. Nagasaki, K. și colab. Purificarea, caracterizarea și clonarea genică a Ceriporiopsis sp. tulpina MD-1 peroxidaze care decolorează melanina părului uman. Appl. Mediul. Microbiol. 74, 5106–5112 (2008).

12. Ruiz-Dueñas, FJ & Martínez, Á. T. Degradarea microbiană a ligninei: cum un polimer recalcitrant voluminos este reciclat eficient în natură și cum putem profita de acest lucru. Microb. Biotehnologia. 2, 164–177 (2009).

13. Holmes, EW & Tompson, KD (Google Patent, 2014).

14. Baravalia, Y., Vaghasiya, Y. & Chanda, S. Citotoxicitatea creveților de saramură, proprietățile antiinflamatorii și analgezice ale Woodfordia fruticosa Kurz fowers. Iranul. J. Pharm. Res.: IJPR 11, 851 (2012).

15. Milhem, MM, Al-Hiyasat, AS & Darmani, H. Testarea de toxicitate a materialelor dentare de restaurare folosind larve de creveți de saramură (Artemia salina). J. Apl. Sci. orală.

16, 297–301 (2008). 16. Falade, AO et al. Funcționalități ale ligninei peroxidazei și aplicații viitoare. Microbiologyopen 6, e00394.

17. Sung, HJ Decolorarea melaninei de către lignin peroxidază cu H2O2 generat in situ pentru aplicarea produselor cosmetice de albire (2020).

18. Pérez, J., Munoz-Dorado, J., De la Rubia, T. & Martinez, J. Biodegradarea și tratamentele biologice ale celulozei, hemicelulozei și ligninei: o prezentare generală. Int. Microbiol. 5, 53–63 (2002).

19. Anderson, MJ, Gull, K. & Denning, DW Tipare moleculară prin amplificarea aleatorie a ADN-ului polimorf și hibridizarea sudică M13 a izolatelor pereche înrudite de Aspergillus fumigatus. J. Clin. Microbiol. 34, 87–93 (1996).

20. Sabar, MA şi colab. Degradarea cărbunelui de rang scăzut de către Rhizopus oryzae izolat dintr-o mină de cărbune din Pakistan și eliberarea sporită a substanțelor organice. Combustibil 253, 257–265 (2019).

21. Yadav, M., Singh, S. și Yadava, S. Activitatea de purificare, caracterizare și depolimerizare a cărbunelui a peroxidazei ligninei din Lenzitus betulina MTCC-1183. Appl. Biochim. Microbiol. 48, 583–589 (2012).

22. Mohan, S., Viruthagiri, T. & Arunkumar, C. Aplicarea designului Plackett-Burman pentru screening-ul componentelor media pentru producția de tanază din coaja programului folosind fermentația scufundată. Int. J. Pharm. Res. Apoc. 2, 24–29 (2013).

23. Woo, SH, Cho, JS, Lee, BS & Kim, EK Decolorarea melaninei de către lignina peroxidază din Phanerochaete chrysosporium. Biotehnologia. Bioproces. ing. 9, 256 (2004).

24. Karp, JM şi colab. Cultivarea celulelor stem embrionare umane fără pasul corpului embrionar îmbunătățește osteogeneza in vitro. Stem Cells 24, 835–843 (2006).

Confirmare

Contribuții ale autorului

Interese concurente

Al editoruluiNotăSpringer Nature rămâne neutră în ceea ce privește revendicările jurisdicționale în hărțile publicate și afilierile instituționale.

Pentru mai multe informații: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501