Evaluarea expunerii la azot de amoniac în apărările imune prezente pe splină și pe rinichi de cap la dorada Wuchang (Megalobrama Amblycephala)
Nov 13, 2023
Abstract:Amoniacul este unul dintre cei mai importanți factori de mediu în ecosistemele acvatice. Cu toate acestea, există studii limitate privind efectele stresului cronic sau pe termen lung ale amoniacului și mecanismul său molecular potențial la pești. Acest studiu și-a propus să investigheze răspunsul imun și mecanismele moleculare în splina și rinichiul capului peștilor după expunerea cronică la amoniac.Megalobrama amblycephala(9.98 ± {{0}},48 g) a fost expus la diferite concentrații de azot total de amoniac (0–30 mg/L) timp de 30 de zile. Expunerea la amoniac a determinat creșteri semnificative ale nivelurilor de cortizol și scăderi ale concentrațiilor de lizozim și complement 3/4 în ser, indicând efectele inhibitoare ale stresului amoniacului asupra răspunsurilor imune înnăscute. Expunerea la amoniac a indus, de asemenea, creșteri dependente de concentrație ale concentrațiilor de amoniac în țesuturi, leziuni patologice și indici ai splinei și capului-rinichi. În plus, conținutul de imunoglobuline M (IgM), interleukina 1 (IL-1 ) și factorul de necroză tumorală (TNF- ), precum și nivelurile de ARNm ale receptorilor de tip toll (TLR)/moleculele de semnalizare independente de factor de diferențiere mieloid 88 (MyD88) din splină și din cap-rinichi au fost reduse semnificativ după expunerea la amoniac. Descoperirile noastre au sugerat că expunerea cronică la amoniac a provocat suprimarea răspunsurilor imune înnăscute și adaptative prin reglarea în jos a semnalizării independente TLR/MyD88-. Influențele adverse ale stresului cronic de amoniac au fost mai severe la nivelul splinei decât la rinichiul capului.
Cuvinte cheie: amoniac; stres; receptori de tip toll; splină; cap-rinichi; imunitate
CLICK AICI PENTRU A OBȚI CISTANCHE PE RINCHI
1. Introducere
Ammonia is one of the most important environmental factors in aquatic ecosystems that affect the growth and health of aquatic animals [1]. Ammonia nitrogen generally comes in one of two ionized forms—NH4 + and the un-ionized form, NH3, in the aquatic environment. NH3 is extremely toxic to fish by reason of its ability to diffuse across cell membranes easily [2–4]. Over the past decades, high levels of ammonia frequently occur in aquatic environments due to disorderly discharges of sewage effluent, agricultural run-off, and high-density aquaculture [5–7]. Although the recommended level of ammonia nitrogen in drinking water is up to 3 mg/L (NH4/L) [8], the real ammonia level can reach much higher (>20 mg/L) uneori, din cauza epurării apelor uzate ineficiente sau inexistente sau din alte motive [9,10].
S-a dovedit că efectele imunosupresoare ale amoniacului în pești contribuie la apariția focarelor de boală [11,12]. În unele studii pe Takifugu rubripes, Scophthalmus maximus și Pelteobagrus fulvidraco, expunerea acută la amoniac ar putea regla în creștere nivelurile de expresie genetică ale factorului de activare a celulelor B, proteinei de șoc termic 70/90, tnf- și interleukină- 1/1 /6/ 8/12 [13–15]. Wang şi colab. a raportat, de asemenea, că activitățile lizozimelor serice au scăzut semnificativ în Acanthopagrus schlegelii după 24 de ore de expunere la amoniac [16]. În mod similar, s-au observat niveluri scăzute de ARNm de complement C3 și IgM în splina Pelteobagrus vachellii și Rhynchocypris lagowski sub expunere acută la amoniac [17,18]. Deși s-a acordat multă atenție efectelor expunerii acute la amoniac asupra imunității peștilor, există doar studii limitate privind efectele stresului cronic sau pe termen lung ale amoniacului și mecanismul său molecular potențial. În plus, unii cercetători au raportat efecte adverse ale azotului amoniac asupra expresiei ARNm a TLR-urilor prin analiza transcripțională [16,19-22]. În consecință, emitem ipoteza că expunerea persistentă la amoniac ar putea afecta și imunitatea peștilor, în care calea de semnalizare TLR ar putea juca un rol important.
Splina și rinichiul capului sunt organele imune majore la peștii teleostei, care sunt responsabili pentru captarea și curățarea particulelor străine și menținerea unui mediu intern stabil [23,24]. Ele sunt, de asemenea, principalele locuri în care sunt produși anticorpi imuni [25–27]. În plus, la pești, sistemul imunitar înnăscut constă din celule fixe și mobile, precum și dintr-o gamă largă de molecule de apărare (cum ar fi lizozima, complementul și citokinele) [28,29]. Dorada Wuchang (Megalobrama amblycephala) este un pește ciprinid originar din bazinul Yangtze din China, care s-a clasat pe locul 11 în lume în ceea ce privește producția totală anuală a acestui pește în 2014 [30]. Ca principală specie de acvacultură, M. amblycephala este o specie relativ sensibilă la azotul amoniac și suferă adesea de stres indus de azotul amoniac [31–33]. Având în vedere cele de mai sus, a fost efectuat un experiment de expunere cronică în dorada Wuchang pentru a elucida caracteristicile răspunsurilor imune după expunerea cronică la amoniac și mecanismul din spatele acestor efecte prin detectarea modificărilor parametrilor imunitari serici, histologiei și moleculelor legate de calea TLR. în splină și cap-rinichi. Rezultatele noastre sunt, de asemenea, favorabile monitorizării stării de sănătate și bunăstării M. amblycephala în sistemele de acvacultură intensivă.
2. Rezultate
2.1. Conținutul de amoniac în splină și cap-rinichi
Figura 1 arată conținutul de amoniac în splina și rinichiul capului la M. amblycephala după 30 zile de expunere la diferite niveluri de amoniac. O creștere semnificativă a nivelului de amoniac a fost observată în splina peștilor expuși la 30 mg/L de azot amoniac total în comparație cu grupul martor (p < 0,05). Nu a existat nicio diferență statistică în nivelurile de amoniac în rinichiul capului între toate grupurile de tratament cu amoniac și grupul de control (p > 0,05).
Figura 1. Efectele expunerii cronice la amoniac asupra acumulării de amoniac în splina și rinichiul capului M. amblycephala. Fiecare coloană reprezintă media ± SE a șase duplicate. Valorile lui p < 0,05 sunt reprezentate ca „*” deasupra coloanei, indicând diferențe semnificative față de control, respectiv.
2.2. Cortizolul seric, lizozima, nivelurile C3 și C4
După cum se arată în Figura 2, nivelurile de cortizol seric au crescut semnificativ în toate grupurile de tratament cu amoniac în comparație cu grupul de control (p < 0.05). Dimpotrivă, activitățile lizozimelor serice au fost semnificativ scăzute la peștii expuși la concentrații mai mari de amoniac (20 și 30 mg/L azot amoniac total) (p < 0,05). Nivelurile complementului C3 și C4 din ser au fost reduse semnificativ la grupurile tratate cu 10 până la 30 mg/L de azot amoniac total (p < 0,01).
Figura 2. Efectele expunerii cronice la amoniac asupra nivelurilor de cortizol seric, lizozim, C3 și C4(AD) la M. amblycephala. Fiecare coloană reprezintă media + SE a șase duplicate. Valorile lui p < 0.05 și 0.0l sunt reprezentate ca „” și „” deasupra coloanei, indicând diferențe semnificative față de control, respectiv.
2.3. Indicii de organe imunitare
Atât indicii splinei, cât și ai capului-rinichiului au crescut odată cu creșterea concentrațiilor totale de azot amoniac după expunere (Figura 3). În comparație cu grupul de control, indicele splinei a fost semnificativ crescut la peștii tratați cu azot amoniac total mai mare (20 și 30 mg/L) (p < 0,05). Nu a fost detectată nicio diferență semnificativă în indicele cap-rinichi între toate grupurile de tratament cu amoniac și grupul de control (p > 0,05).
Figura 3. Efectele expunerii cronice la amoniac asupra splinei (A) și indicilor cap-rinichi (B) la Mamblycephala. Valorile sunt exprimate ca min la maxim (n=18). Valorile lui p < 0.05 și 0,01 sunt reprezentate ca „” și „u” deasupra coloanei, indicând diferențe semnificative față de control, respectiv.
2.4. Evaluare patologică
Splina de dorata Wuchang din grupul de control a prezentat un aspect normal cu eritrocite și leucocite abundente (Figura 4A). După expunerea la amoniac timp de 30 de zile, s-au observat creșteri ușoare ale numărului de eritrocite împreună cu apariția centrilor melano-macrofagi în splina peștilor expuși la 5 mg/L de azot amoniac total (Figura 4B, Tabelul 1). Modificări similare, dar mai grave, au fost observate la peștii tratați cu 10 până la 30 mg/L de azot amoniac total, cum ar fi creșterea numărului și mărimii centrelor de melanom-macrofage, precum și a numărului de eritrocite semnificativ crescut (Figura 4C, D). În plus, vacuolizarea citoplasmei a fost detectată și în splina peștilor expuși la 30 mg/L de azot amoniac total (Figura 4E, Tabelul 1).
În ceea ce privește capul-rinichi, Figura 5A prezintă o structură normală a țesutului cap-rinichi la peștii de control după expunere. Nu a fost observat niciun semn patologic evident în rinichiul capului peștilor expuși la azot amoniac total mai scăzut (5 mg/L) (Figura 5B, Tabelul 1). Au fost observate creșteri ușoare ale numărului de centre de melanom-macrofage la peștii expuși la 10 și 20 mg/L de azot amoniac total (Figura 5C, D, Tabelul 1). Dimensiunea și numărul de centre de melanom-macrofage au fost îmbunătățite în grupul de azot total de 30 mg/L amoniac (Figura 5E, Tabelul 1).
2.5. Analiza parametrilor imunitari tisulare
Nivelurile parametrilor imuni înnăscuți (TNF-, IL-1) și ale parametrilor imuni dobândiți (IgM) în splină și rinichiul capului au scăzut odată cu creșterea nivelurilor de expunere la amoniac (Figura 6, Tabelul suplimentar S1). În splină, conținutul și nivelurile de ARNm de TNF- și IgM au fost semnificativ scăzute în toate grupurile de tratament cu amoniac în comparație cu martorii (p <0.{{10}}5). Între timp, conținutul de IL-1 splenic și nivelurile de expresie a ARNm au fost reduse semnificativ la peștii expuși la mai mult de 20 mg/L de azot amoniac total (p < 0,05). Prin contrast, numai conținutul și nivelul ARNm de IL-1, precum și nivelul de expresie al tnf- în cap-rinichi au fost semnificativ reduse în grupurile de tratament cu amoniac în comparație cu martorii (p < 0,05). Nu au existat diferențe semnificative în nivelurile de proteină IgM și expresia genelor, precum și concentrația de TNF în rinichiul capului între grupurile tratate cu amoniac și grupul de control (p > 0,05).
Figura 6. Nivelurile relative de ARNm ale genelor căii de semnalizare TLR, precum și conținutul de TNF-, IL- 1 și IgM în splină și rinichi cap al M. amblycephala. Valori exprimate ca medii ± SE a șase duplicate. igm: imunoglobulina M, il-1: interleukina 1, tnf-: factor de necroză tumorală, jnk1: c-Jun N kinaza terminală1, erk1: protein kinaza reglată extracelular 1, p38: protein kinaza activată cu mitogen p38, nf-kb1 /2: factorul nuclear de legare a genei κ 1/2, pi3 k: fosfatidilinozitol 3-kinaza, akt: protein kinaza B, myd88: factorul de diferențiere mieloid 88, traf6: factorul 6 asociat receptorului factorului de necroză tumorală, tlr1 /2/3/4/5: receptor de tip toll 1/2/3/4/5. Valorile lui p < 0.05 și 0,01 sunt reprezentate ca „*” și „**” deasupra coloanei, indicând diferențe semnificative față de control, respectiv
Pentru a elucida mecanismul molecular al toxicității cronice a amoniacului asupra sistemului imunitar, au fost determinate modificări transcripționale ale genelor cheie implicate în calea de semnalizare TLR împreună cu nivelurile de TNF-, IL-1 și IgM. În splină, nivelurile de ARNm ale genelor receptorului de tip toll (tlr2, tlr4), genei asociate căii independente MyD88-traf6, genei asociate căii de semnalizare NF-κB nf-κb2 și genei asociate căii de semnalizare MAPK erk1 au scăzut semnificativ -reglată în grupurile de tratament cu amoniac comparativ cu martor (p < 0.05), în timp ce nu au existat modificări remarcabile în expresia tlr1, tlr3, tlr5, pi3 k, akt, myd88 , nf-κb1, jnk1 și p38 a (p > 0.05). În mod similar, nivelurile de transcripție ale tlr1, tlr2, tlr5, akt, traf6, nf-κb1, erk1 și jnk1 au fost semnificativ roșii, fără diferențe semnificative în exprimarea tlr3, tlr4, myd88, pi3 k, nf-κb2 și p38 în rinichiul capului între loturile tratate cu amoniac și grupul martor (p > 0,05).
2.6. Analiza corelației
După cum se arată în Figura 7 și Tabelul suplimentar S2, concentrația de expunere la amoniac a fost semnificativ corelată negativ cu conținutul de TNF-, IL-1 și IgM, precum și cu nivelurile transcripționale de tnf-, il{-1, igm, tlr2, traf6, nf-кb2 și jnk1 în splină. Între timp, conținutul și nivelurile de transcripție ale TNF-, IL-1 și IgM splenic au prezentat corelații pozitive semnificative între ele (p <{13}}.05). Concentrația de IgM splenic a arătat o corelație pozitivă semnificativă cu tlr2 și nf-кb2, iar TNF- precum și IL-1 au prezentat corelații pozitive semnificative cu tlr2, traf6 și nf-кb2 (p <0.{{. 53}}5). Cu toate acestea, în rinichiul capului, nivelurile de expunere la amoniac au fost corelate negativ doar în mod remarcabil cu conținutul de IL-1 și expresia genelor tnf- , il-1 , tlr1/2/4/5, traf6, akt, nf-кb1, jnk1 și erk1 (p < 0,05). IL-1 de la cap-renichi a fost corelat pozitiv cu IgM, igm, il-1 , tlr4, myd88, traf6, akt, nf-кb1, erk1 și jnk1, în timp ce IgM și TNF- au prezentat o corelație pozitivă cu p38 a și, respectiv, tlr2 (p < 0,05).
Figura 7. Coeficienții de corelație Spearman® între concentrația de expunere la amoniac și parametrii imunitari implicați cu calea de semnalizare TLR în splină și cap-rinichi la M. amblycephala după expunerea cronică la amoniac. Valorile lui p < 0.05 și 0,01 sunt reprezentate ca „*” și „**” deasupra coloanei, indicând diferențe semnificative față de control, respectiv
2.7. Indicii IBR
Valorile IBR au fost calculate din datele standardizate a 22 de biomarkeri din splină și din cap-rinichi în dorada Wuchang sub diferite niveluri de amoniac ambiental după expunere de 30-zi (Tabelul 2, Figura 8). Pe măsură ce concentrațiile de expunere la amoniac au crescut, valorile IBR au avut tendința de a crește atât în splină, cât și în rinichiul capului. Valorile IBR au fost mai mari la nivelul splinei
Serviciul de asistență al Wecistanche-Cel mai mare exportator de cistanche din China:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Cumpărați pentru mai multe detalii despre specificații:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
